本發(fā)明屬于合成生物學(xué)領(lǐng)域，涉及工程化阻遏蛋白、超靈敏調(diào)控元件組和基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及它們的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：：合成生物學(xué)借助生物元件標(biāo)準(zhǔn)化和概念抽象對細(xì)胞進行“編程”，允許人工設(shè)計的基因網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行各種任務(wù)。近年來，隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系逐漸建立，基因電路(circuit)和通路(pathway)的可預(yù)測性大大提高，使得對蛋白節(jié)點、通路甚至網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)和動態(tài)控制成為可能。目前的一個研究熱點在于，將合成生物學(xué)用于對發(fā)酵工程中的細(xì)胞代謝通路進行動態(tài)調(diào)控[1-3]。人工構(gòu)建的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與天然網(wǎng)絡(luò)類似，常常利用變構(gòu)抑制或轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)反饋回路來調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá)，以改變代謝流[4]。例如，可利用合成網(wǎng)絡(luò)對響應(yīng)于外源刺激或內(nèi)源代謝產(chǎn)物的蛋白類型阻遏物(即阻遏蛋白)的動力學(xué)特性或蛋白-蛋白相互作用進行調(diào)整，實現(xiàn)對阻遏物動態(tài)調(diào)節(jié)性質(zhì)的優(yōu)化，從而提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。特別地，包含阻遏物的負(fù)反饋系統(tǒng)使得內(nèi)源代謝物能夠驅(qū)動“修復(fù)”電路，以自行調(diào)節(jié)的方式處理代謝異常從而維持體系穩(wěn)定[5-6]。然而，由于存在漏表達(dá)、希爾系數(shù)過小等問題，這些合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的性能常常并不令人滿意。現(xiàn)有技術(shù)通過對阻遏物進行工程化，改造天然網(wǎng)絡(luò)的動力學(xué)性質(zhì)。作為一個實例，枯草芽孢桿菌阻遏蛋白fapr對參與脂肪酸和磷脂代謝的多個基因進行負(fù)調(diào)控，其特異性結(jié)合至17bpdna序列，響應(yīng)于丙二酸單酰輔酶a這一重要化合物的濃度而變構(gòu)[7-8]。當(dāng)丙二酸單酰輔酶a的水平超過閾值，變構(gòu)后的fapr從操縱位點上解離下來，從而解除轉(zhuǎn)錄阻遏。借助這樣的方式，fapr起到脂肪酸生物合成狀態(tài)傳感器的作用。能夠通過將與fapr相關(guān)的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)網(wǎng)絡(luò)進行工程化[4]，或者在代謝通路中引入反饋調(diào)控[9]來提高產(chǎn)率。例如，xu等利用fapr的上述特性構(gòu)建了具有雙向開關(guān)性質(zhì)的整合式丙二酸單酰輔酶a傳感器。能夠通過加入不同數(shù)目的串聯(lián)的操縱序列fapo來改變傳感器對基于pgap的丙二酸單酰輔酶a的動態(tài)響應(yīng)的靈敏度，使得每一側(cè)開關(guān)打開時啟動子的飽和活性相匹配，從而脂肪酸的產(chǎn)量大幅提升[4]。這一優(yōu)異效果顯示了工程化的阻遏物在實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)調(diào)控方面的潛力，然而，該網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法很大程度上依賴于fapr的特定性質(zhì)，并不能普遍適用于對阻遏物進行工程化。此外，為了在基因網(wǎng)絡(luò)動態(tài)調(diào)控中實現(xiàn)超靈敏的開關(guān)式響應(yīng)，本領(lǐng)域仍需要諸如對響應(yīng)效率或阻遏物倍數(shù)變化等進行改進的簡單設(shè)計理念。最近的研究通過添加輔阻遏物結(jié)合位點對背景表達(dá)進行控制，以增強輸出的信噪比[10]。作為不同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明的發(fā)明人受到首個分離的開關(guān)樣轉(zhuǎn)錄阻遏物—λ噬菌體的ci蛋白以及細(xì)菌的laci蛋白[11-12]的啟發(fā)，將協(xié)同作用引入調(diào)控系統(tǒng)的設(shè)計，從而能夠構(gòu)建更為有效的基因開關(guān)。技術(shù)實現(xiàn)要素：在第一方面，本發(fā)明提供了一種提高阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄阻遏能力的方法，所述方法包 括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。在第二方面，本發(fā)明提供了一種阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含多聚化結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。在第三方面，本發(fā)明提供了一種提高基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靈敏度的方法，所述方法包括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的阻遏蛋白，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及將與所述阻遏蛋白相互作用的啟動子設(shè)置為包含與所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。在第四方面，本發(fā)明提供了一種改善宿主細(xì)胞中啟動子的開關(guān)性質(zhì)的方法，所述方法包括：將所述啟動子設(shè)置為包含一個或兩個操縱位點對；以及在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至所述操縱位點，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。在第五方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控元件組，所述調(diào)控元件組包含：阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及啟動子，所述啟動子包含與所述阻遏蛋白的所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。在第六方面，本發(fā)明提供了一種基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：第一基因，所述第一基因包含編碼阻遏蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及第二基因，所述第二基因包含編碼待被調(diào)控的蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述待被調(diào)控的蛋白，所述第二基因進一步包含啟動子序列，所述啟動子序列包含與所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。有益效果本發(fā)明在不破壞阻遏蛋白與其靶dna相互作用的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的前提下將ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域連入天然的阻遏蛋白，實現(xiàn)阻遏蛋白的二聚化、四聚化甚至八聚化。由于阻遏蛋白多聚化后，與該阻遏蛋白相互作用的啟動子序列附近的空間位阻增大，對rna聚合酶構(gòu)成的競爭性抑制更大，rna聚合酶結(jié)合的概率減小，因而能夠有效地降低漏表達(dá)。通過這樣的方式能夠提高阻遏蛋白的轉(zhuǎn)錄阻遏能力。特別地，如本發(fā)明優(yōu)選實施方式所展示的，通過對多聚化結(jié)構(gòu)域進行優(yōu)化，特別是使用ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域，與使用laci多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化蛋白相比，調(diào)控元件組中啟動子的開關(guān)性質(zhì)能夠得到進一步提高。在優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)借助工程化方法使得啟動子區(qū)域包含一個操縱位點對時，阻遏蛋白以四聚化形式結(jié)合至各操縱位點，啟動子區(qū)域的dna產(chǎn)生環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)。 進而，當(dāng)借助工程化方法使得啟動子區(qū)域包含兩個操縱位點對時，兩個四聚化的阻遏蛋白能夠再次發(fā)生二聚化，形成阻遏蛋白八聚體，使得啟動子區(qū)域的dna形成更緊的環(huán)，進一步升高轉(zhuǎn)錄起始所需的能量。該模塊化方法幾乎適用于對任何天然的負(fù)調(diào)控元件組的開關(guān)性能進行改進。本發(fā)明的方法不但能夠用于對天然包含操縱位點的啟動子進行改進，還可通過工程化方法將一個或兩個外源操縱位點對引入組成型表達(dá)的啟動子，并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的阻遏蛋白，構(gòu)建開關(guān)性能優(yōu)異的誘導(dǎo)型啟動子。通過這樣的方式，能夠解決困擾本領(lǐng)域已久的t7啟動子漏表達(dá)的問題。在優(yōu)選的實施方式中，通過對各操縱位點的間距進行優(yōu)化，使得阻遏蛋白結(jié)合至各操縱位點后啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點位于環(huán)內(nèi)側(cè)。這樣的拓?fù)錁?gòu)象使得空間位阻更大，能夠?qū)υ搯幼铀?qū)動的轉(zhuǎn)錄進行更為有效的阻遏。附圖說明圖1為根據(jù)本發(fā)明實施方式的調(diào)控元件組的設(shè)計原理圖。其中，工程化的阻遏蛋白由于帶有多聚化結(jié)構(gòu)域，能夠以多聚體的形式結(jié)合至結(jié)合位點(即操縱位點)。0+1型啟動子：啟動子僅有一個位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游的操縱位點。取決于阻遏蛋白的類型，阻遏蛋白以單體或二聚體形式結(jié)合至該啟動子以抑制轉(zhuǎn)錄。1+1型啟動子：啟動子具有一對分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游和下游的操縱位點。阻遏蛋白以四聚體形式結(jié)合至該啟動子以抑制轉(zhuǎn)錄。1+1+1+1型啟動子：啟動子具有兩個操縱位點對，一個操縱位點對位于轉(zhuǎn)錄起始位點遠(yuǎn)端的上游，另一個操縱位點對即1+1型啟動子中的操縱位點對。阻遏蛋白以八聚體形式結(jié)合至該啟動子以抑制轉(zhuǎn)錄。其中，將來自ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域添加至天然的阻遏蛋白，構(gòu)建工程化的阻遏蛋白；將不同數(shù)量的操縱位點添加至t7啟動子，構(gòu)建多種可調(diào)控的啟動子。阻遏蛋白結(jié)合至1+1型啟動子形成dna環(huán)。阻遏蛋白結(jié)合至1+1+1+1型啟動子形成更緊密的dna環(huán)。圖2示出各調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。(a)各phlf調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。(b)各lmra調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。數(shù)據(jù)點為實驗測量值，誤差棒示出來自三次獨立實驗的平均值±sd，實線為將測得數(shù)據(jù)點擬合至希爾方程，虛線為擬合方程的延伸線。插圖示出各曲線的希爾系數(shù)，插圖中的柱狀圖從左至右分別對應(yīng)于圖例中從上至下所標(biāo)示出的輸入輸出曲線。圖3示出各調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。(a)采用不同寡聚化結(jié)構(gòu)域的cymr調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。(b)采用不同的連接肽長度的cymr調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。(c)采用不同的o2-o3間距的lmra調(diào)控元件組的輸入輸出曲線。數(shù)據(jù)點為實驗測量值，誤差棒示出來自三次獨立實驗的平均值±sd。圖4示出九種工程化的阻遏蛋白在與0+1型或1+1型啟動子組合時的輸入輸出曲線以及希爾系數(shù)的改變。黑色示出由工程化的阻遏蛋白與1+1型啟動子所組成的調(diào)控元件組?；疑境鲇晒こ袒淖瓒舻鞍着c0+1型啟動子所組成的調(diào)控元件組。各子圖左上角的數(shù)字顯示了1+1型啟動子較0+1型啟動子的輸入輸出曲線希爾系數(shù)改善情況。數(shù)據(jù)點為實驗測量值，誤差棒示出來自三次獨立實驗的平均值±sd，實線為將測得數(shù)據(jù)點擬合至希爾方程，虛線為擬合方程的延伸線。圖5示出多聚化結(jié)構(gòu)域?qū)τ诳烧T導(dǎo)啟動子誘導(dǎo)性能的影響。(a)cymr調(diào)控元件組；(b)phlf調(diào)控元件組。橫軸為誘導(dǎo)劑的濃度，縱軸為輸出。iptg濃度表明阻遏 蛋白的相對含量。數(shù)據(jù)點為實驗測量值，誤差棒示出來自三次獨立實驗的平均值±sd，實線為將測得數(shù)據(jù)點擬合至希爾方程。具體實施方式在第一方面，本發(fā)明提供了一種提高阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄阻遏能力的方法，所述方法包括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。已知在基因調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)通過與dna上特定的位點結(jié)合來控制轉(zhuǎn)錄。利用通過調(diào)節(jié)物與dna特定位點的結(jié)合以關(guān)閉或降低靶基因的表達(dá)活性的方式對靶基因進行調(diào)節(jié)的系統(tǒng)稱為負(fù)調(diào)控系統(tǒng)。負(fù)調(diào)控系統(tǒng)一般包含操縱基因/操縱位點(operator)和阻遏蛋白(repressor)。操縱基因為能夠與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，使得靶基因的轉(zhuǎn)錄活性得以控制的dna片段。操縱基因一般位于靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點附近，或者空間上與轉(zhuǎn)錄起始位點鄰近(例如，操縱基因序列與啟動子核心序列距離較遠(yuǎn)，然而當(dāng)諸如阻遏蛋白的調(diào)節(jié)蛋白多聚化時，與阻遏蛋白多聚物結(jié)合的操縱位點被“抓”到啟動子核心序列附近)。阻遏蛋白為負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中由調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白，其與操縱位點結(jié)合時抑制rna聚合酶與啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而阻止或減弱靶基因的轉(zhuǎn)錄。在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合時，靶基因轉(zhuǎn)錄。最典型的負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)為乳糖操縱子。在沒有乳糖存在時，由于阻遏蛋白laci與操縱位點laco結(jié)合，對rna聚合酶構(gòu)成競爭性抑制，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。然而，由于阻遏蛋白和操縱基因有一定概率分離，即使在操縱子處于關(guān)閉狀態(tài)的情況下，每個細(xì)胞仍可能會有數(shù)個分子的β-半乳糖苷酶和透過酶生成。而當(dāng)環(huán)境中存在乳糖時，經(jīng)少量的透過酶轉(zhuǎn)運及β-半乳糖苷酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶的催化，乳糖在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為異乳糖，后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使阻遏蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與laco序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使β-半乳糖苷酶分子增加1000倍。通過這樣的方式，使得與乳糖的轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因由“關(guān)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_”。λ噬菌體的ci阻遏蛋白是λ噬菌體發(fā)生溶原途徑和裂解途徑有效轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控子。ci阻遏蛋白由兩個具有獨特結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域組成：n末端結(jié)構(gòu)域為dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠與or和ol操縱位點結(jié)合[13]以及與rna聚合酶接觸[14]；c末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)自組裝，從而形成同源二聚體及隨后的四聚體或八聚體。由于or1和or2的間距允許與這兩個操縱位點結(jié)合的ci蛋白自組裝為四聚體，第一ci二聚體與or1的結(jié)合能夠促進第二ci二聚體與or2的結(jié)合。進而，在ci濃度較高的情況下，ci二聚體能夠結(jié)合于or下游2000bp處ol操縱位點的ol1與ol2，與or1和or2以及ol1和ol2結(jié)合的各ci二聚體發(fā)生八聚化[15-16]。ci的此類高階多聚化能力允許對彼此鄰近[17]或相對遠(yuǎn)離[18]的操縱位點進行協(xié)同調(diào)控。結(jié)構(gòu)的建模[20]和突變實驗[19]均表明，ci多聚物的結(jié)合具有協(xié)同作用。類似地，laci介導(dǎo)的dna成環(huán)采用的也是與ci類似但更小的多聚化結(jié)構(gòu)域，以及合理分布的阻遏物結(jié)合位點[21]。特別是，當(dāng)dna成環(huán)時啟動子位于環(huán)的內(nèi)側(cè)，阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的阻礙作用更強[22-23]。阻遏物的多聚化能夠?qū)崿F(xiàn)更高的阻遏效率，從而提高轉(zhuǎn)錄的信噪比。本領(lǐng)域已發(fā)現(xiàn)多種與ci阻遏蛋白結(jié)構(gòu)類似的來自噬菌體的阻遏物，統(tǒng)稱為ci家族阻遏蛋白(comparativemolecularbiologyoflambdoidphages，a.campbell，annu. rev.microbiol.1994.48:193-222；determinationofcellfateselectionduringphagelambdainfection，st-pierre，2009，博士論文)。所述ci家族阻遏蛋白包括例如ci、ci434、hk022ci、tp901ci和p22c2。上述ci、ci434、hk022ci、tp901ci和p22c2的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為本領(lǐng)域所知曉，分別如seqidno：1-seqidno：5所示。本發(fā)明通過將ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域添加至阻遏蛋白的末端構(gòu)建工程化的阻遏蛋白，使得阻遏蛋白能夠發(fā)生多聚化(例如二聚化、四聚化和/或八聚化)。這種多聚化的能力并不依賴于阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)，且并不影響阻遏蛋白與其操縱位點的相互作用，因此可作為提高阻遏蛋白阻遏效率的模塊化方法。如本發(fā)明實施例所展示的，即便在dna上僅存在一個操縱位點，由于空間位阻的增大，在阻遏蛋白的表達(dá)量相同時，對rna聚合酶的阻擋能力也更優(yōu)。本發(fā)明所使用的術(shù)語“阻遏蛋白(repressor)”具有本領(lǐng)域公知的含義，指的是能識別特定的操縱位點，并且當(dāng)與操縱序列結(jié)合時rna聚合酶與啟動子序列的結(jié)合受到阻礙或rna聚合酶不能沿dna向前移動，因此對轉(zhuǎn)錄構(gòu)成抑制的蛋白。本文中，術(shù)語“操縱基因”、“操縱位點”和“操縱序列”可互換使用，指的是與阻遏蛋白結(jié)合時抑制轉(zhuǎn)錄的dna序列。需要指出的是，本發(fā)明并不是必須在操縱子的上下文中使用。對于啟動子僅控制一個靶基因的情況，也可用本發(fā)明的阻遏蛋白構(gòu)建方法進行調(diào)控。就這一點而言，本發(fā)明的方法、調(diào)控系統(tǒng)和阻遏蛋白同等適用于原核和真核宿主。如果核酸分子(如dna)包含含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息的核苷酸序列、而且這樣的序列“可操作地連接”至編碼多肽的核苷酸序列，則該核酸分子(如dna)被稱為“能夠表達(dá)”所述多肽?？刹僮鞯倪B接是調(diào)控dna序列與旨在被表達(dá)的dna序列通過“允許基因以可回收的量表達(dá)為肽或抗體部分”的方式相連接的連接?；虮磉_(dá)所需的調(diào)控區(qū)的精確性質(zhì)可能因生物體不同而不同，這在類似領(lǐng)域中是公知的。參見例如sambrook等，1989；ausubel等，1987-1993。就將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域而言，只要不破壞阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合，可將多聚化結(jié)構(gòu)域直接連接至阻遏蛋白的n端或c端，或使用連接肽將多聚化結(jié)構(gòu)域連接至阻遏蛋白的n端或c端。連接肽為柔性，不包含任何活性結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選由甘氨酸和/或絲氨酸組成。如本發(fā)明實施例所展示的，事實上連接肽的長度對工程化的阻遏蛋白的影響極其有限，并可為任意長度。在一個實施方式中，連接肽的序列為ggggsggggs(seqidno：6)。在第二方面，本發(fā)明提供了一種阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含多聚化結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于天然或經(jīng)人工修飾的阻遏蛋白，能夠與dna結(jié)合并行使阻礙轉(zhuǎn)錄的功能。如上所述，所述多聚化結(jié)構(gòu)域能夠使得多個阻遏物(例如阻遏蛋白)發(fā)生自組裝，產(chǎn)生協(xié)同作用。在一些實施方式中，可利用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域和所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連。連接肽的選擇如本文其它部分所述。在第三方面，本發(fā)明提供了一種提高基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靈敏度的方法，所述方法包括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的阻遏蛋白，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及將與所述阻遏蛋白相互作用的啟動子設(shè)置為包含與所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。在第四方面，本發(fā)明提供了一種改善宿主細(xì)胞中啟動子的開關(guān)性質(zhì)的方法，所述方法包括：將所述啟動子設(shè)置為包含一個或兩個操縱位點對；以及在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至所述操縱位點，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。在第五方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控元件組，所述調(diào)控元件組包含：阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及啟動子，所述啟動子包含與所述阻遏蛋白的所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。在第六方面，本發(fā)明提供了一種基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：第一基因，所述第一基因包含編碼阻遏蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及第二基因，所述第二基因包含編碼待被調(diào)控的蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述待被調(diào)控的蛋白，所述第二基因進一步包含啟動子序列，所述啟動子序列包含與所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。本文使用的術(shù)語基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(generegulationnetwork)具有本領(lǐng)域公知的含義，指的是生物體內(nèi)控制基因表達(dá)的機制。基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靈敏度被定義為對于誘導(dǎo)物濃度變化的響應(yīng)。對于超靈敏的網(wǎng)絡(luò)，啟動子對誘導(dǎo)物的濃度在很窄范圍內(nèi)的變化具有快速響應(yīng)的能力。在閾值之上誘導(dǎo)物濃度的微小變化即可快速激活轉(zhuǎn)錄通路，因此其響應(yīng)曲線常類似于典型的階躍式響應(yīng)，即呈現(xiàn)“開關(guān)”特性(achimescus，lipano.signalpropagationinnonlinearstochasticgeneregulatorynetworks.systemsbiology，ieeproceedings，2006，153(3)：120-134)。由于誘導(dǎo)響應(yīng)曲線常為反s形，通常將其擬合為希爾方程(例如實施例部分的方程5的形式)。希爾系數(shù)越大，說明超敏區(qū)間越小，靈敏度越高，表明網(wǎng)絡(luò)的“開關(guān)(switch)”性能越好。如上所述，通過使得待被調(diào)控基因的啟動子包含一個或兩個操縱位點對，阻遏蛋白能夠以四聚物或八聚物的形式結(jié)合至啟動子序列，抑制rna聚合酶與啟動子的結(jié)合。在優(yōu)選的實施方式中，針對ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域，對原核宿主中操縱位點對的間距進行優(yōu)化；然而需要指出的是，雖然真核生物的核心啟動子的結(jié)構(gòu)與原核生物不同，啟動子的長度也有差別，然而，通過調(diào)節(jié)操縱位點的位置，仍能夠?qū)崿F(xiàn)阻遏蛋白在啟動子區(qū)域的多聚化。在一些實施方式中，將與諸如阻遏蛋白的阻遏物相互作用的啟動子設(shè)置為包含與所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個操縱位點對。所述操縱位點對可同時 位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游，或分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)。優(yōu)選地，所述操縱位點對分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)。優(yōu)選地，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔使得所述阻遏蛋白以四聚體形式與所述操縱位點對結(jié)合后形成環(huán)時，所述操縱位點對位于所述環(huán)的同側(cè)。優(yōu)選地，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。通過這樣的方式，阻遏蛋白以四聚體形式與啟動子結(jié)合。在一些實施方式中，將與諸如阻遏蛋白的阻遏物相互作用的啟動子設(shè)置為包含與所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的兩個操縱位點對。其中，一個操縱位點對均位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游、或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；另一個操縱位點對均位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。優(yōu)選地，一個操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，而另一個操縱位點對均位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。優(yōu)選地，各操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。所述兩個操縱位點對之間的間隔為大于150bp、優(yōu)選大于200bp。在間隔大于150bp的情況下，由于已形成特別緊密的環(huán)，無需特別考慮啟動子序列附近的構(gòu)象，也無需特別考慮間隔的長度。另外，需要指出的是，上述僅出于補足間隔堿基數(shù)的目的而插入的序列只要不具有啟動子活性即可，并無特別的限制，例如可為隨機生成的序列。通過這樣的方式，阻遏蛋白以八聚體形式與啟動子結(jié)合。術(shù)語“啟動子”指的是起始某個基因轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域，位于所述基因轉(zhuǎn)錄起始位點的同義鏈上游。就原核生物而言，啟動子一般包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域(例如可誘導(dǎo)啟動子)、rna聚合酶識別區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點。術(shù)語“最小啟動子”指的是能夠起始轉(zhuǎn)錄的最小轉(zhuǎn)錄控制單元，例如僅包含rna聚合酶識別區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點的啟動子核心區(qū)域。在本發(fā)明中，通過將一個操縱位點、一個操縱位點對或兩個操縱位點對添加至最小啟動子的上游和/或下游，構(gòu)造開關(guān)性能優(yōu)異的可誘導(dǎo)啟動子。這樣構(gòu)造的嵌合啟動子中操縱位點的位置如上所述。本文所述各方面的實施方式可由如下編號的段落說明：1.一種提高阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄阻遏能力的方法，所述方法包括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。2.如段落1所述的方法，其中，所述ci家族阻遏蛋白為ci、ci434、hk022ci、tp901ci或p22c2。3.如段落2所述的方法，其中，所述ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno：1-seqidno：5中的任一種。4.如段落1-3中任一項所述的方法，其中，將所述多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的c端。5.如段落1-4中任一項所述的方法，其中，直接將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。6.如段落1-4中任一項所述的方法，其中，使用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。7.如段落6所述的方法，其中，所述連接肽的長度為1-20個氨基酸，優(yōu)選具有 seqidno：6的序列。8.一種阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含多聚化結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。9.如段落8所述的阻遏蛋白，其中，所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自于天然或經(jīng)人工修飾的阻遏蛋白。10.如段落8或9所述的阻遏蛋白，其中，所述ci家族阻遏蛋白為ci、ci434、hk022ci、tp901ci或p22c2。11.如段落10所述的阻遏蛋白，其中，所述ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno：1-seqidno：5中的任一種。12.如段落8-11中任一項所述的阻遏蛋白，其中，將所述多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的c端。13.如段落8-12中任一項所述的阻遏蛋白，其中，直接將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。14.如段落8-12中任一項所述的阻遏蛋白，其中，使用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。15.如段落14所述的阻遏蛋白，其中，所述連接肽的長度為1-20個氨基酸，優(yōu)選具有seqidno：6的序列。16.一種提高基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靈敏度的方法，所述方法包括：將多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的阻遏蛋白，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及將與所述阻遏蛋白相互作用的啟動子設(shè)置為包含與所述阻遏蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。17.一種改善宿主細(xì)胞中啟動子的開關(guān)性質(zhì)的方法，所述方法包括：將所述啟動子設(shè)置為包含一個或兩個操縱位點對；以及在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至所述操縱位點，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組。18.如段落17所述的方法，其中，所述啟動子為t7啟動子。19.如段落16-18中任一項所述的方法，其中，所述ci家族阻遏蛋白為ci、ci434、hk022ci、tp901ci或p22c2。20.如段落19所述的方法，其中，所述ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno：1-seqidno：5中的任一種。21.如段落16-20中任一項所述的方法，其中，將所述多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的c端。22.如段落16-21中任一項所述的方法，其中，直接將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。23.如段落16-21中任一項所述的方法，其中，使用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。24.如段落23所述的方法，其中，所述連接肽的長度為1-20個氨基酸，優(yōu)選具有 seqidno：6的序列。25.如段落16-24中任一項所述的方法，所述啟動子包含一個操縱位點對，其中，所述操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游，或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；優(yōu)選地，所述操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)。26.如段落25所述的方法，其中，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔使得所述阻遏蛋白以四聚體形式與所述操縱位點對結(jié)合后形成環(huán)時，所述操縱位點對位于所述環(huán)的同側(cè)。27.如段落25所述的方法，其中，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。28.如段落16-24中任一項所述的方法，所述啟動子包含兩個操縱位點對，其中，第一操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游、或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游；優(yōu)選地，第一操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。29.如段落28所述的方法，其中，各操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。30.如段落29所述的方法，其中，所述第一操縱位點對和所述第二操縱位點對之間的間隔為大于150bp、優(yōu)選大于200bp。31.一種調(diào)控元件組，所述調(diào)控元件組包含：阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及啟動子，所述啟動子包含與所述阻遏蛋白的所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。32.如段落31所述的調(diào)控元件組，其中，所述ci家族阻遏蛋白為ci、ci434、hk022ci、tp901ci或p22c2。33.如段落32所述的調(diào)控元件組，其中，所述ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno：1-seqidno：5中的任一種。34.如段落31-33中任一項所述的調(diào)控元件組，其中，將所述多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的c端。35.如段落31-34中任一項所述的調(diào)控元件組，其中，直接將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。36.如段落31-34中任一項所述的調(diào)控元件組，其中，使用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。37.如段落36所述的調(diào)控元件組，其中，所述連接肽的長度為1-20個氨基酸，優(yōu)選具有seqidno：6的序列。38.如段落31-37中任一項所述的調(diào)控元件組，所述啟動子包含一個操縱位點對，其中，所述操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游，或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；優(yōu)選地，所述操縱位點對分別位于所述啟動子 的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)。39.如段落38所述的調(diào)控元件組，其中，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔使得所述阻遏蛋白以四聚體形式與所述操縱位點對結(jié)合后形成環(huán)時，所述操縱位點對位于所述環(huán)的同側(cè)。40.如段落38所述的調(diào)控元件組，所述操縱位點對位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；優(yōu)選地，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。41.如段落31-37中任一項所述的調(diào)控元件組，所述啟動子包含兩個操縱位點對，其中，第一操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游、或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游；優(yōu)選地，第一操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。42.如段落41所述的調(diào)控元件組，其中，各操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。43.如段落42所述的調(diào)控元件組，其中，所述第一操縱位點對和所述第二操縱位點對之間的間隔為大于150bp、優(yōu)選大于200bp。44.一種基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：第一基因，所述第一基因包含編碼阻遏蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域，其中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域選自于由ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域所組成的組；以及第二基因，所述第二基因包含編碼待被調(diào)控的蛋白的序列，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述待被調(diào)控的蛋白，所述第二基因進一步包含啟動子序列，所述啟動子序列包含與所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的一個或兩個操縱位點對。45.如段落44所述的系統(tǒng)，其中，所述第二基因為與代謝通路相關(guān)的基因。46.如段落44或45所述的系統(tǒng)，其中，所述ci家族阻遏蛋白為ci、ci434、hk022ci、tp901ci或p22c2。47.如段落46所述的系統(tǒng)，其中，所述ci家族阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno：1-seqidno：5中的任一種。48.如段落44-47中任一項所述的系統(tǒng)，其中，將所述多聚化結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的c端。49.如段落44-48中任一項所述的系統(tǒng)，其中，直接將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。50.如段落44-48中任一項所述的系統(tǒng)，其中，使用連接肽將所述多聚化結(jié)構(gòu)域連接至所述dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。51.如段落50所述的系統(tǒng)，其中，所述連接肽的長度為1-20個氨基酸，優(yōu)選具有seqidno：6的序列。52.如段落44-51中任一項所述的系統(tǒng)，所述啟動子包含一個操縱位點對，其中，所述操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游，或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；優(yōu)選地，所述操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄 起始位點的兩側(cè)。53.如段落52所述的系統(tǒng)，其中，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔使得所述阻遏蛋白以四聚體形式與所述操縱位點對結(jié)合后形成環(huán)時，所述操縱位點對位于所述環(huán)的同側(cè)。54.如段落52所述的系統(tǒng)，所述操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)；優(yōu)選地，所述操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。55.如段落44-51中任一項所述的系統(tǒng)，所述啟動子包含兩個操縱位點對，其中，第一操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游、或分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游；優(yōu)選地，第一操縱位點對分別位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的兩側(cè)，第二操縱位點對同時位于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。56.如段落55所述的系統(tǒng)，其中，各操縱位點對中兩個操縱位點之間的間隔為40-70bp、優(yōu)選50-70bp。57.如段落56所述的系統(tǒng)，其中，所述第一操縱位點對和所述第二操縱位點對之間的間隔為大于150bp、優(yōu)選大于200bp。實施例本發(fā)明的實施例對現(xiàn)有技術(shù)中已知的9種完全不同的野生型阻遏蛋白及其操縱位點進行工程化，制備具有不同轉(zhuǎn)錄控制強度的超靈敏轉(zhuǎn)錄控制元件，對將多聚化結(jié)構(gòu)域加入阻遏蛋白和/或在啟動子區(qū)域添加操縱位點所獲得的效果進行展示。所述野生型阻遏蛋白及其操縱位點如表1所示。表1野生型阻遏蛋白及其對應(yīng)的操縱位點序列1.阻遏蛋白的工程化將ci多聚化結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于ci蛋白的第136-236位氨基酸，編碼該結(jié)構(gòu)域的dna序列為seqidno：25)或ci434多聚化結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于ci434蛋白的第70-210位氨基酸，編碼該結(jié)構(gòu)域的dna序列為seqidno：26)融合至表1示出的野生型阻遏蛋白。除非另有說明，用柔性短連接肽(對應(yīng)的編碼序列為seqidno：27)將二者相連，構(gòu)建能夠多聚化的阻遏蛋白。作為對照，將laci多聚化結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于laci蛋白的第341-360位氨基酸，編碼該結(jié)構(gòu)域的dna序列為seqidno：28)融合至野生型阻遏蛋白，并用柔性短連接肽(對應(yīng)的編碼序列為seqidno：27)將二者相連，構(gòu)建能夠多聚化的阻遏蛋白。在各附圖中，以“-wt”表示野生型阻遏蛋白，以“-ci”表示在c端添加有ci多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化阻遏蛋白，以“-ci434”表示在c端添加有ci434多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化阻遏蛋白，以“-laci”表示在c端添加有l(wèi)aci多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化阻遏蛋白。2.具有不同操縱位點的啟動子的構(gòu)建如圖1所示，在t7野生型啟動子核心區(qū)域(即核心啟動子或最小啟動子，序列為seqidno：29)的上游和/或下游添加操縱位點，構(gòu)建如下四種啟動子：野生型t7啟動子；0+1型啟動子：啟動子區(qū)域僅存在一個位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游的操縱位點；1+1型啟動子：啟動子區(qū)域存在一個操縱位點對，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游和下游；1+1+1+1型啟動子：啟動子區(qū)域存在兩個操縱位點對，一個操縱位點對同時位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游，另一個操縱位點對分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游和下游。此外，將t7rna聚合酶整合入細(xì)胞，使得細(xì)胞表達(dá)足夠水平的t7rna聚合酶。就0+1型啟動子而言，操縱位點(o1)位于最小啟動子下游并與t7最小啟動子相接。就1+1型啟動子而言，為了保證兩個二聚化阻遏蛋白分別結(jié)合在dna螺旋的相互分離的同側(cè)位點以制造環(huán)結(jié)構(gòu)，將1+1型啟動子的阻遏蛋白結(jié)合位點間的距離設(shè)置為約4至6個dna螺距。早期的研究發(fā)現(xiàn)，ci蛋白協(xié)同性地結(jié)合至被5或6圈螺旋分開的一個操縱位點對[24]。進而，becker等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使得啟動子在兩個操縱位點間以數(shù)bp移動時，報告子的活性具有周期性，這表明當(dāng)啟動子處于不利的緊密的dna環(huán)的內(nèi)表面時，能夠?qū)崿F(xiàn)更強的阻遏[23]?？紤]這一點，我們將一個操縱位點(o1)置于t7最小啟動子下游并與該t7最小啟動子相接，而將另一個操縱位點(o2)置于啟動子上游，并使得o1與o2的中心間距約為40-70bp(具體參見表2)。通過這種方式，保證在兩個方向上阻遏蛋白均與t7rna聚合酶發(fā)生競爭，且啟動子處成環(huán)的空間位阻更支持朝向dna環(huán)的內(nèi)側(cè)。需要指出的是，僅出于占位考慮在o2和t7最小啟動子之間添加的序列為隨機序列，經(jīng)預(yù)測軟件驗證無啟動子活性。就1+1+1+1型啟動子而言，考慮到隨著上游的操縱序列增多，天然ci阻遏蛋白能夠形成八聚體，從而形成更緊密的dna環(huán)[19]，我們希望通過在啟動子上游添加更多的操縱位點，實現(xiàn)工程化阻遏蛋白的更高階多聚化(例如八聚化)，進一步改進調(diào)控元件組的開關(guān)性能。1+1+1+1型啟動子包括4個相同的阻遏蛋白結(jié)合位點(即操縱序列)。其中，第一操縱位點(o1)與第二操縱位點(o2)的設(shè)置與1+1型啟動子相同，第三操縱位點(o3)與第四操縱位點(o4)的中心間距為50bp。除另有標(biāo)示外，將o2與o3間的隨機序列長度設(shè)置為約200bp(198bp)。實施例中構(gòu)建的0+1型和1+1型啟動子如表2所示。其中，黑體部分為操縱序列(即表1的seqidno：16-seqidno：24)，斜體部分為t7核心啟動子(即seqidno：29)，其它(小寫字母)為用于維持操縱位點間距的隨機序列。表2工程化啟動子3.測量體系的構(gòu)建為了測量輸入(阻遏蛋白)-輸出(啟動子)響應(yīng)曲線，以sfgfp(對應(yīng)的編碼序 列為seqidno：30)作為報告子連入本發(fā)明構(gòu)建的啟動子的下游，以sfgfp的熒光量作為各啟動子的輸出信號。另一方面，將處于ptac啟動子(具有較低的漏表達(dá))的控制下的野生型或工程化的lmra、phlf、amtr、yefm、cymr、maze、cro、fapr、trpr阻遏蛋白以及組成型過表達(dá)的laci插入同一rgp低拷貝質(zhì)粒(seqidno：31)(詳見下文材料和方法部分)。通過這樣的方式利用不同濃度的iptg誘導(dǎo)來控制野生型或工程化阻遏蛋白的表達(dá)量。4.多聚化對調(diào)控性能的影響為了研究多聚化是否能夠增強阻遏性能，我們測量了不同組合的輸入輸出響應(yīng)曲線：野生型阻遏蛋白/工程化的阻遏蛋白與0+1型啟動子(阻遏蛋白單體或二聚化)、1+1型啟動子(阻遏蛋白四聚化)或1+1+1+1型啟動子(阻遏蛋白八聚化)的不同組合。如圖2(a)所示，由1+1型啟動子和野生型phlf阻遏蛋白組成的調(diào)控元件組(希爾系數(shù)為1.77)與由0+1型啟動子和野生型phlf阻遏蛋白組成的調(diào)控元件組(希爾系數(shù)為1.93)的性能幾乎完全一致。這說明在缺少多聚化結(jié)構(gòu)域的情況下，即便阻遏蛋白能夠分別結(jié)合在兩個操縱位點，由于沒有協(xié)同作用且與核心啟動子有一定距離，o2幾乎不能行使調(diào)控的作用。與此相反地，與由0+1型啟動子和添加ci434多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化phlf阻遏蛋白組成的調(diào)控元件組(希爾系數(shù)為2.18)相比，由1+1型啟動子和添加ci434多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化phlf阻遏蛋白組成的調(diào)控元件組(希爾系數(shù)為3.42)的開關(guān)性能具有明顯改善。這表明1+1型啟動子的上游和下游結(jié)合位點允許形成phlf四聚體，其對t7rna聚合酶與啟動子結(jié)合的阻擋更強。作為另一實例，如圖2(b)所示，工程化的lmra阻遏蛋白與0+1型啟動子或與1+1型啟動子組合使用時(希爾系數(shù)分別為1.44和3.89)顯示出與工程化的phlf相同的趨勢。需要指出的是，工程化的lmra阻遏蛋白配合0+1型啟動子(希爾系數(shù)為1.44)比野生型lmra阻遏蛋白配合0+1型啟動子(希爾系數(shù)為0.83)的阻遏能力更強，這可能是由于工程化阻遏蛋白的多聚化結(jié)構(gòu)域招募了更多阻遏蛋白，從而阻遏蛋白的局域濃度上升，造成更大的空間阻力?？紤]到這一點，工程化調(diào)控元件組的性能改善可歸因于如下兩點：(1)由各阻遏蛋白在1+1型啟動子上四聚化造成的dna環(huán)化；以及(2)多聚化結(jié)構(gòu)域本身吸引更多的阻遏蛋白，從而阻遏蛋白在局域發(fā)生富集。為了對該阻遏性能的改進進行定量分析，我們用最小二乘法，以阻遏型希爾方程作為模型對數(shù)據(jù)進行擬合(參見下文方法部分)，用希爾系數(shù)(以n表示)對這些構(gòu)建體的調(diào)控性能進行定量表征。希爾系數(shù)越高，由于協(xié)同作用造成誘導(dǎo)曲線越陡，表明調(diào)控元件組越靈敏。例如，如圖2(b)的插圖所示，lmra-ci434阻遏蛋白配合0+1型啟動子時(二聚化)的希爾系數(shù)是1.44、配合1+1型啟動子時(四聚化)的希爾系數(shù)是3.89、而配合1+1+1+1型啟動子時(八聚化)的希爾系數(shù)是5.19。這表明與野生型(單體)配合0+1型啟動子相比，僅通過多聚化增大位阻即可將靈敏度提高73％；通過使得阻遏蛋白四聚化可再將靈敏度提高170％；而通過使得阻遏蛋白八聚化可進一步將靈敏度提高33％。這些結(jié)果證實ci434多聚化結(jié)構(gòu)域使得阻遏蛋白多聚化，然而其并不改變阻遏蛋白和dna之間的特異性結(jié)合親和力以及dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。可見，與阻遏蛋白二聚化或單體結(jié)合至單個啟動子相比，使得調(diào)控元件組具有2個或4個操縱位點時，阻遏蛋白能夠發(fā)生高階多聚化(四聚化或八聚化)，從而能夠在啟 動子區(qū)域產(chǎn)生環(huán)結(jié)構(gòu)。這樣的設(shè)置使得啟動子關(guān)閉的更嚴(yán)。并且，由于多聚化帶來協(xié)同性，此類構(gòu)建體的劑量響應(yīng)曲線更陡，其希爾系數(shù)更大，表明啟動子的靈敏度更好。5.多聚化結(jié)構(gòu)域的種類對劑量響應(yīng)曲線靈敏度的影響如圖3(a)所示，對于工程化的cymr而言，與野生型cymr相比，具有ci以及ci434多聚化結(jié)構(gòu)域的阻遏蛋白均表現(xiàn)出明顯的超靈敏度。然而，融合有來自laci多聚化結(jié)構(gòu)域的cymr的性能并不令人滿意：cymr-laci0+1與cymr-laci1+1調(diào)控元件組的性能幾乎沒有差別，表明該條件下融合有l(wèi)aci多聚化結(jié)構(gòu)域的阻遏蛋白并不能實現(xiàn)很好的四聚化。猜測這是由于位于lacic末端20個氨基酸的多聚化結(jié)構(gòu)域較小，本身多聚化能力較弱，或易受所融合的阻遏蛋白空間結(jié)構(gòu)影響而無法發(fā)揮多聚化功能。6.連接肽對工程化阻遏蛋白的性能的影響天然的ci或ci434蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域之間均具有較短的柔性連接肽(約40aa)，且連接肽的溶蛋白性裂解破壞形成四聚體的能力[15]。鑒于此，我們研究了連接肽長度對于阻遏性能的影響。使用三種長度的連接肽將ci434多聚化結(jié)構(gòu)域連接至天然的cymr阻遏蛋白的c端來構(gòu)建融合阻遏蛋白，所述三種連接肽分別為兩個連續(xù)的ggggs連接肽(ggggs)2(10aa)、單個ggggs連接肽(5aa)和沒有連接肽。如圖3(b)所示，柔性連接肽的加長僅可稍稍改善阻遏性能，其中，(gs)對應(yīng)于單個ggggs連接肽；(gs)2對應(yīng)于兩個連續(xù)的ggggs連接肽(ggggs)2。此外，即便沒有連接肽，工程化的阻遏蛋白仍能夠?qū)崿F(xiàn)四聚化?？梢哉f，在本發(fā)明的情況下，(ggggs)2的長度和柔性對于實現(xiàn)本發(fā)明的效果而言均是足夠的。7.遠(yuǎn)端操縱位點間距對調(diào)控性能的影響如上所述，遠(yuǎn)端操縱位點o3和o4的加入使得啟動子區(qū)域能夠形成具有更復(fù)雜dna環(huán)的八聚體阻遏蛋白。為了研究遠(yuǎn)端操縱位點的設(shè)定位置與調(diào)控性能的關(guān)系，將o2與o3之間的間隔序列設(shè)置為三種長度(約200、約500和約700bp)。上述間隔序列為經(jīng)預(yù)測驗證無啟動子活性的隨機序列。其中，所述約700bp隨機序列(實際長度692bp)參見seqidno：32；所述約500bp隨機序列(實際長度522bp)為seqidno：32的第1位-522位核苷酸；所述約200bp隨機序列(實際長度198bp)為seqidno：32的第1位-198位核苷酸。需要指出的是，由于間隔序列較長，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也更加不可控，在這種情況下無需考慮核心啟動子位于環(huán)的內(nèi)側(cè)還是外側(cè)。如圖3(c)所示，改變長距離啟動子o3/o4與o1/o2的間距并不會對誘導(dǎo)曲線產(chǎn)生太大影響。事實上，當(dāng)o2與o3的間距分別約為200、500和700bp時，均能實現(xiàn)較好的輸入-輸出響應(yīng)。8.本發(fā)明方法的普適性驗證對于本實施例所構(gòu)建的九種工程化的阻遏蛋白，分別構(gòu)建包含其操縱位點的0+1或1+1型啟動子。如圖4所示，對于所采用的九種不同的阻遏蛋白，通過使得阻遏蛋白能夠多聚化，并在啟動子區(qū)域引入多個操縱位點均能提高調(diào)控元件組的靈敏度。具體而言，與二聚化相比，在核心啟動子附近四聚化使得調(diào)控元件組的希爾系數(shù)提高了92％-218％。9.多聚化結(jié)構(gòu)域?qū)τ诳烧T導(dǎo)啟動子誘導(dǎo)性能的影響野生型的phlf調(diào)控元件組和cymr調(diào)控元件組中的啟動子可分別被dapg和cumate誘導(dǎo)。為了確認(rèn)多聚化結(jié)構(gòu)域是否對可誘導(dǎo)啟動子的誘導(dǎo)性能造成影響，我們 分別對添加有ci434多聚化結(jié)構(gòu)域的工程化cymr和phlf阻遏蛋白及野生型阻遏蛋白與1+1型啟動子配合的調(diào)控元件組的誘導(dǎo)性能進行了研究。為了使得誘導(dǎo)性能的量級可以比較，我們采用了不同的iptg濃度對野生型或工程化阻遏蛋白進行控制。如圖5所示，這兩種誘導(dǎo)型調(diào)控元件的可誘導(dǎo)性均不受多聚化結(jié)構(gòu)域的影響：cymr-ci434仍可被cumate誘導(dǎo)；phlf-ci434仍可被dapg誘導(dǎo)。并且，在采用1+1型啟動子的情況下，使用的iptg濃度大幅降低，說明工程化的調(diào)控元件組能夠響應(yīng)較小的阻遏蛋白濃度，這表明cymr-ci434和phlf-ci434對誘導(dǎo)劑的響應(yīng)都比野生型蛋白要靈敏。10.結(jié)論在本實施例中，我們展示了對阻遏蛋白性能進行有效改進的模塊化方法。該方法廣泛適用于各種阻遏蛋白。特別地，通過使得啟動子區(qū)域包含多個操縱位點，在啟動子區(qū)域引入dna環(huán)，可進一步提高啟動子的開關(guān)性能或靈敏度。作為一個實例，毒性-抗毒性系統(tǒng)中失活的阻遏蛋白(maze)得到挽救；在沒有毒性蛋白存在的情況下，通過向抗毒性蛋白融合多聚化模塊，其可作為正常的、或者更強的阻遏蛋白。我們的設(shè)計方法能夠極大地提高代謝動態(tài)控制的靈活性，并為合成生物學(xué)提供了具有超高靈敏度的阻遏性能的調(diào)控元件組工具包。另外，如本領(lǐng)域所知曉的，t7啟動子的表達(dá)非常強，其“關(guān)閉”極其困難。因此，我們的方法也能夠構(gòu)造開關(guān)性能良好的可調(diào)節(jié)的t7啟動子。11.材料和方法11.1試劑和培養(yǎng)基luria-bertani(lb)液體培養(yǎng)基：蛋白胨(fisherscientific)10g/l；nacl(fisherscientific)10g/l；酵母粉(fisherscientific)5g/l。121℃高壓滅菌20min。lb固體培養(yǎng)基：與lb液體培養(yǎng)基的配方相同，添加1.5％瓊脂粉。補充有鹽的m9基本培養(yǎng)基：氯霉素(acros)：溶于lb或m9培養(yǎng)基，終濃度20μg/ml。氨芐青霉素(acros)：溶于lb或m9培養(yǎng)基，終濃度25μg/ml。異丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)(usbcorporation)儲液濃度1m，終濃度分別為1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、50μm、70μm、100μm、200μm、500μm、800μm 和1500μm。l-(+)-阿拉伯糖(sigma)儲液濃度1m，終濃度分別為0.1mm、1mm、2mm和5mm。4-異丙基苯甲酸(cumate)(j&k)儲液濃度1m，終濃度分別為0.1μm、0.2μm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm和1000μm。2,4-二乙?；g苯三酚(dapg)(chemcruz)儲液濃度200mm，終濃度分別為0.01μm、0.05μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm和100μm。pbs緩沖液：nacl：7.9g(北京化工廠，純度≥99.5％)；kcl：0.2g(北京化工廠，純度≥99.5％)；kh2po4：0.24g(北京化工廠，純度≥99.5％)；k2hpo4：1.8g(北京化工廠，純度≥99.0％)，溶于800ml蒸餾水中，最后加蒸餾水定容至1l，用hcl(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)調(diào)節(jié)溶液的ph值至7.4。補充有2mg/ml卡那霉素的pbs緩沖液。質(zhì)粒構(gòu)建和菌株維持中使用lb液體和固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中對菌株進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)時使用補充有鹽的m9基本培養(yǎng)基。限制性內(nèi)切酶、t4多核苷酸激酶和t4dna連接酶購自newenglandbiolabs(frankfurt，germany)。除另有說明，使用olma(oligo-linkermediatedassembly)方法[25]構(gòu)建質(zhì)粒。引物和單鏈dna片段(寡核苷酸)購自bgi(北京基因組所)。使用nano分光光度計nd-2000(peqlab,erlangen,germany)檢測dna濃度。11.2菌株和質(zhì)粒全部質(zhì)粒構(gòu)建利用大腸桿菌dh5α菌株(transgenbiotech)作為克隆菌株。使用大腸桿菌t7e1a菌株[25]作為測試菌株，所述大腸桿菌t7e1a菌株為利用posip質(zhì)粒將t7rna聚合酶轉(zhuǎn)錄單元整合到細(xì)菌染色體的dh10b(transgenbiotech)菌株。對rgp系列質(zhì)粒(seqidno：31)和ptp系列質(zhì)粒(seqidno：33)進行程序化的dna組裝。rgp整合有被lac啟動子驅(qū)動的不同阻遏蛋白，另外，除p15a區(qū)域外，該質(zhì)粒整合有組成型過表達(dá)的laci和ampr；另外，兩個bsal位點位于laczα片段的側(cè)翼，從而在消化后從質(zhì)粒上移除識別位點。借助goldengate克隆方法，將laczα片段替換為感興趣的野生型或工程化的阻遏蛋白，從而構(gòu)建rgp系列質(zhì)粒。制備ptp以表征不同啟動子的誘導(dǎo)強度。除了psc101和cmr外，ptp同樣具有位于laczα片段的側(cè)翼的兩個bsal位點，從而通過消化插入感興趣的啟動子以取代laczα片段。通過化學(xué)合成制備啟動子dna片段，并將其連入各質(zhì)粒。將表達(dá)阻遏蛋白的rgp質(zhì)粒和ptp空質(zhì)粒(與ptp抗性拷貝數(shù)相同，沒有g(shù)fp轉(zhuǎn)錄單元)轉(zhuǎn)入大腸桿菌t7e1a菌株作為陰性對照，在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中將該陰性對照的熒光值作為本底扣除。11.3細(xì)胞生長根據(jù)[26]，在進行熒光測定前對細(xì)胞進行培養(yǎng)。首先，在lb平板上選取單克隆的細(xì)菌，接種至falcon管的4mllb中，在37℃、250rpm的搖床中培養(yǎng)過夜。利用預(yù)熱的m9培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)物1:200稀釋至96孔板。在高速軌道振蕩的safire微板分光 光度計(tecan)中37℃孵育，每5min記錄各孔的od600測量值。一旦稀釋培養(yǎng)物的od600到達(dá)0.12-0.14(～3h)，利用含有iptg的預(yù)熱的m9培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物700倍稀釋至新的96孔板。在數(shù)顯恒溫?fù)u床(elmi)中以1,000rpm誘導(dǎo)6小時，維持指數(shù)生長。最后，將各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有150μlpbs和2mg/ml卡那霉素的新板中，終止蛋白表達(dá)。11.4熒光測定使用lsrii流式細(xì)胞儀(bdbiosciences)，將電壓設(shè)置為fsc:516,ssc:286,fitc:680,b:650，測量各樣品的熒光分布。每個測量至少包括50,000個樣本量。使用flowjo(v7.6)，根據(jù)前向散射和側(cè)向散射設(shè)門。計算各樣品的幾何平均數(shù)。將僅含有陰性對照質(zhì)粒的大腸桿菌dh10b細(xì)胞的熒光測定值作為自發(fā)熒光，對平均值進行修正。11.5數(shù)據(jù)分析和模型建立利用matlab7.11.0.584版本(r2010b)(mathworks)實施全部數(shù)據(jù)的擬合，利用matlab和graphpadprism5做圖。就對細(xì)胞中的基因表達(dá)建模而言，本領(lǐng)域已報導(dǎo)關(guān)注于不同效應(yīng)分子的不同尺度的模型。其中，在轉(zhuǎn)錄水平可調(diào)的關(guān)鍵變量包括作用于感興趣的基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的強度、rna聚合酶結(jié)合的強度等；在翻譯水平，可調(diào)的關(guān)鍵變量包括核糖體結(jié)合位點的強度、感興趣基因所對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物的降解率等。就本發(fā)明通過增加轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以增強誘導(dǎo)而言，除如下兩個參數(shù)外其它參數(shù)均為常數(shù)：當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控為簡單阻遏(即，僅存在一個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)時，僅需考慮轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量；而當(dāng)啟動子上存在多個可能發(fā)揮協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點時，需要考慮轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量和協(xié)同作用的強度。本發(fā)明采用了基于robphilips等的轉(zhuǎn)錄熱力學(xué)模型。其原理在于，轉(zhuǎn)錄活性正比于觀測到的rna聚合酶(rnap)結(jié)合至啟動子的概率；并且，將基因表達(dá)水平(即，實驗中測得的熒光強度)近似為轉(zhuǎn)錄水平。對于僅有一個阻遏蛋白結(jié)合位點以及在t7最小啟動子的上下游存在多個阻遏蛋白結(jié)合位點而言，rnap結(jié)合至啟動子的概率為：其中，p和r分別為rna聚合酶和阻遏蛋白的數(shù)量；kpd和ko1分別為體內(nèi)rnap從t7啟動子上解離的解離常數(shù)和單個阻遏蛋白從阻遏蛋白結(jié)合位點處解離的解離常數(shù)；n為希爾系數(shù)，表征阻遏蛋白結(jié)合多個阻遏蛋白結(jié)合位點而形成二聚體或更高階的寡聚物時的協(xié)同作用。由于p/kpd為常數(shù)，且p/kpd>>1，公式(1)可簡化為在細(xì)胞的指數(shù)生長期，可用常微分方程描述蛋白濃度的動態(tài)變化：其中，g是感興趣的蛋白的濃度，在本發(fā)明的測量中，g為sfgfp的濃度。之前的測量表明，指數(shù)生長期每細(xì)胞的熒光量為dg/dt＝0的解。即，如上所討論的，細(xì)菌中蛋白的減少/稀釋一般由細(xì)胞分裂導(dǎo)致的稀釋和蛋白自身降解造成。然而，對于大多數(shù)蛋白、特別是這里測量的sfgfp，降解率比稀釋率小若干數(shù)量級(數(shù)百倍)，因此降解率僅取決于細(xì)胞對數(shù)生長期的速率(就細(xì)菌而言，γ≈1/小時)，因此，測得的gfp水平正比于β+(vmax-β)·pbound，即熒光水平與r的關(guān)系為反s型曲線。將實驗結(jié)果與熒光測量結(jié)果進行比較，vmax即無轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點時t7最小啟動子的表達(dá)水平，也就是說r＝0情況下的表達(dá)水平。在本發(fā)明的實驗中，vmax為2388(a.u.)。β為取決于阻遏蛋白結(jié)合位點強度的參數(shù)。利用最小二乘法將數(shù)據(jù)擬合至公式(5)，其中k和n為自由變量。所述最小二乘法使用matlab的fminsearch函數(shù)進行，通過搜索各數(shù)據(jù)組求和的最小值確定參數(shù)。通過這樣的方式，對各阻遏蛋白及其結(jié)合位點的設(shè)置進行定量刻畫，并獲得希爾系數(shù)n。11.6參考文獻1.oyarzunda,stangb:syntheticgenecircuitsformetaboliccontrol:designtrade-offsandconstraints.journaloftheroyalsociety,interface/theroyalsociety2012.2.nielsenj,keaslingjd:synergiesbetweensyntheticbiologyandmetabolicengineering.naturebiotechnology2011,29(8):693-695.3.boylepm,silverpa:partspluspipes:syntheticbiologyapproachestometabolicengineering.metabolicengineering2012,14(3):223-232.4.xup,lil,zhangf,stephanopoulosg,koffasm:improvingfattyacidsproductionbyengineeringdynamicpathwayregulationandmetaboliccontrol.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2014,111(31):11299-11304.5.burdawn,millerhk,krutecn,leightonsl,carrollrk,shawln:investigatingthegeneticregulationoftheecfsigmafactorsigma(s)instaphylococcusaureus.bmcmicrobiol2014,14.6.weberw,fusseneggerm:moleculardiversity--thetoolboxforsyntheticgeneswitchesandnetworks.currentopinioninchemicalbiology2011,15(3):414-420.7.schujmange,paolettil,grossmanad,demendozad:fapr,abacterialtranscriptionfactorinvolvedinglobalregulationofmembranelipidbiosynthesis.developmentalcell2003,4(5):663-672.8.martinezma,zaballame,schaefferf,bellinzonim,albanesid,schujmange,vilaaj,alzaripm,demendozad:anovelroleofmalonyl-acpinlipidhomeostasis.biochemistry2010,49(14):3161-3167.9.liud,xiaoy,evansbs,zhangf:negativefeedbackregulationoffattyacidproductionbasedonamalonyl-coasensor-actuator.acssyntheticbiology2015,4(2):132-140.10.merullad,vandermeerjr:regulatableandmodulablebackgroundexpressioncontrolinprokaryoticsyntheticcircuitsbyauxiliaryrepressorbindingsites.acssyntheticbiology2016,5(1):36-45.11.ptashnem:isolationoftheλphagerepressor.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica1967,57(2):306.12.gilbertw,müller-hillb:isolationofthelacrepressor.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica1966,56(6):1891.13.paboco,lewism:theoperator-bindingdomainoflambdarepressor:structureanddnarecognition.nature1982,298(5873):443-447.14.jaind,nickelsbe,sunl,hochschilda,darstsa:structureofaternarytranscriptionactivationcomplex.molecularcell2004,13(1):45-53.15.paboco,sauerrt,sturtevantjm,ptashnem:thelambdarepressorcontainstwodomains.proceedingsofthenationalacademyofsciences1979,76(4):1608-1612.16.bellce,frescurap,hochschilda,lewism:crystalstructureoftheλrepressorc-terminaldomainprovidesamodelforcooperativeoperatorbinding.cell2000,101(7):801-811.17.johnsonad,meyerbj,ptashnem:interactionsbetweendna-boundrepressorsgovernregulationbytheλphagerepressor.proceedingsofthenationalacademyofsciences1979,76(10):5061-5065.18.révetb,vonwilcken-bergmannb,besserth,barkera,müller-hillb:fourdimersofλrepressorboundtotwosuitablyspacedpairsofλoperatorsformoctamersanddnaloopsoverlargedistances.currentbiology1999,9(3):151-154.19.doddib,perkinsaj,tsemitsidisd,eganjb:octamerizationofλcirepressorisneededforeffectiverepressionofprmandefficientswitch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