本發(fā)明涉及植物病原鑒定
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體的涉及一種提取煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的方法及鑒定提取的差異性肽段。
背景技術(shù):
:煙草黑脛病是一種世界性的毀滅性土傳卵菌病害。黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一種兼性寄生菌,喜高溫高濕,溫度在28-30℃,濕度達到80%以上時,給病菌孢子囊的傳播和游動孢子的釋放創(chuàng)造有利條件,此時最適合煙草黑脛病的流行與發(fā)生,引起煙株大面積死亡。煙草作為其寄主植物,在其團棵期到旺長期間發(fā)病達到高峰期,主要危害其根部和莖基部。國際上已報道的黑脛病菌生理小種有4種,我國至少有0號和1號兩個生理小種,當(dāng)前仍以0號小種為優(yōu)勢小種。不同煙草黑脛病菌生理小種在致病力方面表現(xiàn)差異,即不同煙草品種對不同生理小種的抗感性狀不同,如nc1071和l8品種對于0號小種均抗病,而對于1號小種則感??;florida301品種對于0號和1號生理小種均抗病;h21和小黃金1025對于0號和1號生理小種均感病,因此尋找差異性蛋白肽段顯得尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提取煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的方法及鑒定的差異性肽段。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種提取煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的方法,其特征在于,包括以下步驟:第一步:提取黑脛病菌的總蛋白;第二步:以步驟1中得到的蛋白進行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳;第三步:根據(jù)步驟2得到的電泳膠圖挑選出差異條帶;第四步:將3獲取的條帶酶解,提取酶解肽段,進行l(wèi)c-ms分析;第五步:對質(zhì)譜結(jié)果采用mascot2.2軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫,獲得差異性蛋白肽段。其中,步驟1中制備提取液,每500μl真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物,4μl蛋白穩(wěn)定劑,混勻后置冰上備用。其中,步驟2中配制10%分離膠和4%濃縮膠,10%過硫酸銨(ap)應(yīng)最后加入,混勻后立即灌膠;當(dāng)室溫較高時,在加入ap之前,可將膠液放在4℃預(yù)冷,然后加入ap,混勻后立即灌膠。其中,步驟2中電泳條件為:設(shè)置電流的初始值為10-20ma,當(dāng)樣品進入分離膠后,將電流設(shè)置為20-40ma;或開始時恒壓60-80v,待樣品進入分離較厚,改為100v,當(dāng)膠版底端與染料前沿的間距為0.5cm時,電泳結(jié)束。其中,步驟4中質(zhì)譜參數(shù):毛細管溫度200℃,檢測方式:正離子。本發(fā)明還提供了鑒定出煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的氨基酸序列seqidno:1-6。其中seqidno:1-3為0號小種特異性蛋白肽段,seqidno:4-6為1號小種特異性蛋白肽段。附圖說明圖1是seqidno:1vhnieatfgeeefvgkk質(zhì)譜圖(0號小種)圖2是seqidno:2tlaefqnnpvdr質(zhì)譜圖(0號小種)圖3是seqidno:3fgentantvltk質(zhì)譜圖(0號小種)圖4是seqidno:4kgnddddeggnyssysgdm(oxidation)gggvhgsr質(zhì)譜圖(1號小種)圖5seqidno:5itfdesqvtyeellk質(zhì)譜圖(1號小種)圖6seqidno:6fndivlr質(zhì)譜圖(1號小種)具體實施方式本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提取煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的方法及鑒定的差異性肽段。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種提取煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的方法,其特征在于,包括以下步驟:第一步:提取黑脛病菌的總蛋白;第二步:以步驟1中得到的蛋白進行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳;第三步:根據(jù)步驟2得到的電泳膠圖挑選出差異條帶;第四步:將3獲取的條帶酶解,提取酶解肽段,進行l(wèi)c-ms分析;第五步:對質(zhì)譜結(jié)果采用mascot2.2軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫,獲得差異性蛋白肽段。其中,步驟1中制備提取液,每500μl真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物,4μl蛋白穩(wěn)定劑,混勻后置冰上備用。其中,步驟2中配制10%分離膠和4%濃縮膠,10%過硫酸銨(ap)應(yīng)最后加入,混勻后立即灌膠;當(dāng)室溫較高時,在加入ap之前,可將膠液放在4℃預(yù)冷,然后加入ap,混勻后立即灌膠。其中,步驟2中電泳條件為:設(shè)置電流的初始值為10-20ma,當(dāng)樣品進入分離膠后,將電流設(shè)置為20-40ma;或開始時恒壓60-80v,待樣品進入分離較厚,改為100v,當(dāng)膠版底端與染料前沿的間距為0.5cm時,電泳結(jié)束。其中,步驟4中質(zhì)譜參數(shù):毛細管溫度200℃,檢測方式:正離子。本發(fā)明還提供了鑒定出煙草黑脛病菌0/1號小種差異性蛋白肽段的氨基酸序列seqidno:1-6。其中seqidno:1-3為0號小種特異性蛋白肽段,seqidno:4-6為1號小種特異性蛋白肽段。以下采用實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方式,借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題,并達成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。煙草黑脛病菌0/1號生理小種蛋白提取及鑒定的差異性蛋白肽段第一步:菌株為煙草疫霉菌phytophthoranicotianae0號和1號生理小種,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護研究室分離純化保存。于28℃恒溫箱中固體燕麥培養(yǎng)基活化7天。第二步:提取黑脛病菌蛋白:制備提取液,每500μl冷的真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物,4μl蛋白穩(wěn)定劑,混勻后置冰上備用;取100mg黑脛病菌菌絲用液氮研磨,加入真菌蛋白提取液;混勻后,在4℃條件下振蕩15-20min;在4℃,14000rpm條件下離心15min;快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管,即可得到黑脛病菌總蛋白;將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。第三步:進行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳:(1)安裝垂直板電泳槽:按使用說明書操作。(2)配膠及凝膠板制備表1分離膠和濃縮膠成分分離膠(10%)濃縮膠(4%)ddh2o4.2ml3.1mlbuffer2.5ml1.25mlacr+bis30.8%3.2ml0.7ml10%sds100μl50μl分離膠的制備:按表1配制10ml10%的分離膠,混勻后用移液器將凝膠液加至長、短玻璃板間的狹縫內(nèi),約5cm(至梳子齒底端約1cm處);用1ml的移液器取適量的ddh2o,沿長玻璃板壁緩慢注入,約3-4mm高,以進行水封,使分離膠的上表面平整。約30min后,凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界限,則表示凝膠完全聚合,傾去封層的水,再用濾紙條吸干。注意:ap應(yīng)最后加入,混勻后立即灌膠;當(dāng)室溫較高時,在加入ap之前,可將膠液放在4℃預(yù)冷,然后加入ap,混勻后立即灌膠。濃縮膠制備:配制4%濃縮膠5ml并混合均勻,將濃縮膠用移液器加到分離膠(此時已聚合)上,玻璃板上邊緣距離約0.5cm停止倒膠,將樣品槽模板(梳子)插入濃縮膠內(nèi)時應(yīng)輕輕插,不要太多用力。約30min后凝膠聚合,再放置20-30min,使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板,用窄條濾紙吸去凹槽中多余的水分,從倒膠槽中取下膠板安裝固定在垂直電泳槽上,在上、下電極槽中倒入緩沖液tris-甘氨酸ph8.3并超過短板0.5cm,即可準(zhǔn)備加樣。(3)樣品的處理與加樣樣品的處理:將樣品液與樣品緩沖液等體積混勻后,在100℃沸水浴中保溫3-5min,取出冷卻加樣。加樣:在每個樣品槽的凹形處只加一種樣品蛋白質(zhì),如果是混合蛋白質(zhì)必須已知其相對的分子量,根據(jù)加樣蛋白質(zhì)的濃度和凝膠的厚度確定加樣體積,一般加樣體積為10-25μl(或5-15μg蛋白)。如果樣品較稀,可加大上樣量。用注射器針頭除去樣品槽中的氣泡。加樣時,將微量注射器的針頭盡量向加樣槽的底部輕輕加入,且針頭不能將凹形槽的膠面弄破,此步驟在電極緩沖液中操作。(4)電泳條件:設(shè)置電流的初始值為10-20ma,當(dāng)樣品進入分離膠后,將電流設(shè)置為20-40ma;或開始時恒壓60-80v,待樣品進入分離較厚,改為100v。當(dāng)膠版底端與染料前沿的間距為0.5cm時,電泳結(jié)束。(5)凝膠剝離與固定:結(jié)束電泳時,取出凝膠版,并抽出一半的封邊墊片,抽取時應(yīng)緩慢,不要膠弄破,然后再輕輕取出玻璃板,得到完整的凝膠。小心從下面的玻璃板上移除凝膠,將凝膠切下一角作為加樣標(biāo)志,將凝膠板放在大培養(yǎng)皿內(nèi),將固定液加入至培養(yǎng)皿中,緩慢轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)搖床2h。(6)染色與脫色:向培養(yǎng)皿中加入染色液,約1h后取出,應(yīng)多次進行漂洗時(固定液),再進行脫色(脫色液),當(dāng)看到清晰的蛋白質(zhì)條帶時結(jié)束脫色。(7)根據(jù)相對遷移率作圖,測算樣品亞基分子量。第四步:根據(jù)電泳圖找到各個地區(qū)黑脛病菌蛋白的差異條帶,進行質(zhì)譜檢測第五步:將4獲得的蛋白條帶進行fasp酶解→抽取酶解肽段→esi質(zhì)譜→軟件數(shù)據(jù)分析→鑒定蛋白質(zhì)。(1)fasp酶解:取部分樣品于100μl25mmnh4hco3,震蕩溶解。0.22μm濾膜過濾,加入30μlsdt(4%sds,100mmtris,100mmdtt,ph7.6)95℃,煮沸5分鐘,待冷卻后,加入200μlua(8murea,100mmtris,ph8.5),轉(zhuǎn)移至超濾管中,14000g離心15min,此步驟重復(fù)3次。加入100μl50mmiaa,室溫避光反應(yīng)30分鐘。加入100μlua溶液,14000g離心30min,此步驟重復(fù)3次。加入100μl25mmnh4hco3,14000g離心30分鐘,此步驟重復(fù)3次。加入4μgtrypsin,37℃反應(yīng)20h。換新離心管,離心14000g15min;再加入40μl25mmnh4hco3,離心14000g15min,收集濾液。肽段凍干后加入40μl0.1%甲酸復(fù)溶。(2)質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)庫檢索鑒定將肽指紋與串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合通過搜索工具proteomicsdiscovery1.4(thermo)針對數(shù)據(jù)庫uniprotphytophthoraparasitica進行檢索,檢索算法sequestht,母離子誤差:20ppm,子離子誤差:0.8da,漏切位點:2。獲得差異性蛋白肽段氨基酸序列及質(zhì)譜圖見圖1-6.所有上述的首要實施這一知識產(chǎn)權(quán),并沒有設(shè)定限制其他形式的實施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用這一重要信息,上述內(nèi)容修改,以實現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是,所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權(quán)利。以上所述,僅是本發(fā)明的較佳實施例而已,并非是對本發(fā)明作其它形式的限制,任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容,依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型,仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。當(dāng)前第1頁12