用于優(yōu)化灌流細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于優(yōu)化灌流細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法和系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng) 本申請(qǐng)要求享有于2012年10月10日提交的標(biāo)題為"METHODS AND SYSTEMS FOR OPTIMIZING PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM"（代理人案件號(hào) BHC125019 (BH-021L))的 美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)61/712, 190的優(yōu)先權(quán)，其為了全部目的以其整體在此通過(guò)引用 并入本文。
[0002] 背景 重組蛋白，諸如rhFVIII (重組人因子VIII蛋白質(zhì)，其是由Bayer Healthcare, Berkeley, CA生產(chǎn)的Kogenate? FS或KG-FS的活性成分)，通常在灌流連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程 中生產(chǎn)。在該系統(tǒng)中的關(guān)鍵受控參數(shù)是細(xì)胞比灌流速率（specific perfusion rate)(在 本文中也稱(chēng)為灌流速率或CSPR)，其可以作為每天每細(xì)胞灌流的培養(yǎng)基的體積(體積/C/D) 或以每天的體積計(jì)算。細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)總生產(chǎn)成本有顯著地貢獻(xiàn)，并且是為何將努力投入在 使用對(duì)于細(xì)胞健康和/或產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)物品質(zhì)最優(yōu)的盡可能低的灌流速率上的一個(gè)原因。 進(jìn)一步地，如果可以維持蛋白質(zhì)產(chǎn)量，較低的灌流速率可以增加工廠生產(chǎn)能力并且在具有 對(duì)基礎(chǔ)設(shè)備最低限度改變的生產(chǎn)中提供靈活性。
[0003] 相對(duì)高的灌流速率幫助確保對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)，但是這也稀釋了產(chǎn)物， 導(dǎo)致了更大的收獲體積。在另一方面，低灌流速率會(huì)減少產(chǎn)物稀釋但是可能影響其穩(wěn)定性。 例如，在生物反應(yīng)器中的條件下分子的滯留時(shí)間增加可能導(dǎo)致分子暴露于蛋白酶或可能促 進(jìn)其降解的其他因素。如果營(yíng)養(yǎng)成為其濃度的限制（或如果積累了副產(chǎn)物)，則較低的灌流 速率還可能影響細(xì)胞性能。因此，僅僅降低灌流速率是不夠的。
[0004] 將為蛋白產(chǎn)物的最優(yōu)細(xì)胞生產(chǎn)提供充分的營(yíng)養(yǎng)和副產(chǎn)物清除的最低灌流速率會(huì) 因此將導(dǎo)致更高的產(chǎn)量，同時(shí)需要較少的組織培養(yǎng)基(在本文中也稱(chēng)為組織培養(yǎng)流體、組織 /細(xì)胞培養(yǎng)基、或培養(yǎng)基（medium)/培養(yǎng)基（media))--只要灌流速率的改變不影響產(chǎn)物 穩(wěn)定性。因此，應(yīng)當(dāng)對(duì)于細(xì)胞比生產(chǎn)力（specific productivity)和對(duì)于產(chǎn)物穩(wěn)定性來(lái)優(yōu) 化灌流速率。
[0005] 灌流速率的改變還影響了滯留時(shí)間(細(xì)胞和產(chǎn)物暴露于系統(tǒng)的單元操作 (unit-operation)條件的平均時(shí)間）。用于生產(chǎn)重組蛋白諸如重組FVIII的灌流生物反應(yīng) 器系統(tǒng)的兩個(gè)關(guān)鍵單元操作在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置（cell retention device)(在 本文中也稱(chēng)為CRD)，例如，沉降器（settler)中發(fā)生。生物反應(yīng)器對(duì)于理想的細(xì)胞培養(yǎng)條件 (例如，生理溫度和適當(dāng)氧合）是優(yōu)化的和受控的，而通常的細(xì)胞保留裝置被設(shè)計(jì)和優(yōu)化為 保留細(xì)胞并且將細(xì)胞再循環(huán)回到生物反應(yīng)器。因?yàn)镃RD通常不是被設(shè)計(jì)用于提供生物反應(yīng) 器的理想培養(yǎng)條件，因此高細(xì)胞濃度和非理想條件的組合可能處于不期望的狀態(tài)。為了緩 和這些條件，使用策略(諸如冷卻）以降低濃縮的細(xì)胞團(tuán)的代謝速率。通常，預(yù)期在細(xì)胞保留 裝置中的條件會(huì)減少細(xì)胞代謝，其進(jìn)而可能減少細(xì)胞生產(chǎn)力。
[0006] 在灌流系統(tǒng)中，細(xì)胞(和產(chǎn)物/副產(chǎn)物）在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置之間持續(xù)地 循環(huán)。因此細(xì)胞在對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)力有利的條件（即，在生物反應(yīng)器中）和其中生產(chǎn)力通常較低 的條件(例如，在CRD中）之間循環(huán)。在灌流系統(tǒng)中的細(xì)胞在外部次優(yōu)環(huán)境中（例如，在CRD 內(nèi)）花費(fèi)顯著時(shí)間的問(wèn)題是產(chǎn)業(yè)中公認(rèn)的（參見(jiàn)Bonham-Carter和Shevitz, BioProcess Inti. 9(9) Oct. 2011，pp. 24-30)。此外，細(xì)胞滯留在CRD中越長(zhǎng)，一旦細(xì)胞回到生物反 應(yīng)器中，可以導(dǎo)致回收需要更長(zhǎng)的時(shí)間。這可以導(dǎo)致系統(tǒng)生產(chǎn)力的進(jìn)一步降低。
[0007] 重組蛋白產(chǎn)物，諸如FVIII，可以通過(guò)連續(xù)的培養(yǎng)基收集進(jìn)行收獲。FVIII產(chǎn)物活 性還在生物反應(yīng)器中使用的溫度下隨時(shí)間而降低。因此，通過(guò)降低灌流速率增加滯留時(shí)間 可以導(dǎo)致活性重組蛋白產(chǎn)物更低的積累。
[0008] 因此，存在對(duì)于具有更低的灌流速率但仍具有高重組蛋白生產(chǎn)力的灌流生物反應(yīng) 器系統(tǒng)和方法的需要。
[0009] 概沭 在一個(gè)方面中，提供具有生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置的灌流生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)。灌 流生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)包括起始灌流速率、起始生物反應(yīng)器體積和起始細(xì)胞保留裝置體 積。系統(tǒng)涉及降低起始灌流速率，導(dǎo)致細(xì)胞在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置中的滯留時(shí)間增 加，和同時(shí)增加起始生物反應(yīng)器體積或減少起始細(xì)胞保留體積，或兩者。系統(tǒng)涉及改變灌流 速率、生物反應(yīng)器工作體積或CRD工作體積，以便實(shí)現(xiàn)在CRD的條件中的細(xì)胞的最優(yōu)滯留時(shí) 間。
[0010] 在另一個(gè)方面中，提供優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法。方法包括提供含有細(xì)胞 的組織培養(yǎng)流體(在本文中也稱(chēng)為組織培養(yǎng)基或培養(yǎng)基）至包括生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝 置的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)具有起始灌流速率、起始生物反應(yīng)器體積和起始細(xì)胞 保留裝置體積，和降低起始灌流速率，導(dǎo)致細(xì)胞在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置中的滯留時(shí) 間增加，并且增加起始生物反應(yīng)器體積或減少起始細(xì)胞保留體積，或兩者。所述方法涉及改 變灌流速率、生物反應(yīng)器工作體積或CRD工作體積，以便實(shí)現(xiàn)在CRD的條件中的細(xì)胞的最 優(yōu)滯留時(shí)間。
[0011] 在另一個(gè)方法方面中，提供優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法。方法包括提供含有 細(xì)胞的第一組織培養(yǎng)流體至包括生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 具有起始灌流速率、起始生物反應(yīng)器裝置體積和起始細(xì)胞保留體積；降低起始灌流速率，導(dǎo) 致細(xì)胞在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置中的滯留時(shí)間增加，并且用第一組織培養(yǎng)流體替換第 二組織培養(yǎng)流體，相比于第一組織培養(yǎng)流體，所述第二組織培養(yǎng)流體通過(guò)替換或濃度改變 具有對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的個(gè)別組分的調(diào)節(jié)。
[0012] 在另一個(gè)方法方面中，提供優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法。方法包括提供含有 表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞的第一組織培養(yǎng)流體至包括生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置的生物反應(yīng) 器系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)具有起始灌流速率、起始生物反應(yīng)器體積和起始細(xì)胞保留裝置體積， 降低起始灌流速率，導(dǎo)致細(xì)胞在生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置中的滯留時(shí)間增加，并且添加 重組蛋白的穩(wěn)定劑以減少降解。
[0013] 本教導(dǎo)的這些和其他特征在本文中描述。
[0014] 附圖 技術(shù)人員會(huì)理解下文描述的附圖是僅用于說(shuō)明目的。附圖不是意在以任何方式限制本 教導(dǎo)的范圍。
[0015] 圖1顯示了灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的圖示實(shí)施方案。
[0016] 圖2顯示了對(duì)于CSPR逐步降低，沿著IL灌流培養(yǎng)物（X-軸，按天數(shù))在Y-軸中活 細(xì)胞密度(菱形）和相對(duì)的CSPR (方形）的圖。CSPR以相對(duì)單位給出。
[0017] 圖3顯示了來(lái)自CSPR逐步降低的IL灌流細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品的活細(xì)胞密度（V⑶， 菱形）和效能(方形）（以標(biāo)準(zhǔn)化的效能顯示）的圖。
[0018] 圖4A-B顯示了在不同CSPR，相對(duì)于計(jì)算的效能觀察到的平均效能差異（以％計(jì)） 的柱狀圖（A)和圖（B)。將計(jì)算的效能設(shè)置在100%。
[0019] 圖5顯示了葡萄糖和乳酸的代謝數(shù)據(jù)的圖，表明了在IL灌流細(xì)胞培養(yǎng)期間，CSPR 時(shí)間框（以天計(jì)）中的逐步降低與CSPR中的相對(duì)變化。
[0020] 圖6顯示了在上清液(消耗的培養(yǎng)基/收獲的培養(yǎng)流體）中FVIII活性減少的圖： 實(shí)驗(yàn)，在37°C孵育9小時(shí)。剩余FVIII活性以對(duì)照的百分比顯示。
[0021] 圖7顯示了使用來(lái)自FVIII穩(wěn)定性測(cè)試的數(shù)據(jù)的計(jì)算FVIII活性和來(lái)自CSPR減 少實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的活性的比較的圖。在不同CSPR水平的計(jì)算滴度以％給出，且100%是 新生FVIII的初始效能。
[0022] 圖8A-B顯示了使用生物反應(yīng)器和細(xì)胞保留裝置的不同比例的活細(xì)胞密度和目標(biāo) 的CSPR速率(A)和在生物反應(yīng)器樣品中的FVIII效能（B)的圖。
[0023] 圖9A-B顯示了谷氨酰胺和谷氨酸的圖。在樣品中的濃度（A)和FVIII生產(chǎn)細(xì)胞 的比生長(zhǎng)速率（B)。
[0024] 圖10A-B顯示了在不同CSPR和生物反應(yīng)器工作體積的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的生產(chǎn)力 (A)和在不同培養(yǎng)CSPR的每IL培養(yǎng)物的計(jì)算的生產(chǎn)力（B)的圖。
[0025] 圖IlA-B顯示添加的穩(wěn)定劑可以(劑量依賴(lài)性地)減少由于在生物反應(yīng)器中滯留時(shí) 間增加導(dǎo)致的效能損失（~13_15%)，但是不能補(bǔ)償全郃的損失（~ 23%)。
[0026] 圖12顯示了表明根據(jù)實(shí)施方案的優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法的流程圖。
[0027] 圖13顯示了表明根據(jù)實(shí)施方案的優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的另一個(gè)方法的另一 個(gè)流程圖。
[0028] 圖14顯示了表明根據(jù)實(shí)施方案的優(yōu)化灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)的另一個(gè)方法的還另 一個(gè)流程圖。
[0029] 多個(gè)實(shí)