的任一者的非天然存在的微生物或 來(lái)源于其的無(wú)細(xì)胞部分；使非天然存在的微生物暴露于(?;包含低碳稀徑的混合氣體底物； 以及還原劑；其中將低碳烯烴轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物。包含低碳烯烴的混合氣體底物可以 包含兩種或更多種來(lái)自由以下組成的群組的烯烴：乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯。
[0129] 在某些實(shí)施方案中，本公開所提供的將乙烷轉(zhuǎn)化成乙烯的方法在環(huán)境溫度和壓力 下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 乙烯 /min/mg 催化劑 (例如，全細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物）干重。在某些實(shí)施方案中，本文所提供的將乙烯轉(zhuǎn)化成環(huán) 氧乙烷的方法產(chǎn)生>1L、>10L、>100L、>1000L、MOOOOL或>50000L環(huán)氧乙烷/天。
[0130] 在某些實(shí)施方案中，本公開所提供的將丙烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丙烷的方法在環(huán)境溫度和 壓力下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 丙烯 /min/mg 催化 劑（例如，全細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物）干重。在某些實(shí)施方案中，本文所提供的將丙烯轉(zhuǎn)化成 環(huán)氧丙烷的方法產(chǎn)生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L環(huán)氧丙烷/天。
[0131] 在某些實(shí)施方案中，本公開所提供的將丁烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丁烷的方法在環(huán)境溫度和 壓力下氧化至少 l、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol 丁烯 /min/mg 催化 劑（例如，全細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物）干重。在某些實(shí)施方案中，本文所提供的將丁烯轉(zhuǎn)化成 環(huán)氧丁烷的方法產(chǎn)生 >1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L 或 >50000L 環(huán)氧丁烷 / 天。
[0132] 應(yīng)了解，根據(jù)本文所公開的實(shí)施方案中的任一者的方法可以使用包含兩種或更多 種低碳烷烴（例如，甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷）和低碳烯烴（例如，乙烯、丙烯、丁烯以及丁 二烯）的任何組合的氣體底物。舉例來(lái)說(shuō)，氣體底物可以僅包含烷烴，僅包含烯烴，或包含 兩者的組合。
[0133] 伸烴氣化的系統(tǒng)
[0134] 在某些實(shí)施方案中，提供了將烷烴轉(zhuǎn)化成醇或?qū)⑾N轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物的系統(tǒng)，其 包括：氣相生物反應(yīng)器，所述氣相生物反應(yīng)器包含固定于固體基質(zhì)上的根據(jù)本文所公開的 實(shí)施方案中的任一者的非天然存在的微生物或來(lái)源于其的無(wú)細(xì)胞部分；連接器，所述連接 器用于將包含至少一種低碳烷烴或烯烴的氣體底物從氣源運(yùn)送至生物反應(yīng)器中；其中將氣 體底物傳送至緊密靠近非天然存在的微生物或來(lái)源于其的無(wú)細(xì)胞部分以使得這種微生物 或無(wú)細(xì)胞部分將低碳烷烴氧化成對(duì)應(yīng)的醇產(chǎn)物或?qū)⑾N氧化成對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物產(chǎn)物。示例 性系統(tǒng)提供于圖2中。用于甲烷催化轉(zhuǎn)化成甲醇、其它烷烴轉(zhuǎn)化以及烯烴轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物 的包括氣相反應(yīng)器、連接器、氣源、冷凝器、蒸餾單元以及再循環(huán)單元的系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是 眾所周知的，并且可以適合于氣相生物反應(yīng)器。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，使烴轉(zhuǎn)化氧化的系統(tǒng)進(jìn)一步包括化學(xué)或環(huán)境控制單元，其能 夠維持反應(yīng)器中的化學(xué)或環(huán)境應(yīng)激條件。舉例來(lái)說(shuō)，控制單元可以維持生物反應(yīng)器中特定 的溫度或溫度范圍、特定的PH或pH范圍，或特定的鹽或化學(xué)濃度或濃度范圍。在一些實(shí)施 方案中，環(huán)境控制單元包括溫度控制單元，其能夠維持生物反應(yīng)器中至少60°C的恒溫。在 其它實(shí)施方案中，化學(xué)控制單元包括PH控制單元，其能夠維持生物反應(yīng)器中至少9的pH、 或者5或低于5的pH。在某些實(shí)施方案中，溫度控制單元能夠維持至少40°C、至少45°C、 至少50°C、至少55°C、至少60°C、至少65°C、至少70°C、至少75°C、至少80°C、至少85°C、至 少90°C或至少95°C的溫度。化學(xué)控制單元能夠維持至少8、至少8. 5、至少9、至少9. 2、至 少9. 4、至少9. 6、至少9. 8或至少10的pH，或至多6、至多5. 5、至多5、至多4. 8、至多4. 6、 至多4. 4、至多4. 2或至多4的pH。
[0136] 在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于將4從H 2氣源運(yùn)送至生物反應(yīng)器中 的連接器。在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于將空氣從空氣源運(yùn)送至生物反應(yīng) 器中的連接器。在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于將〇2從O 2氣源運(yùn)送至生物反 應(yīng)器中的連接器。
[0137] 在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于收集醇或環(huán)氧化物產(chǎn)物的收集單 元。在其它實(shí)施方案中，收集單元進(jìn)一步包括冷凝器。冷凝器可以用于將從生物反應(yīng)器外 流至收集單元中的氣體蒸氣冷卻成液體。收集單元可以進(jìn)一步包括用于分離醇或環(huán)氧化物 產(chǎn)物與水副產(chǎn)物或其它雜質(zhì)的蒸餾單元。
[0138] 在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于將氣體底物中的任何未轉(zhuǎn)化的低碳 烷烴或烯烴再循環(huán)返回至生物反應(yīng)器中用于生物催化的再循環(huán)單元。
[0139] 在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含甲烷，并且對(duì)應(yīng)的醇產(chǎn)物包含甲醇。在某些實(shí)施 方案中，氣態(tài)底物包含乙烷，并且對(duì)應(yīng)的醇產(chǎn)物包含乙醇。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包 含丙烷，并且對(duì)應(yīng)的醇產(chǎn)物包含丙醇。在其它實(shí)施方案中，丙醇基本上包含正丙醇。在某些 實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含丁烷，并且對(duì)應(yīng)的醇產(chǎn)物包含丁醇。在其它實(shí)施方案中，丁醇基 本上包含正丁醇。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含低碳烷烴的混合物（以下烷烴中的兩 者或更多者的任何組合：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷）。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含乙 烯，并且對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧乙烷。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含丙烯，并且 對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧丙烷。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含丁烯，并且對(duì)應(yīng)的環(huán) 氧化物產(chǎn)物包含環(huán)氧丁烷。在某些實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含丁二烯，并且對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物 產(chǎn)物包含丁二烯1，2氧化物。
[0140] 在某些實(shí)施方案中，氣相生物反應(yīng)器是流化床反應(yīng)器。在某些實(shí)施方案中，固體基 質(zhì)是聚丙烯環(huán)、陶瓷生物環(huán)、陶瓷鞍、纖維支撐體（例如，膜）、多孔玻璃珠、聚合物珠、木炭、 活性碳、干燥硅膠、顆粒氧化鋁、渥太華砂、粘土、聚氨酯細(xì)胞支撐片或流化床粒子載體（例 如，砂、粒狀活性碳、硅藻土、海藻酸鈣凝膠珠）。在某些實(shí)施方案中，固體基質(zhì)包含聚丙烯、 陶瓷、玻璃、木炭、砂、活性碳或硅藻土。在某些實(shí)施方案中，非天然存在的微生物或來(lái)源于 其的無(wú)細(xì)胞部分呈基本上無(wú)水狀態(tài)（例如，凍干的）固定于固體基質(zhì)上。 實(shí)施例
[0141] 實(shí)施例1 :發(fā)孢甲基彎菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)型
[0142] 培養(yǎng)基制備.
[0143] 制備匪S培養(yǎng)基.
[0144] MgSO4 · 7H20......................................1.0 g
[0145] CaCl2 · 6H20...................................... 0. 20g
[0146] 螯合鐵溶液（見(jiàn)下文）.........................2. Oml
[0147] KNO3....................................................1.0 g
[0148] 微量元素溶液（見(jiàn)下文）......................0.5ml
[0149] KH2PO4.............................................. 0. 272g
[0150] Na2HPO4 · 12H20..............................0. 717g
[0151] 純化的瓊脂（例如，Oxoid L28).........12. 5g
[0152] 蒸餾過(guò)的去離子水...................................1.0 L
[0153] 調(diào)整pH至6.8。在121°C下高壓滅菌15分鐘。
[0154] 螯合鐵溶液：
[0155] 檸檬酸鐵（III)銨 *..................0.1 g
[0156] EDTA 鈉鹽...........................0. 2g
[0157] HCl(濃）..............................0.3ml
[0158] 蒸餾過(guò)的去離子水............100.0 ml
[0159] *0· 5g氯化鐵（III)可以替代。
[0160] 每升最終培養(yǎng)基使用2. Oml這種螯合鐵溶液。
[0161] 微量元素溶液：
[0162] EDTA............................ 500.0 mg
[0163] FeSO4 · 7H20................ 200.0 mg
[0164] ZnSO4 · 7H20.................10.0 mg
[0165] MnCl2 · 4H20...................3. Omg
[0166] H3BO3.............................30.0 mg
[0167] CoCl2 · 6H20.................. 20.0 mg
[0168] CaCl2 · 2H20....................1.0 mg
[0169] NiCl2 · 6H20....................2. Omg
[0170] Na2MoO4 · 2H20.............3. Omg
[0171] 蒸餾水................................1.0 L
[0172] 在121 °C下高壓滅菌15分鐘。
[0173] 生長(zhǎng)和綴合。將來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒綴合至甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中的程序是基于由 Martin，H.和Murrell，J.C. (1995)開發(fā)的方法。通過(guò)標(biāo)志交換誘變來(lái)構(gòu)建發(fā)孢甲基彎菌的 甲烷單加氧酶突變體。FEMS Microbiol. Lett. 127:243-248。
[0174] 簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方法將有待綴合的動(dòng)員質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)型至大腸桿菌 S17-1中。通過(guò)在含有20ug/mL卡那霉素的LB瓊脂上選擇卡那霉素（kanamycin)抗性集落 來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)型。將轉(zhuǎn)型的集落接種至含有20ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，并且在37°C下振 蕩過(guò)夜。然后，在無(wú)菌的47mm硝化纖維素過(guò)濾器（0.2mm孔徑）上收集過(guò)夜培養(yǎng)物的IOmL 等分試樣。在過(guò)濾器上用50mL無(wú)菌WS培養(yǎng)基洗滌大腸桿菌供體菌株以去除殘余培養(yǎng)基 和抗生素。
[0175] 平行地，將發(fā)孢甲基彎菌（M. trichosporium)0B3b受體菌株的樣品接種至含有 20-50mL NMS培養(yǎng)基的IOOmL血清瓶中。然后，用氧氣與甲烷的1:1混合物吹掃瓶的頂空， 并且用丁基丁基橡膠隔片將瓶密封并卷邊。在30°C孵育箱中連續(xù)振蕩這些瓶直至達(dá)到約 0. 3的0D600。然后，在與大腸桿菌供體菌株相同的過(guò)濾器上收集細(xì)胞。再次用50mL無(wú)菌 NMS培養(yǎng)基洗滌過(guò)濾器。將過(guò)濾器放置（細(xì)胞朝上）在含有0.02% (w/v)朊蛋白胨的NMS 瓊脂板上，并且在30°C下在甲烷和氧氣存在下孵育24小時(shí)。24小時(shí)后，使細(xì)胞再懸浮于 IOmL無(wú)菌〇MS)培養(yǎng)基中，隨后通過(guò)離心而濃縮。使團(tuán)粒再懸浮于ImL無(wú)菌匪S培養(yǎng)基中。 將等分試樣（IOOul)鋪展至含有10ug/mL卡那霉素的NMS瓊脂板上。
[0176] 在維持于30°C下的含有甲烷與氧氣的1:1混合物的密封室中孵育這些板。每2天 補(bǔ)充氣體混合物直至形成集落，通常在7-14天之后。將集落劃線至含有卡那霉素的NMS板 上以確認(rèn)卡那霉素抗性以及進(jìn)一步分離轉(zhuǎn)型的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)胞與殘余大腸桿菌供體細(xì)胞。
[0177] 實(shí)施例2 :將熱穩(wěn)定的pMMO基因引入發(fā)孢甲基彎菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中。
[0178] 用適當(dāng)啟動(dòng)子合成來(lái)自溫泉甲基熱菌（Methylothermus thermalis)的所有pMMO 亞單元的密碼子優(yōu)化的型式（SEQ ID N0:176和648)。然后，將基因克隆并且都轉(zhuǎn)型至如 上文所描述的野生型發(fā)孢甲基彎菌中。通過(guò)細(xì)胞對(duì)抗生素選擇的抗性來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)型，并且通 過(guò)northern印跡法（以確認(rèn)RNA轉(zhuǎn)錄）、western印跡法或ELISA方法（以確認(rèn)蛋白質(zhì)表 達(dá)）來(lái)確認(rèn)基因表達(dá)。
[0179] 為了確認(rèn)熱穩(wěn)定的pMMO酶的活性，將轉(zhuǎn)型的細(xì)胞和非轉(zhuǎn)型的對(duì)照接種至含有 20-50mL匪S培養(yǎng)基和10ug/mL卡那霉素的IOOmL血清瓶中。用甲烷與氧氣的1:1混合 物吹掃瓶的頂空，并且用丁基橡膠隔片將瓶密封并卷邊。然后連續(xù)振蕩這些瓶，同時(shí)在 30°C下孵育。每2天更新頂空氣體直至達(dá)到約0. 5的0D600。通過(guò)離心收集細(xì)胞，用25mM MOPS [3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸]、2mM L-半胱氨酸以及ImM CuSO4 (pH 7.0)洗滌，然后再懸 浮于等體積的相同緩沖液中。分析細(xì)胞制劑的MMO活性，其在本文中定義為每分鐘每毫克 細(xì)胞干重所形成的環(huán)氧丙烷的量。反應(yīng)容器由用鋁蓋和聚四氟乙烯內(nèi)襯的丁基橡膠隔片密 封的具有IOml頂空的小瓶組成。將ImL細(xì)胞懸浮液等分至每個(gè)小瓶中，并且將小瓶密封并 卷邊。使反應(yīng)混合物升溫至28°C或60°C，并且孵育10分鐘，隨后添加底物。將丙烯和O 2 注入頂空（1:1混合物）中之后，在適當(dāng)溫度下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以150rpm或200rpm振蕩小 瓶。30分鐘后從水相移出樣品并且通過(guò)氣相色譜法分析。為了實(shí)現(xiàn)多次酶周轉(zhuǎn)，將H 2以等 體積比包括在氣體混合物中。通過(guò)在轉(zhuǎn)型與未轉(zhuǎn)型的細(xì)胞之間比較60°C下所觀測(cè)到的丙烯 氧化活性的差異來(lái)確定嗜熱PMMO活性。
[0180] 氣相色譜法.用含有填充有 80 X 100 目 Carbopack C+0. 1% SP-1000 (Supelco)的 玻璃柱（2. 6mm內(nèi)徑，3. Im)的Shimadzu GC-14A型氣相色譜儀來(lái)定量環(huán)氧丙烷形成。氣相 色譜儀用A0C-17自動(dòng)注射器和Shimadzu CR_601Chromatopac記錄器構(gòu)造。氦氣用作載氣 (20ml/min)。注射器和檢測(cè)器（火焰離子化檢測(cè)器）溫度分別是20(TC和175°C。將含水 樣品在80°C下等溫操作6分鐘。在單時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)中通過(guò)將峰面積與標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線相比較來(lái) 定量產(chǎn)物形成。
[0181] 實(shí)施例3 :在發(fā)孢甲基彎菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中由熱穩(wěn)定的pMMO產(chǎn)生醇。
[0182] 將上文所描述的熱穩(wěn)定的pMMO轉(zhuǎn)型的菌株的瓶生長(zhǎng)培養(yǎng)物以1:100接種至3L New Brunswick夾套型發(fā)酵容器中的IL NMS培養(yǎng)基中。在50mL/min甲燒和10OmT,/min O2 的恒定進(jìn)料下以800rpm攪拌培養(yǎng)物。適當(dāng)時(shí)通過(guò)在線添加 NaOH和HCl來(lái)維持pH。將溫度 維持于30°C。NaN03、KHP04、CuSO 4以及Fe-EDTA的添加是根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率以一定時(shí)間 間隔進(jìn)行。在晚對(duì)數(shù)期（0D約25)通過(guò)離心收集細(xì)胞并且如上述用MOPS緩沖液洗滌。
[0183] 將細(xì)胞固定于固相支撐體上，例如IS0LITE?，其為硅藻土產(chǎn)品（78% Si02、12% Al2O3以及5 % Fe 203)，這種固相支撐體用于固定細(xì)胞并且用于土壤通氣。這是對(duì)許多有機(jī)分 子沒(méi)有吸附能力的惰性材料。在去離子水中預(yù)先洗滌IS0LITE?以除塵，然后在120°C下在 烘箱中干燥48小時(shí)。將再懸浮細(xì)胞的300ml樣品添加至燒瓶中的150克IS0LITE?中。然 后，將燒瓶放置在孵育箱/振蕩器上（20rpm，在55°C下）一小時(shí)以使細(xì)胞結(jié)合至IS0LITE?。 然后從IS0LITE?中去除水相，并且干燥固相并填充至標(biāo)準(zhǔn)的Icm直徑不銹鋼反應(yīng)器中。將 反應(yīng)器加熱至60°C并且連接至lOmL/min 25:25:50甲烷：H2:02的連續(xù)進(jìn)料。反應(yīng)器出口 以1:100分割用于通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行連續(xù)廢氣分析，而大部分流傳送至冷凝器以捕獲水 與甲醇。通過(guò)氣相色譜法以及通過(guò)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估冷凝器中捕獲的大批物質(zhì)來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè) 甲醇。
[0184] 實(shí)施例4 :莢膜甲基球菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)型
[0185] 生長(zhǎng)和綴合。將來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒綴合至甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中的程序是基于由 Martin，H.和Murrell，J.C. (1995)開發(fā)的方法。通過(guò)標(biāo)志交換誘變來(lái)構(gòu)建莢膜甲基球菌的 甲烷單加氧酶突變體。FEMS Microbiol. Lett. 127:243-248。
[0186] 簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方法將有待綴合的動(dòng)員質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)型至大腸桿菌 S17-1中。通過(guò)在含有20ug/mL卡那霉素的LB瓊脂上選擇卡那霉素抗性集落來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)型。 將轉(zhuǎn)型的集落接種至含有20ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，并且在37°C下振蕩過(guò)夜。然 后，在無(wú)菌的47mm硝化纖維素過(guò)濾器（0. 2mm孔徑）上收集過(guò)夜培養(yǎng)物的IOmL等分試樣。 在過(guò)濾器上用50mL無(wú)菌NMS培養(yǎng)基洗滌大腸桿菌供體菌株以去除殘余培養(yǎng)基和抗生素。
[0187] 平行地，將莢膜甲基球菌（M. capsulatus)受體菌株的樣品接種至含有20_50mL 匪S培養(yǎng)基的IOOmL血清瓶中。然后，用氧氣與甲烷的1:1混合物吹掃瓶的頂空，并且用 丁基丁基橡膠隔片將瓶密封并卷邊。在45°C孵育箱中連續(xù)振蕩這些瓶直至達(dá)到約0. 3的 0D600。然后，在與大腸桿菌供體菌株相同的過(guò)濾器上收集細(xì)胞。再次用50mL無(wú)菌匪S培 養(yǎng)基洗滌過(guò)濾器。將過(guò)濾器放置（細(xì)胞朝上）在含有0.02% (w/v)朊蛋白胨的NMS瓊脂板 上，并且在37°C下在甲烷和氧氣存在下孵育24小時(shí)。24小時(shí)后，使細(xì)胞再懸浮于IOmL無(wú) 菌（匪S)培養(yǎng)基中，隨后通過(guò)離心而濃縮。使團(tuán)粒再懸浮于ImL無(wú)菌匪S培養(yǎng)基中。將等 分試樣（100 μ 1)鋪展至含有10 μ g/mL卡那霉素的匪S瓊脂板上。
[0188] 在維持于45°C下的含有甲烷與氧氣的1:1混合物的密封室中孵育這些板。每2天 補(bǔ)充氣體混合物直至形成集落，通常在7-14天之后。將集落劃線至含有卡那霉素的NMS板 上以確認(rèn)卡那霉素抗性以及進(jìn)一步分離轉(zhuǎn)型的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)胞與殘余大腸桿菌供體細(xì)胞。
[0189] 實(shí)施例5 :ADH基因從莢膜甲基球菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中缺失。
[0190] 從莢膜甲基球菌中去除可能通過(guò)氧化甲醇而降低生產(chǎn)產(chǎn)率的原生adh基因。合成 莢膜甲基球菌 adh 基因 Genbank 登錄號(hào) AAU92947. I (SEQ ID N0:655)、AAU92153. I (SEQ ID N0:656)以及AAU91107.1(SEQ ID N0:657)的合成cDNA構(gòu)建體，其在每個(gè)基因的5'區(qū)中并 有幾個(gè)終止突變和讀框移位。將這些cDNA構(gòu)建體克隆至用于綴合，但缺乏在甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中 發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的適當(dāng)載體中，并且使用上文所描述的方法引入莢膜甲基球菌中。這 種技術(shù)確保了任何卡那霉素抗性莢膜甲基球菌集落必須已經(jīng)通過(guò)重組并入基因組中。
[0191] 同源重組事件的鑒別在本領(lǐng)域中得到充分確立，并且通常是通過(guò)PCR和測(cè)序，使 用基因組中的獨(dú)特引物和載體構(gòu)建體以確認(rèn)適當(dāng)插入來(lái)進(jìn)行。然后，在不存在選擇壓力 (例如，卡那霉素）下使同源重組體生長(zhǎng)幾代，并且通過(guò)復(fù)制平板培養(yǎng)（或等效的技術(shù)）鑒 別已經(jīng)損失抗性標(biāo)志的敏感克隆體。約50%的敏感回復(fù)體具有突變形式的靶基因替代野生 型型式。通過(guò)全基因組測(cè)序來(lái)確認(rèn)靶adh基因的損失。
[0192] 實(shí)施例6 :將熱穩(wěn)定的pMMO基因引入莢膜甲基球菌甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中。
[0193] 用適當(dāng)啟動(dòng)子合成來(lái)自溫泉甲基熱菌的所有pMMO亞單元的密碼子優(yōu)化的型式 (SEQ ID NO: 176和648)。然后，將基因克隆并且轉(zhuǎn)型至如上文所描述的野生型莢膜甲基球 菌與adh敲除菌株中。通過(guò)細(xì)胞對(duì)抗生素選擇的抗性來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)型，并且通過(guò)northern印跡 法（以確認(rèn)RNA轉(zhuǎn)錄）western印跡法或ELISA方法（以確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)）來(lái)確認(rèn)基因表 達(dá)。
[0194] 為了確認(rèn)熱穩(wěn)定的pMMO酶的活性，將轉(zhuǎn)型的細(xì)胞和非轉(zhuǎn)型的對(duì)照接種至含有 20-50mL匪S培養(yǎng)基和10ug/mL卡那霉素的IOOmL血清瓶中。用甲烷與氧氣的1:1混合 物吹掃瓶的頂空，并且用丁基橡膠隔片將瓶密封并卷邊。然后連續(xù)振蕩這些瓶，同時(shí)在 45°C下孵育。每2天更新頂空氣體直至達(dá)到約0. 5的0D600。通過(guò)離心收集細(xì)胞，用25mM MOPS [3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸]、2mM L-半胱氨酸以及ImM CuSO4 (pH 7.0)洗滌，然后再懸 浮于等體積的相同緩沖液中。分析細(xì)胞制劑的MMO活性，其在本文中定義為每分鐘每毫克 細(xì)胞干重所形成的環(huán)氧丙烷的量。反應(yīng)容器由用鋁蓋和聚四氟乙烯內(nèi)襯的丁基橡膠隔片密 封的具有IOml頂空的小瓶組成。將ImL細(xì)胞懸浮液等分至每個(gè)小瓶中，并且將小瓶密封并 卷邊。使反應(yīng)混合物升溫至40°C或80°C，并且孵育10分鐘，隨后添加底物。將丙烯和O 2 注入頂空（1:1混合物）中之后，在適當(dāng)溫度下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以150rpm或200rpm振蕩小 瓶。30分鐘后從水相移出樣品并且通過(guò)氣相色譜法分析。為