本發(fā)明屬于原代細胞培養(yǎng)技術領域，特別涉及一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法。
背景技術：
細胞培養(yǎng)是生物學和醫(yī)學研究最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是直接從生物體獲取組織或器官的一部分，經(jīng)機械法或各種酶類(常用胰蛋白酶)和鰲合劑(常用edta)處理，使之分散成單個細胞，加入適量培養(yǎng)基，置于合適的培養(yǎng)容器中，在無菌、適當溫度和一定條件下，使之生存、生長和繁殖的過程。
嚴格地說，原代培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段；但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)過程一般持續(xù)1～4周，在此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似程度很高。由于培養(yǎng)的細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。同時也為以后進行傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。
現(xiàn)有的原代培養(yǎng)方法，多是通過在培養(yǎng)基中添加血清來為細胞提供營養(yǎng)。但是血清成本較高，如果培養(yǎng)過程中一直使用含有同一濃度血清的培養(yǎng)基，會導致成本花費過高、無法進行大規(guī)模培養(yǎng)；如果降低血清的使用濃度，又可能導致養(yǎng)分供應不足、影響細胞增殖。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法。
本發(fā)明具體技術方案如下：
本發(fā)明提供了一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括如下步驟：
s1：原代腫瘤細胞的分離：采集腫瘤組織，清洗干凈，去除壞死組織和結締組織，并切割成組織碎塊；
s2：第一培養(yǎng)階段：將所述組織碎塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1～5ml的含低濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3周；
s3：第二培養(yǎng)階段：更換含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％；
s4：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
本方法將培養(yǎng)過程分為兩個階段，通過逐漸提高培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度，以使原代細胞的適應性逐漸增強、活力逐漸提高，細胞增值較快、得率較高，同時有效控制了成本。
進一步地，所述步驟s1的具體方法如下：
采集腫瘤組織，在無菌狀態(tài)下轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用5～10ml質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉水溶液沖洗，重復2～3次，去除血漬，并切除壞死組織和結締組織，剪成1mm3的組織碎塊。
組織塊培養(yǎng)法是細胞原代培養(yǎng)的重要方法，具有步驟少、細胞損傷小的優(yōu)點，并且不需要頻繁更換培養(yǎng)基，操作簡便。
進一步地，所述步驟s2包括如下步驟：
s2.1：將組織碎塊接種于t25培養(yǎng)瓶中，加入1～5ml含50mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶底部，置于37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
s2.2：每隔3～4天進行一次全量換液，棄去舊培養(yǎng)基，同時添加等量的新鮮培養(yǎng)基，置于co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
s2.3：培養(yǎng)7～10天后，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊脫落；將舊培養(yǎng)基與脫落的組織塊一并轉(zhuǎn)移并使用100μm的濾膜過濾，收集濾液，在1500～2000rpm/min條件下離心5min，收集沉淀，加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周。
進一步地，所述步驟s3的具體方法如下：
第一培養(yǎng)階段培養(yǎng)2～3周后，棄去舊培養(yǎng)基，換用含有100mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，每3～4天進行一次全量換液，培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％時為止。
進一步地，所述步驟s4包括如下步驟：
s4.1：當細胞總量達到1*107時，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗2～3次，棄去洗滌液；
s4.2：向洗滌后的培養(yǎng)瓶中加入1～5ml的0.125～0.25％胰蛋白酶-edta消化液，輕輕搖動使消化液浸潤培養(yǎng)瓶底面，于超凈工作臺中靜置1min后，取出培養(yǎng)瓶輕輕拍打，并置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓、大部分細胞脫落時為止；
s4.3：向培養(yǎng)瓶中加入3～5ml所述含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶中細胞和組織塊的懸液轉(zhuǎn)移，用5～10ml所述磷酸鹽緩沖液將粘附在培養(yǎng)瓶中的細胞洗脫，并將洗脫的殘余細胞與所述懸液混合，在1500～2000rpm/min的條件下離心5min；
s4.4：離心后棄去上清，添加5～10ml所述磷酸鹽緩沖液重懸細胞，輕輕吹打混勻，在1500～2000rpm/min的條件下將重懸后的細胞懸液離心5min，并棄去上清；
s4.5：向收集到的細胞中加入1～2ml凍存液，轉(zhuǎn)移至凍存管中，放入程序降溫盒，置于-80℃冰箱冷凍，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
進一步地，其特征在于，所述rpmi-1640培養(yǎng)基還添加有如下成分：100～150mg/l的丙酮酸鈉以及1～2mg/l的柑濃素。
丙酮酸是糖酵解的中間產(chǎn)物，可以自由進出細胞，可以為細胞代謝活動所需的能量和碳源，還有助于降低熒光物質(zhì)引發(fā)的光毒作用；而丙酮酸鈉是最常見的丙酮酸鹽，用丙酮酸鈉代替丙酮酸添加進培養(yǎng)基中，可以提高穩(wěn)定性、降低成本。
柑濃素是從柑橘皮中提取的一種天然混合物，具有極強的抗菌的作用，能抑制細菌等的生長增殖，并且無毒副作用、不會對細胞的生長造成影響，也不會使病原微生物產(chǎn)生抗藥性。
進一步地，所述rpmi-1640培養(yǎng)基中還添加有如下成分：4～6mg/l的y-27632以及2～4mg/l的灰黃霉素。
y-27632是rho相關的卷曲蛋白激酶抑制劑，可以抑制細胞的成脂分化?；尹S霉素能有效抑制真菌的有絲分裂，在臨床上常用于治療頭癬、手足癬、體股癬等真菌感染引發(fā)的疾病，將其添加到培養(yǎng)基中，可以有效防止真菌污染。
進一步地，所述凍存液包括如下成分：體積份數(shù)比為5～7:2～4:1的胎牛血清、植物源重組人血清白蛋白以及二甲基亞砜。
目前常規(guī)凍存液主要使用胎牛血清和二甲基亞砜兩種成分，細胞珍貴程度越高、對營養(yǎng)的要求就越高，胎牛血清的用量也越高；植物源重組人血清白蛋白基于植物生產(chǎn)制造，能夠提供與血清相當?shù)臓I養(yǎng)成分，可以部分替代胎牛血清，從而降低胎牛血清的用量、降低了成本。
進一步地，所述步驟s4.2的時長不超過5min。
消化時間過長，胰蛋白酶可能會對細胞產(chǎn)生傷害，造成細胞得率降低、活力下降，對后續(xù)使用產(chǎn)生影響。
本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，將培養(yǎng)過程分為兩個階段，并分別使用含有不同濃度的胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過逐漸提高培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度，以使原代細胞的適應性逐漸增強、活力逐漸提高，細胞增殖較快、得率較高，同時遺傳穩(wěn)定性良好；在培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉、柑濃素、y-27632以及灰黃霉素，可以防止細菌和真菌感染，并能促進細胞增殖、抑制細胞分化；在凍存液中添加植物源重組人血清白蛋白，可以部分代替胎牛血清，降低胎牛血清的用量，從而在保證效力不變的情況下降低成本。
具體實施方式
主要試劑及培養(yǎng)基的配制
a.rpmi-1640培養(yǎng)基：具體成分如下：
b.磷酸鹽緩沖液：
稱取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4,溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)溶液的ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l即可。在15lbf/in2(1034×105pa)高壓下蒸氣滅菌(至少20分鐘)，保存于室溫或4℃冰箱中。
c.胰蛋白酶-edta消化液：
稱取0.125～0.25g胰蛋白酶粉末加入100mlpbs溶液中，加入0.02gedta，置于4℃冰浴中低速攪拌0.5h，調(diào)節(jié)ph至7.4，過濾分裝、置于-20℃保存。
下面結合以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。需要說明的是，以下實施例中所述的rpmi-1640培養(yǎng)基采用上述a中所述配方，“還添加”是指在a中所述的rpmi-1640培養(yǎng)基的基礎上進行添加。以下實施例中所述的rpmi-1640培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液均采用上述配方。
實施例1
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括如下步驟：
s1：原代腫瘤細胞的分離：采集腫瘤組織，清洗干凈，去除壞死組織和結締組織，并切割成組織碎塊；
s2：第一培養(yǎng)階段：將所述組織碎塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1ml的含低濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周；
s3：第二培養(yǎng)階段：更換含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％；
s4：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
需要說明的是，本實施例中所述的低濃度胎牛血清的范圍為40～60mg/l，所述的高濃度胎牛血清的范圍為80～120mg/l。
實施例2
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括如下步驟：
s1：原代腫瘤細胞的分離：采集腫瘤組織，清洗干凈，去除壞死組織和結締組織，并切割成組織碎塊；
s2：第一培養(yǎng)階段：將所述組織碎塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入5ml的含低濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周；
s3：第二培養(yǎng)階段：更換含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％；
s4：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
實施例3
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例1所述各步驟，其中步驟s1的具體方法如下：
采集腫瘤組織，在無菌狀態(tài)下轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用5ml質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉水溶液沖洗，重復3次，去除血漬，并切除壞死組織和結締組織，剪成1mm3的組織碎塊。
實施例4
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例2所述各步驟，其中步驟s1的具體方法如下：
采集腫瘤組織，在無菌狀態(tài)下轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用10ml質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉水溶液沖洗，重復2次，去除血漬，并切除壞死組織和結締組織，剪成1mm3的組織碎塊。
實施例5
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例3所述各步驟，其中步驟s2的具體方法如下：
s2.1：將組織碎塊接種于t25培養(yǎng)瓶中，加入1ml含50mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶底部，置于37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
s2.2：每隔3～4天進行一次全量換液，棄去舊培養(yǎng)基，同時添加等量的新鮮培養(yǎng)基，置于co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
s2.3：培養(yǎng)7～10天后，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊脫落；將舊培養(yǎng)基與脫落的組織塊一并轉(zhuǎn)移并使用100μm的濾膜過濾，收集濾液，在1500rpm/min條件下離心5min，收集沉淀，加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周。
實施例6
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例4所述各步驟，其中步驟s2的具體方法如下：
s2.1：將組織碎塊接種于t25培養(yǎng)瓶中，加入5ml含50mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶底部，置于37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
s2.2：每隔3～4天進行一次全量換液，棄去舊培養(yǎng)基，同時添加等量的新鮮培養(yǎng)基，置于co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
s2.3：培養(yǎng)7～10天后，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊脫落；將舊培養(yǎng)基與脫落的組織塊一并轉(zhuǎn)移并使用100μm的濾膜過濾，收集濾液，在2000rpm/min條件下離心5min，收集沉淀，加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周。
s3：第二培養(yǎng)階段：更換含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％；
s4：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
實施例7
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例5所述各步驟，其中步驟s3的具體方法如下：
s3：第一培養(yǎng)階段培養(yǎng)2～3周后，棄去舊培養(yǎng)基，換用含有100mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，每3～4天進行一次全量換液，培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％時為止。
實施例8
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例6所述各步驟，其中步驟s3的具體方法如下：
s3：第一培養(yǎng)階段培養(yǎng)2～3周后，棄去舊培養(yǎng)基，換用含有100mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，每3～4天進行一次全量換液，培養(yǎng)至細胞融合度達到70～80％時為止。
實施例9
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例7所述各步驟，其中步驟s4的具體方法如下：
s4.1：當細胞總量達到1*107時，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，棄去洗滌液；
s4.2：向洗滌后的培養(yǎng)瓶中加入5ml的0.125％胰蛋白酶-edta消化液，輕輕搖動使消化液浸潤培養(yǎng)瓶底面，于超凈工作臺中靜置1min后，取出培養(yǎng)瓶輕輕拍打，并置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓、大部分細胞脫落時為止；
s4.3：向培養(yǎng)瓶中加入3ml所述含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶中細胞和組織塊的懸液轉(zhuǎn)移，用5ml所述磷酸鹽緩沖液將粘附在培養(yǎng)瓶中的細胞洗脫，并將洗脫的殘余細胞與所述懸液混合，在1500rpm/min的條件下離心5min；
s4.4：離心后棄去上清，添加5ml所述磷酸鹽緩沖液重懸細胞，輕輕吹打混勻，在1500rpm/min的條件下將重懸后的細胞懸液離心5min，并棄去上清；
s4.5：向收集到的細胞中加入1ml凍存液，轉(zhuǎn)移至凍存管中，放入程序降溫盒，置于-80℃冰箱冷凍，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
實施例10
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例8所述各步驟，其中步驟s4的具體方法如下：
s4.1：當細胞總量達到1*107時，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，棄去洗滌液；
s4.2：向洗滌后的培養(yǎng)瓶中加入1ml的0.25％胰蛋白酶-edta消化液，輕輕搖動使消化液浸潤培養(yǎng)瓶底面，于超凈工作臺中靜置1min后，取出培養(yǎng)瓶輕輕拍打，并置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓、大部分細胞脫落時為止，全過程不超過5min；
s4.3：向培養(yǎng)瓶中加入5ml所述含有高濃度胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶中細胞和組織塊的懸液轉(zhuǎn)移，用10ml所述磷酸鹽緩沖液將粘附在培養(yǎng)瓶中的細胞洗脫，并將洗脫的殘余細胞與所述懸液混合，在2000rpm/min的條件下離心5min；
s4.4：離心后棄去上清，添加10ml所述磷酸鹽緩沖液重懸細胞，輕輕吹打混勻，在2000rpm/min的條件下將重懸后的細胞懸液離心5min，并棄去上清；
s4.5：向收集到的細胞中加入2ml凍存液，轉(zhuǎn)移至凍存管中，放入程序降溫盒，置于-80℃冰箱冷凍，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
實施例11
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例9所述各步驟，其中rpmi-1640培養(yǎng)基中還添加有如下成分：150mg/l的丙酮酸鈉以及2mg/l的柑濃素。
實施例12
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例10所述各步驟，其中rpmi-1640培養(yǎng)基中還添加有如下成分：100mg/l的丙酮酸鈉、1mg/l的柑濃素、6mg/l的y-27632以及4mg/l的灰黃霉素。
實施例13
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例9所述各步驟，其中rpmi-1640培養(yǎng)基中還添加有如下成分：150mg/l的丙酮酸鈉、1mg/l的柑濃素、4mg/l的y-27632以及2mg/l的灰黃霉素。
實施例14
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例9所述各步驟，其中凍存液包括如下成分：體積份數(shù)比為5:4:1的胎牛血清、植物源重組人血清白蛋白以及二甲基亞砜。
實施例15
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括實施例10所述各步驟，其中凍存液包括如下成分：體積份數(shù)比為7:2:1的胎牛血清、植物源重組人血清白蛋白以及二甲基亞砜。
對照例1
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括如下步驟：
s1：原代腫瘤細胞的分離：采集腫瘤組織，清洗干凈，去除壞死組織和結締組織，并切割成組織碎塊；
s2：培養(yǎng)階段：將所述組織碎塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1ml的含50mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，每3～4天進行一次全量換液，培養(yǎng)3～4周，至細胞融合度達到70～80％；
s3：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
對照例2
一種人原代腫瘤細胞的分離制備方法，包括如下步驟：
s1：原代腫瘤細胞的分離：采集腫瘤組織，清洗干凈，去除壞死組織和結締組織，并切割成組織碎塊；
s2：培養(yǎng)階段：將所述組織碎塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1ml的含100mg/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，每3～4天進行一次全量換液，培養(yǎng)3～4周，至細胞融合度達到70～80％；
s3：細胞收獲及凍存：將得到的細胞進行消化收獲，向收獲的細胞中加入凍存液，并進行凍存。
實驗例1
原代細胞增殖效率對比實驗
分別以實施例1、2、7、8、9、10、11、12、13的方法為實驗組1～9，對照例1、2的方法為對照組1～2，對同一腫瘤組織的細胞進行原代培養(yǎng)，并比較各組細胞數(shù)量達到1*107時所需的時間，以及培養(yǎng)4周時各組的細胞活力。結果如表1所示。
表1各組細胞培養(yǎng)時間比較
由表1可知，實驗組各組的培養(yǎng)時間均顯著少于對照組，并且細胞活力也顯著高于對照組，說明本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法可以有效縮短培養(yǎng)周期、提高細胞得率特別是活細胞的得率。其中，實驗組5～7的培養(yǎng)時間最短、細胞活力最高，表明本發(fā)明中對培養(yǎng)基的改進可以顯著提高細胞的增殖速率和活性。
實驗例2
細胞表面免疫表型遺傳實驗
分別以實施例1、2、11、12、13的方法為實驗組1～5，以常規(guī)的組織塊培養(yǎng)法和酶法作為對照組1～2，對腫瘤細胞進行培養(yǎng)，并對獲得的細胞的表面抗原進行流式檢測，同時以母細胞作為陽性對照。結果如表2所示。
表2各組細胞表面抗原流式檢測結果
由表2可知，實驗組及對照組各組與陽性對照相比，細胞表面免疫表型種類均相同，并且各細胞表面抗原比例沒有顯著差異。由此可知經(jīng)過原代培養(yǎng)的細胞與原腫瘤組織細胞具有相同的表面抗原，說明體外原代培養(yǎng)的腫瘤細胞很好地再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤細胞的遺傳表型，遺傳穩(wěn)定性良好。
實驗例3
凍存液保存效果實驗
分別以實施例14～15提供的凍存液作為實驗組1～2，以常規(guī)凍存液1(90％胎牛血清+10％dmso)以及常規(guī)凍存液2(95％完全培養(yǎng)液+5％二甲基亞砜)作為對照組1～2，對經(jīng)過實施例13提供的方法進行原代培養(yǎng)得到的同一批細胞分別進行凍存，分別于7d、14d、28d測定各組的細胞活力并進行比較。結果如表3所示。
表3各組細胞活力變化情況對比
由表3可知，實驗組各組的細胞活力變化趨勢與對照組1相近，28d內(nèi)降低幅度很小，而對照組2在凍存期間細胞活力出現(xiàn)顯著降低。在使用中，通常認為血清含量越高、凍存液營養(yǎng)越豐富，對于維持細胞活力的效果越好。實驗組各組中均使用植物源人血清白蛋白來部分代替胎牛血清，仍然具有良好的凍存效果，同時還可以減少血清的用量、降低操作成本。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。