本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和疾病包括帕金森病、阿爾茨海默癥、脊髓側(cè)索硬化癥等是臨床上較為常見(jiàn)但又難以治療的神經(jīng)疾病，其神經(jīng)細(xì)胞損失、結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)或異常是這類(lèi)疾病的重要特征。目前，這些疾病基本依靠藥物治療為主，但治療效果均不理想。通過(guò)細(xì)胞移植的方法為損傷神經(jīng)系統(tǒng)補(bǔ)充有功能的神經(jīng)細(xì)胞是當(dāng)前一種較為切實(shí)可行的神經(jīng)疾病治療策略。

自體神經(jīng)移植（autologousnervegraft,ang）是一種行之有效的神經(jīng)疾病治療方法，特別是對(duì)于周?chē)窠?jīng)的修復(fù)和再生，是一種較為理想的標(biāo)準(zhǔn)修復(fù)方法，但這種方法存在供體部位來(lái)源限制和供體部位再次受到損傷等缺點(diǎn)。

除自體神經(jīng)移植方法外，目前已證實(shí)有很多類(lèi)型的細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷具有一定的修復(fù)作用，這包括胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。鑒于胚胎干細(xì)胞的全能分化特征，具有分化為多種類(lèi)型細(xì)胞的潛能，因此是機(jī)體組織損傷修復(fù)較好的修復(fù)材料，但也正因如此，胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)的分化潛能也較難控制，易形成畸胎瘤，此外，胚胎干細(xì)胞的使用所面臨的另一重要問(wèn)題是存在嚴(yán)重的倫理問(wèn)題；間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來(lái)源于骨髓、牙髓、脂肪、臍帶等組織的干細(xì)胞類(lèi)型，這類(lèi)干細(xì)胞在一定條件下能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化，但存在的問(wèn)題主要是間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量限制和分化效率較低；神經(jīng)干細(xì)胞是目前神經(jīng)疾病損傷細(xì)胞移植治療的熱點(diǎn)，能夠在一定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，但在體內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞更易于分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而非功能性的神經(jīng)元。

成體細(xì)胞重編程技術(shù)的發(fā)明為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的干細(xì)胞來(lái)源提供了新的途徑。目前，成體細(xì)胞重編程的方法主要有轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)、mrna和mirna誘導(dǎo)、化學(xué)小分子物質(zhì)誘導(dǎo)等。轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)是目前重編程方法中最為高效的方法之一，但是，由于這種方法通常需要使用病毒載體和基因插入，利用該方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞存在嚴(yán)重的安全隱患，因此，在臨床上需嚴(yán)格限制使用(takahashik.etal.,2007,yuj.y.etal.,2007)；利用轉(zhuǎn)錄因子mrna在體內(nèi)可以翻譯出蛋白質(zhì)以及mirna的調(diào)控作用，這些物質(zhì)均能介導(dǎo)成體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(warrenl.etal.,2010；anokye-dansof.etal.,2011,miyoshin.etal.,2011)，由于這種方法不涉及病毒載體介導(dǎo)和基因組的改變，安全性相對(duì)較好，重編程的效率也相對(duì)較高，但由于這類(lèi)物質(zhì)易于降解，在重編程過(guò)程中需要不斷加入這些誘導(dǎo)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程相對(duì)繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作要求較高，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也較差；化學(xué)小分子物質(zhì)能夠顯著提高重編程的效率，已有實(shí)驗(yàn)室證實(shí)利用全化合物能夠?qū)⒊审w細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，這類(lèi)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但全化合物誘導(dǎo)的小分子組合尋找較為困難，誘導(dǎo)效率也較低。

轉(zhuǎn)分化（trans-differentiation）也稱(chēng)譜系重編程（lineagereprogramming），它是指不經(jīng)過(guò)多能性細(xì)胞階段，將一種類(lèi)型的終末分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變成其它類(lèi)型的功能細(xì)胞的方法。目前，研究人員通過(guò)特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入和mirna方法已實(shí)現(xiàn)了多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，包括心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等（wadar,etal.,2013;huangp,etal.,2011;shengc,etal.,2012）。但由于這些方法仍存在基因?qū)?，因此在臨床上也存在潛在的安全隱患，應(yīng)嚴(yán)格限制使用。針對(duì)此問(wèn)題，目前，科學(xué)家已實(shí)現(xiàn)了全化合物誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化（chengl,etal.,2014;parkg,etal.,2015,54:201-212;sayedn,etal.,circulation,2015,131:300-309），但這類(lèi)方法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的效率很低，且化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的潛在損傷不清楚。

綜合以上分析，目前，神經(jīng)細(xì)胞的來(lái)源仍存在許多問(wèn)題，尤其是基因?qū)朐斐傻摹撛诘牟话踩詥?wèn)題，亟待尋找一種誘導(dǎo)方法相對(duì)簡(jiǎn)單、安全性相對(duì)較好的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法。受精卵能發(fā)育成個(gè)體以及克隆羊“多莉”的誕生等均提示在卵母細(xì)胞中一定存在某些能夠使細(xì)胞發(fā)生重編程的物質(zhì)。基于此，本發(fā)明嘗試發(fā)明了一種利用魚(yú)卵母細(xì)胞提取物作為誘導(dǎo)劑，將成纖維細(xì)胞先進(jìn)行重編程操作，誘導(dǎo)成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，進(jìn)一步利用神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)，獲得神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的方法（鑒于學(xué)術(shù)嚴(yán)謹(jǐn)性，誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞和正常神經(jīng)細(xì)胞在表觀(guān)遺傳模式方面可能不完全相同，因此，本發(fā)明專(zhuān)利將誘導(dǎo)后特異表達(dá)nse蛋白和nestin蛋白的細(xì)胞稱(chēng)為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞）。本發(fā)明方法所有步驟均不涉及基因?qū)氩僮?，產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞安全性好，所有步驟中僅在成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入魚(yú)卵母細(xì)胞提取物作為重編程誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也較好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)臨床上用于神經(jīng)組織損傷修復(fù)的神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源及分化誘導(dǎo)方法中存在的問(wèn)題，發(fā)明了一種實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性相對(duì)較好、產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞安全性相對(duì)較好的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)方法。

本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟。

（1）成纖維細(xì)胞的制備，包括成纖維細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)。

（2）誘導(dǎo)劑的制備，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生重編程的誘導(dǎo)劑為魚(yú)卵母細(xì)胞提取物，制備方法包括低溫條件下魚(yú)卵母細(xì)胞的研磨、過(guò)濾和蛋白濃度測(cè)定。

（3）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的獲得，利用所述步驟（2）中制備的魚(yú)卵母細(xì)胞提取物對(duì)所述步驟（1）中制備的成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

（4）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化，將所述步驟（3）中經(jīng)過(guò)魚(yú)卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。

（5）神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定，通過(guò)免疫組化方法對(duì)所述步驟（4）中的誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

所述步驟（3）中使用的魚(yú)卵母細(xì)胞提取物終濃度為10~20μg/ml，成纖維細(xì)胞在添加魚(yú)卵母細(xì)胞提取物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)間為72小時(shí)。

所述步驟（4）中使用的神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基組份包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、β-巰基乙醇、視黃酸、胎牛血清，誘導(dǎo)時(shí)間為10天。

所述步驟（5）中獲得的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞免疫組化鑒定蛋白為nse蛋白和nestin蛋白。

本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步在于，本發(fā)明提供了一種非轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的獲得神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，利用本方法可獲得安全性相對(duì)較好的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞。本發(fā)明方法的另一顯著特點(diǎn)在于本發(fā)明的方法實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求不高，在神經(jīng)生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)圖。

圖2是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的免疫組織化學(xué)鑒定，a圖為sox2蛋白免疫組化；b圖為nanog蛋白免疫組化；c圖為oct4/3蛋白免疫組化；d為對(duì)照組細(xì)胞。

圖3是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的nse蛋白免疫組化染色圖。

圖4是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的nestin蛋白免疫組化染色圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅為了便于更好理解本發(fā)明而不局限于本發(fā)明范圍。

實(shí)施例1。

魚(yú)卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

本實(shí)施例成纖維細(xì)胞來(lái)源于年齡20-25周歲、健康男性的包皮組織，魚(yú)卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞包括如下步驟。

（1）魚(yú)卵母細(xì)胞提取物的制備：選擇卵母細(xì)胞卵黃充滿(mǎn)時(shí)相的昆明當(dāng)?shù)禺a(chǎn)鯽魚(yú)，用75％的酒精浸泡15～20分鐘，在無(wú)菌的條件下取出魚(yú)卵，置入預(yù)冷的研缽中，將研缽置于冰上進(jìn)行研磨，充分研碎后，按體積約1:1的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，4℃條件下1000rpm離心10min，然后4℃條件下3000rpm離心10min，取上清，使用0.22微米孔濾器進(jìn)行過(guò)濾，利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定制備的魚(yú)卵母細(xì)胞提取物的蛋白含量，根據(jù)測(cè)得的蛋白濃度用預(yù)冷的dmem/f12培養(yǎng)基稀釋成10mg/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）皮膚采集：選擇年齡20~25周歲、健康男性的包皮組織，在無(wú)菌的條件下，剪取約1×1cm²備用，實(shí)驗(yàn)用包皮組織由解放軍昆明總醫(yī)院泌尿外科提供，并通過(guò)解放軍昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，樣品采集患者均知情同意，該材料僅用于本研究。

（3）人皮膚成纖維細(xì)胞的制備：將所述步驟（2）中采集的皮膚組織用生理鹽水反復(fù)沖洗后置于含有100u/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的1×pbs溶液中清洗三次，棄脂肪和結(jié)締組織，將組織剪碎成0.5~1mm³大小的組織塊，加入含有200u/ml膠原酶、300u/ml透明質(zhì)酸酶的dmem培養(yǎng)基中，置于4℃條件下過(guò)夜。按1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%edta的1×pbs消化液，置于37℃條件、180rpm的空氣搖床中20min，用含有10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基10ml終止反應(yīng)；1000rpm離心10min后棄上清、收集細(xì)胞，用dmem培養(yǎng)基洗脫2次后，用含有10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基調(diào)整為每毫升約2×10⁵個(gè)細(xì)胞接種，將細(xì)胞置于37℃、5%co2、90%濕度條件下培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液。通過(guò)鑒定、培養(yǎng)和傳代后的成纖維細(xì)胞及形態(tài)特征如附圖1所示。由附圖1可知，通過(guò)傳代培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞聚集在一起，呈梭形排列。

（4）人皮膚成纖維細(xì)胞的魚(yú)卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)：當(dāng)所述步驟（3）中制備的成纖維細(xì)胞傳代至第四代成纖維細(xì)胞時(shí)，且成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至80%細(xì)胞融合時(shí)，加入蛋白終濃度為10~20μg/ml的魚(yú)卵母細(xì)胞提取物進(jìn)行誘導(dǎo)72小時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)，使成纖維細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變。

（5）誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的鑒定：當(dāng)所述步驟（4）完成后即完成人皮膚成纖維細(xì)胞的重編程，利用免疫組化方法鑒定重編程細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況，sox2、nanog和oct4/3三個(gè)基因表達(dá)情況如附圖2所示。由附圖2所示，這三個(gè)基因在重編程細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，且細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，呈現(xiàn)梭形、三角形、多角形等形態(tài)，細(xì)胞核較大，呈扁圓形。

以上說(shuō)明，人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)魚(yú)卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)后呈現(xiàn)干細(xì)胞的特征，具有向其它類(lèi)型細(xì)胞分化的潛能。

實(shí)施例2。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化包括以下步驟。

（1）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)：將所述實(shí)施例1中產(chǎn)生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞置于含有100μmol/l的β-巰基乙醇和20%胎牛血清的l-dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后，將培養(yǎng)基換成含有1.0μmol/l全反式視黃酸、100μmol/lβ-巰基乙醇和10%胎牛血清的l-dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天，每3天更換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10天，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行誘導(dǎo)情況鑒定。

（2）免疫組化鑒定：將所述步驟（1）中誘導(dǎo)好的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞分別用4%的多聚甲醛固定10min，用1×pbs清洗3次，每次孵育5min，沖洗完成后加入0.3%的triton-100，停置5min，用1×pbs清洗3次，每次孵育5min，加入3.0%的h2o2，停置5min，1×pbs沖洗3次，每次孵育5min，在相應(yīng)孔中分別加人抗nse和nestin抗體，4℃過(guò)夜，1×pbs沖洗3次，每次孵育5min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育20min，用1×pbs洗滌3次，每次孵育5min，加入dab試劑，室溫顯色5min～10min，1×pbs洗滌，顯微鏡下觀(guān)察。nse蛋白和nestin蛋白免疫組化結(jié)果如附圖3和附圖4所示。由附圖3和附圖4所示，重編程細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)后，誘導(dǎo)細(xì)胞nse和nestin蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)。

通過(guò)以上實(shí)施例可以說(shuō)明，利用本發(fā)明的方法可以將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞。