本發(fā)明涉及生物領域，尤其涉及一種多肽。

背景技術：

a型激酶錨定蛋白(a-kinaseanchorproteins,akaps)是結合蛋白激酶a(pka)亞基的一組結構不同的蛋白質。大量的證據表明akaps在camp介導的信號傳導中起著重要的作用。akap3是一個癌睪抗原。研究表明，akap3是精子特有的基因，主要在精子形成過程中減數分裂后表達，在精子前體細胞的形態(tài)變化和調節(jié)精子功能中起重要作用。在正常組織中，akap3表達僅存在于睪丸中。akap3的mrna在各種腫瘤細胞系中廣泛表達。研究發(fā)現，akap3在卵巢癌中高表達，并且akap3的表達和腫瘤的組織學分級有關，也與腫瘤的臨床分期有關。

技術實現要素：

本發(fā)明克服了現有技術的不足，提供了一種靶向akap3的親和肽或akap3來源的抗腫瘤ctl表位肽p333及其應用。

一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

另一方面，本發(fā)明提供了所述多肽的制備方法，該多肽可通過固相合成制得，如采用標準fmoc方案制備。

另一方面，本發(fā)明提供了含所述多肽的食物、保健品或藥物組合物，藥物組合物可包括多肽及其藥學上可接受的載體或賦形劑，其形式可為疫苗。

再一方面，本發(fā)明提供了所述多肽用于制備akap3表達陽性腫瘤的預防性或治療性多肽疫苗的用途。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的多肽是akap3抗腫瘤ctl(細胞毒性t淋巴細胞)表位肽，較好地誘導特異性ctl應答，提升ifn-γ的表達量，從而增強腫瘤預防和治療的效果，可制為一種新型的腫瘤治療性疫苗甚至食物、保健品。

附圖說明

圖1表征elispot法檢測表位肽體外特異性ctl分泌ifn-γ的能力；

圖2表征ldh法檢測表位肽體外特異性ctl細胞毒性；

圖3表征elispot法檢測表位肽體內特異性ctl分泌ifn-γ的能力；

圖4表征ldh法檢測表位肽體內特異性ctl細胞毒性；

圖5表征elisa法檢測小鼠血清中ifn-γ的分泌量；

圖6為轉基因小鼠體重變化圖。

各圖中所涉*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001分別代表實驗組與pbs組的顯著性差異；▲p<0.05，▲▲p<0.01和▲▲▲p<0.001分別代表實驗組與hbcag18–27或者th表位組的顯著性差異。

具體實施方式

本發(fā)明的候選肽p333，其序列為lidsflrnl(leu-ile-asp-ser-phe-leu-arg-asn-leu)，如seqidno.1所示，采用標準fmoc方案進行固相合成，經質譜檢測其分子量為：1091.7[m+h]，基本同理論值1090.3。下面鑒定該候選肽(有時亦稱表位肽)的活性，所用實驗方法、試劑均為常規(guī)選擇，參見文獻：shirr,liuj,zouz,qiym,zhaimx,zhaiwj,gaoyf:theimmunogenicityofanovelcytotoxictlymphocyteepitopefromtumorantigenpl2l60couldbeenhancedby4-chlorophenylalaninesubstitutionatposition1.cancerimmunology,immunotherapy:cii2013,62(11):1723-1732。如無特別說明，所涉名詞、縮寫均為本領域常規(guī)含義。

1.t2a2細胞親和力實驗

①收集t2a2細胞，用無血清imdm洗3次，調整細胞濃度至1×10⁶/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。實驗組加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候選肽p333；設置陽性組、陰性組、背景對照組。于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。

②收集孵育后的細胞，用冰pba洗3次，加入0.5ml1:100稀釋的單克隆抗體bb7.2，4℃避光孵育30min。

③冷pba洗3次，加入50μl稀釋度為1:50的fitc-羊抗鼠igg溶液，4℃避光孵育40min。冷pba洗滌1次，1mlpba重懸，上流式細胞儀進行檢測。同時，設置已被鑒定的hbcag18-27作為結合力和穩(wěn)定性實驗的陽性肽，pbs作為陰性對照，未加肽刺激的單純t2a2細胞作為背景對照。

結果用熒光系數(fi)表示：熒光系數(fi)＝(表位肽平均熒光強度－背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。結果分析：如果fi>1.5：候選肽與hla-a*0201具有強親合力；1.5>fi>0.5：中等親合力；fi<0.5：弱親合力。

經分析，本肽的fi＝2.86。

2.肽/mhc復合物穩(wěn)定性分析

收集t2a2細胞，用無血清imdm洗3次，調整細胞濃度至1×10⁶/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。分別加入50μm的候選肽，設置陽性組、陰性組、背景組和調零組，每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。

孵育完成后，以冷pba洗滌3次以洗凈未結合的肽，加入10μg/mlbrefeldina(布雷菲德菌素a)孵育1h。以0h、2h、4h、6h為時間點，37℃、5％co²共孵育。冷pba洗滌2次，加500μl稀釋度為1:100的單克隆抗體bb7.2，4℃避光孵育30min。冷pba洗滌2次，加50μl稀釋度為1:50的fitc-羊抗鼠igg，4℃避光孵育40min。冷pba洗滌后，pba重懸細胞，于流式細胞儀檢測，結果以dc50表示。

經檢測，dc50>6h。

3.體外免疫活性檢測

細胞毒t淋巴細胞體外誘導

①40ml離心管中加入適量肝素鈉溶液，抽取hla-a2陽性健康志愿者外周血20ml，無菌ph＝7.2的pbs將抗凝血進行稀釋。

②將4ml的淋巴細胞分裂液貼壁緩緩加入無菌的離心管，隨后加入經pbs稀釋過的抗凝血，注意不要打破界面。2000rpm，離心20min。

③離心結束后，離心管中細胞從上至下分為四層；棄去第一層血漿層，吸取第二層環(huán)狀乳白色的淋巴細胞層，置于另一無菌離心管中，隨后加入5倍體積的pbs洗滌，2000rpm，15min。

④棄上清，收集沉淀。用含10％胎牛血清的imdm培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×10⁶/ml，置于24孔板中培養(yǎng)。

⑤設定pbs組、hbv組、實驗組，第2天hbv組、實驗組分別加入相對應的多肽和β2-m(兩者終濃度均設為10μg/ml)，pbs組加入相對應的pbs，第3天加入50u/ml的重組人源il-2(rhil-2)，觀察培養(yǎng)液狀態(tài)，進行半量換液，補加rhil-2。每7天進行一輪重復刺激，刺激過程：24孔板進行1000rpm，10min離心，去除上清，加入新鮮的含10％胎牛血清的imdm培養(yǎng)基，同時補加上述量相對應的多肽、rhil-2和β2-m，第2輪刺激的第3天加入cd3抗體。

⑥完成3輪刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，收集細胞即作為效應ctl。

免疫活性檢測

1)elispot(enzyme-linkedimmunospotassay酶聯免疫斑點實驗)法檢測分泌ifn-γ的t細胞數

a.首先進行預包被板的活化：

取出所需elispot板條，每孔加200μl無血清的imdm培養(yǎng)基進行封閉，靜置10min后將培養(yǎng)基棄去；

b.細胞鋪板：

誘導的ctl作為效應細胞，荷肽的t2a2作為刺激細胞，細胞濃度均調整為2×10⁶個/ml；實驗孔每孔加50μl效應細胞和50μl刺激細胞；

陰性對照孔每孔加100μl無血清的imdm培養(yǎng)基；

陽性對照孔每孔加50μl的效應細胞和10μlpha再補加40μl無血清的imdm培養(yǎng)基培養(yǎng)。

鋪板完畢放于培養(yǎng)箱中，37℃、5％co2孵育18h；

c.細胞裂解：

孵育結束后，傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200μl無菌的去離子水，4℃裂解細胞10min；傾盡孔內液體，加入200μl1×washingbuffer進行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

d.加入檢測抗體孵育：

加入100μl生物素標記的抗體，37℃孵育1h；孵育完成后，傾盡孔內液體，加入200μl1×washingbuffer進行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

e.加入酶聯親和素孵育：

加入100μl酶聯親和素，37℃孵育1h；孵育完成后，傾盡孔內液體，每孔加入200μl1×washingbuffer進行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

f.顯色：

加入100μl現配的aec顯色液，室溫25℃避光靜置30min，進行顯色；顯色完成后，傾盡孔內液體并打開孔板底座，去離子水洗滌，終止顯色。置于通風處，室溫靜置干燥；用elispot圖像分析儀計數96孔板中每孔的斑點數，結果比較如圖1所示。

2)ldh(lactatedehydrogenase乳酸鹽脫氫酶)法檢測細胞毒性實驗

①靶細胞、效應細胞的準備

本實驗中將sw620作為靶細胞，調整細胞濃度為1×10⁵個/ml，每孔加入5000個/50μl，加入不同數量和體積的效應細胞(前面體外誘導制備)，使實驗組形成不同的效靶比(分別為12.5:1、25:1、50:1)，并補加無血清的imdm培養(yǎng)基至總體積100μl，每組設置3個復孔。

同時設立以下對照：

靶細胞自發(fā)釋放組

靶細胞最大釋放組

效應細胞自發(fā)釋放組

背景對照組

總體積校正對照組，各對照組也設3個復孔，每孔總體積100μl。

②ldh實驗步驟：

細胞培養(yǎng)板96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。孵育結束前45min，加入10μl10×裂解液添加在靶細胞最大釋放孔和體積校正孔中。培養(yǎng)結束后，離心培養(yǎng)板1000rpm，10min；取出96孔板，每孔輕輕吸取50μl上清置于另一96孔板對應的孔中，全部轉移結束后，每孔迅速加入50μl乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30min；孵育結束后，每孔添加50μl終止液；酶標儀上以490nm檢測吸收od值，計算殺傷率。

殺傷率＝(實驗組釋放-效應細胞自發(fā)釋放-靶細胞自發(fā)釋放)/(靶細胞最大釋放-靶細胞自發(fā)釋)×100％。

結果比較如圖2所示。

4.akap3的hla-a2.1/k^b轉基因小鼠體內免疫活性檢測

效應ctl的體內誘導

隨機選取6～8周齡hla-a2.1/k^b轉基因小鼠，每組5只，雌雄隨機分配。

實驗共設置pbs組、th表位組、實驗組。每組注射小鼠體內的劑量如下：

pbs組：pbs：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1

th組：pbs：th表位：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1:2

實驗組：實驗組：th表位：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1:2

第1次免疫注射記為第0天，按照上面所給各個組分進行皮下免疫注射，在第5d、第10d時進行第2次和第3次加強免疫；同時每次免疫注射前，對hla-a2.1/k^b轉基因小鼠進行觀察，記錄體重，結果如圖6所示。

制備效應細胞：

①將免疫注射后的hla-a2.1/k^b轉基因小鼠于第11d脫頸處死，置于75％酒精中，浸泡處理10min消毒后，無菌開腹腔取出脾臟，去除脂肪和結締組織放于200目不銹鋼網篩中；

②培養(yǎng)皿中加入少量ph＝7.2的pbs，并將200目鋼網置于其上，用20ml醫(yī)用注射器內芯進行研磨，盡量研磨干凈。pbs沖洗，移去篩網，培養(yǎng)皿中得脾細胞懸液(約10ml)，轉移至無菌離心管中；

③1000rpm、10min水平離心，棄上清，收集細胞；每管加入5ml紅細胞裂解液，輕輕吹打重懸細胞，4℃孵育15min裂解紅細胞；1000rpm、10min水平離心棄上清，收集細胞。pbs洗滌2次；

④將脾細胞重懸于10ml含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中。計數后的脾細胞懸液置于6孔板中培養(yǎng)，每孔5ml細胞懸液；次日每孔加入250u重組鼠源il-2、β2-m以及與相對應的多肽；在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，收獲后作為效應細胞，進行elispot和ldh檢測。elispot和ldh檢測方法同前面體外免疫實驗所用方法，elispot法檢測結果如圖3所示，ldh法檢測結果如圖4所示。

hla-a2.1/k^b轉基因小鼠血清中ifn-γ酶聯免疫分析(elisa)

在轉基因小鼠脫頸處死之前，用眼球取血的方法取各組免疫小鼠靜脈血，室溫靜置2-4h后，3000rpm離心10分鐘取上層血清，標記好后-80℃保存。elisa法檢測小鼠血清中ifn-γ抗體水平，結果比較如圖5所示。

序列表

<110>漯河醫(yī)學高等?？茖W校

<120>靶向akap3的親和肽p333

<160>1

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

leuileaspserpheleuargasnleu

15