使用光合微生物有機(jī)體來制備乙偶姻和2,3-丁二醇的方法
【專利說明】使用光合微生物有機(jī)體來制備乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方 法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月28日提交的美國臨時申請No. 61/707, 866的優(yōu)先權(quán)，對 于所有目的而言，該申請的內(nèi)容以引用方式全文并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明公開提供了具有乙酰乳酸合成酶活性和乙酰乳酸脫羧酶活性的重組藍(lán)細(xì) 菌，以及具有乙酰乳酸合成酶活性、乙酰乳酸脫羧酶活性和仲醇脫氫酶活性的重組藍(lán)細(xì) 菌。此外，還提供了重組藍(lán)細(xì)菌的制備方法，以及該藍(lán)細(xì)菌由二氧化碳和光制備乙偶姻和 2, 3-丁二醇的用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 在全世界能量需求增長的情況下，人們對由可再生資源制備燃料和化學(xué)品越來越 關(guān)注。2008年，美國的石油消耗達(dá)到3. 71xl015BTU，其中大部分（71% )為運(yùn)輸行業(yè)的液 體燃料。在化學(xué)工業(yè)中，石油和天然氣占據(jù)化學(xué)品（例如塑料、化肥和藥物）原料的99% (McFarlane et al. , "Survey of Alternative Feedstocks for Commodity Chemical Manufacturing, "0ak Ridge National Laboratory, 2007)?？紤]到快速增長的世界人口和 耗盡的化石燃料，用于能量和碳捕獲（ECC)(以便制備燃料和化學(xué)品）的可持續(xù)工藝的發(fā)展 對于人類社會而言是重要的。
[0005] 除了能量需求增加以外，可再生的能量資源因解決了越來越多的環(huán)境問題 而受到關(guān)注。根據(jù)美國能源信息管理局（the United States Energy Information Administration) (Serferlein, "Annual Energy Review, USEIA2008)，在 2006 年世界上能 量相關(guān)的CO2排放為290億公噸，比1990年增長35%。大氣CO2的加速積累不僅是由于世 界生長和碳利用增強(qiáng)而產(chǎn)生的排放增加，而且還由于世界天然碳匯的效率的可能降低所導(dǎo) 致（Raupach et al·，Proc Natl Acad Sci USA, 104:10288-10293, 2007)。結(jié)果，在過去 150 年，CO2的大氣水平增加了~25%。因此，研發(fā)新技術(shù)來減少CO 2排放變得越來越重要。
[0006] 制備可再生能量的現(xiàn)有方法涉及將陸生植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物化學(xué)品。但 是，這些方法呈現(xiàn)出不理想的困難，例如生物質(zhì)的粗糙化學(xué)品預(yù)處理得到有毒的副產(chǎn) 物并且需要大的土地利用使植物生長。關(guān)于生物化學(xué)品的制備，光合微生物有機(jī)體 具有超過傳統(tǒng)陸生植物的許多優(yōu)點。例如光合微生物有機(jī)體的光合效率比植物更 高，并且光合微生物有機(jī)體可以在不與傳統(tǒng)農(nóng)作物競爭的場所培養(yǎng)（Scharlemann et al.，Science, 281:237-240, 2008)。
[0007] 具有制備生物化學(xué)品潛力的光合微生物有機(jī)體的實例為藍(lán)細(xì)菌。藍(lán)細(xì)菌總體上 是產(chǎn)生全球光合作用的幾乎50%的原因，并且可以在廣泛的環(huán)境范圍中發(fā)現(xiàn)（Field et al.，Science，281:237-240, 1998)。盡管就這一點而言藍(lán)細(xì)菌具有許多與藻類相似的特 征，但是許多藍(lán)細(xì)菌物種的特征為更簡單的遺傳結(jié)構(gòu)和更快的生長速率（Ruffing, Bioeng Bugs, 2:136-149, 2011)。結(jié)果，藍(lán)細(xì)菌的遺傳改造方法在遺傳操縱嘗試方面還比藻類更先 進(jìn)（Golden et al. , Methods Enzymol, 153:215-231, 1987 ；Huang et al. , Nucleic Acids Res, 38:2577-2593, 2010;以及 Heidorn et al·, Methods Enzymol, 497:539-579, 2011) 〇
[0008] 藍(lán)細(xì)菌具有固定CO2所需的生物化學(xué)機(jī)器，但是缺乏高效地制備燃料和化 學(xué)品的重要成分。因此，為了制備有價值的化學(xué)品，藍(lán)細(xì)菌宿主菌株必須裝配有新 的生物合成途徑（Keasling, ACS Chem Biol, 3:64_76,2008 ;Ducat et al·，Trends Biotechnol,29:95-103,2011 ;以及 Machado and Atsumi, J Biotechnol, 2012)。不 幸的是，藍(lán)細(xì)菌中的這種方法比模式有機(jī)體（例如Escherichia coli)明顯是更不 先進(jìn)的。此外，在E. coli中的結(jié)果不能直接轉(zhuǎn)化至藍(lán)細(xì)菌中。例如包含1-丁醇途 徑的改造的E. coli菌株制備了超過30g/L的1- 丁醇（Shen et al.，Appl Environ Microbiol，77:2905-2915, 2011)，而具有相同途徑的藍(lán)細(xì)菌菌株僅制備痕量的1- 丁醇 (Lan et al·，Metab Eng, 13:353-363, 2011)。因此，需要在藍(lán)細(xì)菌中構(gòu)造生物合成途徑，從 而由CO2大量地制備大宗化學(xué)品。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明公開提供了具有乙酰乳酸合成酶活性和乙酰乳酸脫羧酶活性的重組藍(lán)細(xì) 菌，以及具有乙酰乳酸合成酶活性、乙酰乳酸脫羧酶活性和仲醇脫氫酶活性的重組藍(lán)細(xì) 菌。此外，還提供了重組藍(lán)細(xì)菌的制備方法，以及該藍(lán)細(xì)菌由二氧化碳和光制備乙偶姻和 2, 3-丁二醇的用途。
[0011] 本發(fā)明公開提供了包含重組（例如異源的）多核苷酸的藍(lán)細(xì)菌，其中所述的多核 苷酸編碼了乙酰乳酸合成酶（ALS)和乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)，其中與缺乏所述的多核苷酸 的相應(yīng)的藍(lán)細(xì)菌相比，ALS和ALDC的表達(dá)使得乙偶姻的制備增加。本發(fā)明公開進(jìn)一步提 供了包含重組（例如異源的）多核苷酸的藍(lán)細(xì)菌，其中所述的多核苷酸編碼了乙酰乳酸合 成酶（ALS)、乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)和仲醇脫氫酶（sADH)，其中與缺乏所述的多核苷酸的 相應(yīng)的藍(lán)細(xì)菌相比，ALS、ALDC和sADH的表達(dá)使得乙偶姻和/或2, 3- 丁二醇（23BD)的制 備增加。在一些實施方案中，相應(yīng)的藍(lán)細(xì)菌為對照藍(lán)細(xì)菌，例如親代藍(lán)細(xì)菌或同屬的細(xì)胞， 或者相同的物種。在一些實施方案中，ALS為細(xì)菌ALS。在一些優(yōu)選的是實施方案中，ALS 為芽孢桿菌屬菌株的ALS(例如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)ALS)。在一些實施方 案中，ALDC為細(xì)菌ALDC或真菌ALDC。在一些優(yōu)選的實施方案中，ALDC選自腸桿菌屬菌種 的ALDC、芽孢桿菌屬菌種的ALDC、氣單胞菌屬菌種的ALDC和葡糖醋桿菌屬菌種的ALDC。 在這些實施方案的子集中，ALDC選自產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogene)ALDC,陰溝 腸桿菌（Enterobacter cloacae)ALDC,地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)ALDC, 枯草芽孢桿菌ALDC,嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)ALDC,和木葡糖酸醋桿菌 (Gluconacetobacter xylinus)ALDC。在一些實施方案中，sADH 為細(xì)菌 sADH 或真菌 sADH〇 在一些實施方案中，sADH選自子囊菌sADH、硬壁菌門sADH、和酵母菌sADH。在一些優(yōu)選的 實施方案中，sADH選自假絲酵母屬菌種sADH，明串珠菌屬菌種sADH，梭菌屬菌種sADH，和 高溫厭氧桿菌屬菌種sADH。在這些實施方案的子集中，sADH選自近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis) sADH,假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides) sADH,拜氏梭 菌（Clostridium beijerinckii)sADH，和布氏熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacter brockii) sADH。在一些實施方案中，ALS和ALDC的表達(dá)、或者ALS、ALDC和sADH的表達(dá)是由誘導(dǎo)型啟 動子驅(qū)動的。在一些實施方案中，ALS和ALDC的表達(dá)、或者ALS、ALDC和sADH的表達(dá)是由構(gòu) 成型啟動子驅(qū)動的。在一些實施方案中，多核苷酸穩(wěn)定地整合至藍(lán)細(xì)菌的基因組中。在一 些實施方案中，多核苷酸暫時保持（例如作為質(zhì)粒）在藍(lán)細(xì)菌中。在一些實施方案中，藍(lán)細(xì) 菌為選自藍(lán)球藻目和念珠藻目的目。在一些優(yōu)選的實施方案中，藍(lán)細(xì)菌選自念珠藻屬物種， 聚球藻屬物種，集胞藻屬物種，和嗜熱聚球藻屬物種。在這些實施方案的子集中，藍(lán)細(xì)菌選 自點形念珠藻（Nostoc punctiforme)ACCS 074，細(xì)長聚球藻（Synechococcus elongatus) PCC 7942，聚球藻屬 WH 8102，集胞藻屬 PCC 6803 和 ThermoSynechococcus elongatus BP-I。在一些實施方案中，在持續(xù)光照下培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌的結(jié)果是發(fā)生乙偶姻和/或2, 3-丁二 醇（23BD)的制備。在一些實施方案中，在重碳酸鹽下培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌的結(jié)果是發(fā)生乙偶姻和/ 或2, 3-丁二醇（23BD)的制備。在一些實施方案中，其中ALDC基本上對氧氣（不可檢測的 或低氧氣敏感性）不敏感。在一些實施方案中，sADH基本上對氧氣（不可檢測的或低氧氣 敏感性）不敏感并且是NADPH依賴的。
[0012] 此外，本發(fā)明公開提供了制備乙偶姻的方法，其包含：提供藍(lán)細(xì)菌；以及在包含CO2 和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌，由此ALS和ALDC的表達(dá)導(dǎo)致乙偶姻的制備。在一些實 施方案中，乙偶姻的制備水平比在相同的條件下通過培養(yǎng)缺乏所述的多核苷酸的相應(yīng)的藍(lán) 細(xì)菌（例如對照）而制備的乙偶姻水平更高。本發(fā)明公開進(jìn)一步提供了制備2, 3-丁二醇 的方法，其包含：提供藍(lán)細(xì)菌；以及在包含CO2和光照的光合環(huán)境下培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌，由此ALS、 ALDC和sADH的表達(dá)導(dǎo)致2, 3- 丁二醇（23BD)的制備。在一些實施方案中，23BD的制備水 平比在相同的條件下通過培養(yǎng)缺乏所述的多核苷酸的相應(yīng)的藍(lán)細(xì)菌（例如對照）而制備的 23BD水平更高。除非在本發(fā)明公開的說明書中提供，否則通過使用這些方法而制備乙偶姻 和/或23BD的藍(lán)細(xì)菌為之前段落中所述的藍(lán)細(xì)菌或重組藍(lán)細(xì)菌。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖1示出了在乙偶姻和2, 3-丁二醇、以及工業(yè)上重要的化學(xué)品的生物合成中可以 如何使用C02。ALS :乙酰乳酸合成酶，ALDC :乙酰乳酸脫羧酶，sADH :仲醇脫氫酶。
[0015] 圖2示出了各種濃度的乙偶姻和2, 3- 丁二醇如何影響細(xì)長聚球藻的生長速率。
[0016] 圖3A提供了重組的示意圖，其將alsS和alsD基因整合至細(xì)長聚球藻的染色體 中。圖3B示出了生長16h (黑暗）和40h (光照）的改性E.coli細(xì)胞中乙偶姻的制備。圖 3C示出了在生長72h的改性細(xì)長聚球藻細(xì)胞中乙偶姻的制備。alsS顯示包含（+)alsS(B. s.)或缺乏（-)該基因。alsD顯示alsD基因的來源有機(jī)體（表1)。圖3D示出了 IPTG(ImM) 對細(xì)長聚球藻中乙偶姻制備的影響，其中所述的細(xì)長聚球藻包含處于Puac^1之下的alsS (B. S.)和 alsD (E. a.)。誤差條顯示 s. d. (η = 3)。
[0017] 圖4Α提供了重組的示意圖，其將alsS，alsD，和adh基因整合至細(xì)長聚球藻的染 色體中。圖4B示出了生長40小時的改性E.coli細(xì)胞中乙偶姻的制備。淺色柱顯示乙偶 姻，而深色柱顯示丁二醇（中間柱：1^8〇-2380，右側(cè)柱：〇?，1?)-2380)。 &185顯示包含（+) alsS (B.s.)。alsD和adh-排顯示所述基因的來源有機(jī)體（表1)?；钚詾樵贓.coli中 表達(dá)的sADH的活性，并且在細(xì)胞提取物中測量（nmol NADPH 。圖4C示出了生長 72h的改性細(xì)長聚球藻細(xì)胞中23BD的制備。圖4D示出了由改性細(xì)長聚球藻物種得到的細(xì) 胞提取物中ALS和ADH的特異活性。誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0018] 圖5A-C提供了重組細(xì)長聚球藻在連續(xù)培養(yǎng)下長期制備2, 3-丁二醇的概況。 方形：包含alsS (B. s. )，alsD (A. h.)和adh (C. b.)的細(xì)長聚球藻。圓形：包含&183(13· S. )，alsD (A. h.)和 adh (T. b.)的細(xì)長聚球藻。三角形：包含 alsS (B. s.)和 alsD (E. a.)的 細(xì)長聚球藻。菱形：不包含alsS，alsD或adh的細(xì)長聚球藻。圖5A示出了生長的時間過 長。圖5B示出了總的23BD制備。圖5C示出了光合效率。圖示出了每天制備的總生物 質(zhì)。誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差（η = 3)。
[0019] 圖64示出了由41^757(具有整合的&185，&18〇仏.11.)，和 &(111((113.))每天制備的 2, 3- 丁二醇。圖6B示出了在長期23BD制備的試驗中乙偶姻的濃度。方形：AL757 (具有整合 的 alsS (B. s. )，alsD (A. h.)和 adh (C. b.))。圓形：AL756 (具有整合的 alsS (B. s. )，alsD (A. h.)和adh(T. b.))。圖6C示出了由AL763(具有整合的alsS和alsD(E. a.))長期制備的 乙偶姻。
[0020] 圖7示出了在藍(lán)細(xì)菌中，由外來途徑制備的多種化學(xué)品的制備率的比 較。來源數(shù)據(jù)得自：23BD (本發(fā)明公開），異丁醛和異丁醇（Atsumi et al.，Nat Biotechnol, 27:1177-1180, 2009)，脂肪酸（Liu et al·，Proc Natl Acad Sci USA, 108:6899-6904,2011)，乙醇（Dexter and Pengcheng，Energy Environ Sci, 2:857-864, 2009)，丙酮（Zhou et al·，Metab Eng, 14:394-400, 2012)，乙?。═akahama et al·，J Biosci Bioeng，95:302_305,2003)，丁醇（Lan and Liao, Proc Natl Acad Sci USA，109:6018-6023,2012),脂肪醇（Tan et al·，Metab Eng, 13:169-176, 2011)。詳細(xì)計 算在實施例1中描述。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 仍需要限制0)2向大氣的排放和/或降低大氣中已經(jīng)存在的CO2濃度。光合微生物 有機(jī)體具有由大氣中除去這種化合物的能力，但是通常缺乏使用CO 2作為起始材料合成大 宗化學(xué)品的能力。有用的大宗化學(xué)品為化合物乙偶姻。乙偶姻被引述為適用于生物煉制用 途的最有價值的30種化學(xué)構(gòu)建結(jié)構(gòu)（building block)之一（U. S. Department ofEnergy)。 此外，乙偶姻是廣泛使用的香味劑和香料，并且在食品工業(yè)中具有重要用途。在本發(fā)明公開 研發(fā)之前，既不存在已知的由CO2制備乙偶姻的方法，也不存在任何已知的使用光合微生物 有機(jī)體由CO 2和日光制備乙偶姻的方法。
[0023] 另一種有用的大宗化學(xué)品為2, 3- 丁二醇（23BD)，其為合成有價值的化學(xué)品的多 功能構(gòu)建結(jié)構(gòu)分子。23BD可以通過脫氫作用而轉(zhuǎn)化成甲乙酮（MEK)，其為液體燃料天界和 有用的工業(yè)溶劑（Tran et al·，Biotechnol Bioeng, 29:3