本發(fā)明涉及新穎的四氫苯并噻吩類衍生物，其制備方法以及它們?cè)陬A(yù)防或治療與gsk-3β相關(guān)疾病方面的應(yīng)用。本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退及行動(dòng)和社會(huì)適應(yīng)能力下降為基本特征的神經(jīng)退行性疾病。隨著全球人口老齡化的快速發(fā)展，ad已成為威脅老年人生命健康的重大疾病，其危害僅次于心血管疾病、癌癥和腦卒中，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2015年，全球已有4600萬(wàn)人患有ad，預(yù)計(jì)到2050年，ad患病人數(shù)將達(dá)到1.31億。目前在中國(guó)有950萬(wàn)ad患者，為全球患ad人數(shù)最多的國(guó)家。

阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，隨著ad臨床研究及診斷標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，國(guó)際上針對(duì)ad治療的研究也越來(lái)越多。但迄今為止，臨床上針對(duì)ad仍缺乏有效的藥物和治療手段。大量研究表明，ad的各種發(fā)病機(jī)制并非單獨(dú)起作用，其主要病理特征，膽堿能系統(tǒng)損傷、aβ淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白異常磷酸化之間存在密切的關(guān)聯(lián)性，形成了一個(gè)復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。

阿爾茨海默病患者的腦組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，其特征性的病理改變主要是出現(xiàn)于大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)等處的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,nfts)，同時(shí)還伴有神經(jīng)元和突觸退化等其他非特異性病理變化。而nfts的形成是由微管相關(guān)的tau蛋白的異常修飾導(dǎo)致的結(jié)果。正常情況下，每分子tau蛋白含有2-3個(gè)磷酸基，而患有ad時(shí)，tau蛋白的磷酸基可增加至8-9個(gè)，這說(shuō)明患病過(guò)程中部分tau蛋白磷酸化激酶被激活。

gsk-3β(glycogensynthasekinase3beta)是目前研究較多的tau蛋白磷酸化激酶，也是磷酸化tau蛋白最有效率的蛋白激酶之一。在ad患者的大腦中發(fā)現(xiàn)這兩種激酶的活性形式與nfts共存，并且與tau蛋白共沉淀。所以，gsk-3β被認(rèn)為是潛在的治療ad的藥物靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)構(gòu)新穎的可作為gsk-3β抑制劑的四氫苯并噻吩衍生物。

本發(fā)明的另一目的是提供該四氫苯并噻吩類化合物的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。

本發(fā)明又一目的是提供上述化合物以及包含該化合物的組合物用于制備預(yù)防或治療gsk-3β相關(guān)疾病的藥物。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種四氫苯并噻吩衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽、光學(xué)活性體或消旋體，具有通式ⅰ所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

其中，r1為下列基團(tuán)中的任意一個(gè)基團(tuán)：(1)h原子；(2)c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基、c2-6鏈烯基、c2-6鏈炔基、c1-6烷氧羰基、c1-6烷氧基、c2-6鏈烯氧基、c2-6鏈炔氧基，上述各基團(tuán)任意被選自h原子、鹵原子、羥基、氰基、硝基和氨基中的一種或多種取代基所取代；(3)取代的羰基，其任意被選自h原子、羥基、c1-6烷基、氨基、c1-6烷氨基、c1-6烷氧基、c1-6烷硫基和c3-8環(huán)烷基中的一種或多種取代基所取代；(4)取代的氨基，其任意被選自h原子、c1-6烷基、c2-6鏈烯基、c2-6鏈炔基、c1-6烷基磺?；?、c2-6鏈烯基磺?；?、c2-6鏈炔基磺?；?、c1-6烷基羰基、c2-6鏈烯基羰基和c2-6鏈炔基羰基中的一種或多種取代基所取代；(5)取代的苯基、取代的芐基、取代的苯甲酰基、取代的苯磺?；?、取代的吡啶環(huán)、取代的吡唑環(huán)、取代的吡咯環(huán)、取代的嘧啶環(huán)、取代的喹啉環(huán)、取代的異喹啉環(huán)、取代咪唑環(huán)、取代的嗎啉環(huán)、取代的哌嗪環(huán)、取代的噠嗪環(huán)、取代的吡嗪環(huán)、取代的哌啶環(huán)、取代的噻吩環(huán)、取代的吡喃環(huán)、取代的吲哚環(huán)、取代的呋喃環(huán)，上述各基團(tuán)任意被選自h原子、鹵素、c1-6烷基、c1-6烷基氨基、c3-7環(huán)烷基、c1-6烷氧基、芐氧羰基、三鹵甲基、羥甲基、羥基、氰基、硝基和氨基中的一種或多種取代基所取代；

r2為下列基團(tuán)中的任意一個(gè)基團(tuán)：(1)h原子；(2)c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基、c2-6鏈烯基、c2-6鏈炔基、c1-6烷氧羰基、c1-6烷氧基、c2-6鏈烯氧基、c2-6鏈炔氧基，上述各基團(tuán)任意被選自h原子、鹵原子、羥基、氰基、硝基和氨基中的一種或多種取代基所取代；(3)取代的羰基，其任意被選自h原子、羥基、c1-6烷基、氨基、c1-6烷氨基、c1-6烷氧基、c1-6烷硫基和c3-8環(huán)烷基中的一種或多種取代基所取代；(4)取代的氨基，其任意被選自h原子、c1-6烷基、c2-6鏈烯基、c2-6鏈炔基、c1-6烷基磺?；?、c2-6鏈烯基磺?；?、c2-6鏈炔基磺酰基、c1-6烷基羰基、c2-6鏈烯基羰基和c2-6鏈炔基羰基中的一種或多種取代基所取代；(5)取代的苯基、取代的芐基、取代的苯甲酰基、取代的苯磺?；⑷〈倪拎きh(huán)、取代的吡唑環(huán)、取代的吡咯環(huán)、取代的嘧啶環(huán)、取代的喹啉環(huán)、取代的異喹啉環(huán)、取代咪唑環(huán)、取代的嗎啉環(huán)、取代的哌嗪環(huán)、取代的噠嗪環(huán)、取代的吡嗪環(huán)、取代的哌啶環(huán)、取代的噻吩環(huán)、取代的吡喃環(huán)、取代的吲哚環(huán)、取代的呋喃環(huán)，上述各基團(tuán)任意被選自h原子、鹵素、c1-6烷基、c1-6烷基氨基、c3-7環(huán)烷基、c1-6烷氧基、芐氧羰基、三鹵甲基、羥甲基、羥基、氰基、硝基和氨基中的一種或多種取代基所取代；

x為c、o、s或n原子；

y為亞甲基、o、s或亞氨基。

本發(fā)明涉及的任何一個(gè)衍生物可具有不對(duì)稱中心，因此以不同的對(duì)映和非對(duì)映體的形式存在。本發(fā)明涉及本發(fā)明衍生物的所有旋光異構(gòu)體、消旋體及其混合物。“消旋體”是指含有等量的一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的混合物。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，通式ⅰ中，r1為氨基甲酰基或羧基，r2為環(huán)戊基、環(huán)己基、異丙基、苯基、芐基、乙?；虮郊柞；?；x為o或s；y為亞氨基。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的四氫苯并噻吩衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽、光學(xué)活性體或消旋體，選自以下化合物所組成群組：

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備所述四氫苯并噻吩衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽、光學(xué)活性體或消旋體的方法，當(dāng)r1、r2、x和y的定義同上，但r1不為羧基時(shí)，包括以下步驟：

(1)環(huán)己酮與化合物2在乙醇溶液中反應(yīng)得到化合物3，向反應(yīng)后的溶液中加入硫粉，并滴加二乙胺，保持反應(yīng)溫度不超過(guò)50℃，反應(yīng)3h后改為冰鹽浴，使反應(yīng)液產(chǎn)生結(jié)晶，或?qū)⒎磻?yīng)液倒入水中，抽濾，析出固體用乙醇重結(jié)晶得化合物4；

(2)化合物4溶于干燥的ch2cl2中，加入x＝c＝y(tǒng)-r2加熱回流；反應(yīng)液冷卻后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽濾，析出固體用乙醇重結(jié)晶，得化合物5；

當(dāng)r2、x和y的定義同上，r1為羧基時(shí)，包括以下步驟：

(1)環(huán)己酮以及2-腈基乙酸乙酯在乙醇溶液中反應(yīng)得到化合物3’，向反應(yīng)后的溶液中加入硫粉，滴加二乙胺，并保持反應(yīng)溫度不超過(guò)50℃，反應(yīng)3h后改為冰鹽浴，使反應(yīng)液產(chǎn)生結(jié)晶，或?qū)⒎磻?yīng)液倒入水中，抽濾得固體產(chǎn)物化合物4’，所得化合物4’溶解在30ml丙酮溶液中，加入naoh水溶液，于40℃下加熱反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后用稀鹽酸調(diào)節(jié)ph＝1，二氯甲烷萃取后蒸干得到化合物5’；

(2)化合物5’溶于干燥的ch2cl2中，加入x＝c＝y(tǒng)-r2加熱回流；反應(yīng)液冷卻后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽濾，析出固體用乙醇重結(jié)晶，得化合物5；

其中，r1’為乙氧基甲?；?/p>

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的四氫苯并噻吩衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽、光學(xué)活性體或消旋體在制備預(yù)防或治療gsk-3β相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種藥物組合物，含有藥物有效計(jì)量的本發(fā)明所述的任一項(xiàng)所述的四氫苯并噻吩衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽、光學(xué)活性體、消旋體或其混合物及藥用載體。以及所述的藥物組合物在制備預(yù)防或治療gsk-3β相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。

所述gsk-3β相關(guān)疾病可以是糖尿病、阿爾茨海默氏病、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、混合性白血病，但不局限于此。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供了一類結(jié)構(gòu)新穎的可作為gsk-3β抑制劑的四氫苯并噻吩衍生物。經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的化合物均表現(xiàn)出較高活性，噻吩環(huán)是一個(gè)活性結(jié)構(gòu)骨架，所制得的化合物具有良好的gsk-3β抑制活性，并在抗阿爾茨海默病方面表現(xiàn)出較好的活性。本發(fā)明的提出為抗阿爾茨海默病的研究提供了一個(gè)新的技術(shù)手段。此外，本發(fā)明還提出了一種制備該四氫苯并噻吩類化合物的方法，該方法合成路線短，制備過(guò)程簡(jiǎn)單、易操作，能夠滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要。

附圖說(shuō)明

圖1是化合物gx001-010以及陽(yáng)性對(duì)照藥staurosporine對(duì)gsk-3β的ic50值；其中，圖1a為化合物gx001-006對(duì)gsk-3β的ic50值；圖1b為化合物gx007-010以及陽(yáng)性對(duì)照藥staurosporine對(duì)gsk-3β的ic50值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

以下實(shí)施例1-實(shí)施例12為表1所示化合物及中間體的合成方法，r1為氨基甲?；鶗r(shí)合成路線如下所示：

r1為羧基時(shí)合成路線如下所示：

表1

實(shí)施例1中間體a(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

環(huán)己酮(0.1mol)以及2-腈基乙酰胺(0.1mol)在乙醇溶液(30ml)中反應(yīng)得到化合物3，向反應(yīng)后的溶液中加入硫粉(0.1–0.11mol)，滴加二乙胺(10ml)，并保持反應(yīng)溫度不超過(guò)50℃。反應(yīng)3h后改為冰鹽浴，使反應(yīng)液產(chǎn)生結(jié)晶，如沒(méi)有結(jié)晶將反應(yīng)液倒入100ml水中，抽濾，析出固體用乙醇重結(jié)晶得目標(biāo)化合物，即化合物4。收率61％。

mp190℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.68(m,4h),2.51(m,4h),6.52(bs,2h),6.89(s,2h)；lrms-ei:m/zcalcd196.1,found196.0。

實(shí)施例2：gx001(2-(3-環(huán)己基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入環(huán)己基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率79％。

mp190.5-192.5℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.21(m,4h),1.49(m,6h),1.70(m,4h),2.52(m,4h),3.54(m,1h),6.97(bs,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:322.1[m+h]⁺。

實(shí)施例3：gx002(2-(3-環(huán)戊基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入環(huán)戊基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率61％。

mp200.3-202.5℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.50(m,4h),1.86(m,4h),1.70(m,4h),2.52(m,4h),3.61(m,1h),6.97(bs,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:308.4[m+h]⁺。

實(shí)施例4：gx003(2-(3-異丙基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入異丙基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率58％。

mp192.5-194.1℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.27(m,6h),1.70(m,4h),2.52(m,4h),4.17(m,1h),6.97(bs,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:282.1[m+h]⁺。

實(shí)施例5：gx004(2-(3-苯基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入苯基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率71％。

mp223.5-230.1℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.70(m,4h),2.52(m,4h),6.97(bs,2h),7.19(m,1h),7.43(m,2h),7.61(m,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:316.4[m+h]⁺。

實(shí)施例6：gx005(2-(3-芐基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入芐基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率52％。

mp187.5-193.2℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.70(m,4h),2.52(m,4h),4.25(s,2h),6.97(bs,2h),7.26(m,1h),7.23(m,2h),7.33(m,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:330.1[m+h]⁺。

實(shí)施例7：gx006(2-(3-苯基硫脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入苯基硫代異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率41％。

mp198.5-201.3℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.70(m,4h),2.52(m,4h),6.97(bs,2h),6.81(m,1h),7.20(m,2h),7.70(m,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:332.4[m+h]⁺。

實(shí)施例8：gx007(2-(3-乙酰基硫脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入乙酰基硫代異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率23％。

mp211.3-215.3℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.70(m,4h),1.86(s,3h),2.52(m,4h),6.97(bs,2h),7.53(s,1h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:298.4[m+h]⁺。

實(shí)施例9：gx008(2-(3-苯甲?；螂?-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入苯甲?；虼惽杷狨?12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率33％。

mp180.5-182.5℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.70(m,4h),2.52(m,4h),7.20(bs,2h),7.50(s,1h),7.63(m,2h),7.70(m,1h),8.03(m,2h),10.48(s,1h)；esi-msm/z:360.1[m+h]⁺。

實(shí)施例10：中間體b(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成

環(huán)己酮(0.1mol)以及2-腈基乙酸乙酯(0.1mol)在乙醇溶液(25ml)中反應(yīng)得到化合物3’(其中r1’為乙氧基甲?；?，向反應(yīng)后的溶液中加入硫粉(0.1–0.11mol)，滴加二乙胺(10ml)，并保持反應(yīng)溫度不超過(guò)50℃。反應(yīng)3h后改為冰鹽浴，使反應(yīng)液產(chǎn)生結(jié)晶，如沒(méi)有結(jié)晶將反應(yīng)液倒入100ml水中，抽濾，得到化合物4’。所得固體產(chǎn)物化合物4’溶解在30ml丙酮溶液中，加入1mlnaoh水溶液(1mol/l)，于40℃下加熱反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用稀鹽酸調(diào)節(jié)ph＝1，二氯甲烷萃取后蒸干得到目標(biāo)產(chǎn)物，即化合物5’(其中r1為羧基)，收率為29％。

mp230.1-232.3℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.79(m,4h),2.65(m,4h),6.99(bs,2h),10.1(bs,1h)；lrms-ei:m/zcalcd197,found197.1。

實(shí)施例11：gx009(2-(3-環(huán)己基硫脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成

溶解化合物5’(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入環(huán)己基硫代異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率45％。

mp200.1-204.2℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.21(m,4h),1.49(m,6h),1.70(m,4h),2.52(m,4h),3.54(m,1h),7.53(s,1h),10.48(s,1h),10.23(bs,1h)；esi-msm/z:339.5[m+h]⁺。

實(shí)施例12：gx010(2-(3-環(huán)己基脲)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成

溶解化合物5’(0.80mmol)在干燥的ch2cl2(5ml)中，加入環(huán)己基異氰酸酯(12.8mmol)加熱回流5d。反應(yīng)液冷卻后加入50％的乙醇水溶液(5ml)，抽濾，得析出固體用乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率59％。

mp195.5-199.7℃；¹h-nmr(dmso-d6):d(ppm)1.21(m,4h),1.49(m,6h),1.70(m,4h),2.52(m,4h),3.42(m,1h),7.36(s,1h),8.35(s,1h),10.11(bs,1h)；esi-msm/z:323.4[m+h]⁺。

實(shí)施例13-22四氫苯并噻吩衍生物對(duì)gsk-3β的抑制作用

四氫苯并噻吩衍生物對(duì)gsk-3β的抑制作用的通用實(shí)驗(yàn)方法如下：

化合物對(duì)gsk-3β的ic50值檢測(cè)是利用微流體芯片技術(shù)的遷移率檢測(cè)技術(shù)(mobility-shitftassay)，該技術(shù)是將毛細(xì)管電泳的基本理念應(yīng)用到微流體環(huán)境中。在不加入中止試劑的情況下檢測(cè)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，在反應(yīng)體系中酶的作用下，底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生了相應(yīng)的變化，mobility-shitftassay正是利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者進(jìn)行分離，并分別進(jìn)行檢測(cè)。

mobility-shitftassay法gsk-3β激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)材料：

gsk-3β，p15肽(一種15個(gè)氨基酸多肽)，atp，dmso，edta，96孔板，384孔板。

以下實(shí)施例13-22為化合物gx001與陽(yáng)性對(duì)照藥staurosporine的藥理實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)施例13：化合物gx001對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

基礎(chǔ)緩沖液和終止緩沖液的配置，基礎(chǔ)緩沖液20mmhepes(ph7.5),tritonx-100(0.01％)，mgcl2(10mm)，dtt(2mm)。終止緩沖液100mmhepes(ph7.5),brij-35(0.015％)，coatingreagent#3(0.2％)，edta(50mm)。將待測(cè)化合物gx001配置為10mm備用，并稀釋成梯度濃度，staurosporine作為陽(yáng)性對(duì)照藥，配置為10mm備用，并稀釋成與gx001相同的梯度濃度。

在96孔板中，加入100μl的dmso溶劑至兩個(gè)孔作為無(wú)化合物與無(wú)酶的控制組，并標(biāo)記96孔板為原始板。從原始板轉(zhuǎn)移5μl化合物gx001或staurosporine到一個(gè)新的96孔板作為中間媒介板，加入95μl的酶緩沖液至中間媒介板，使得每孔為最終濃度為1％dmso的反應(yīng)，振搖10min。從中間媒介板每孔轉(zhuǎn)移5μl至一個(gè)384孔板的兩個(gè)孔。例如，96孔板的a1孔轉(zhuǎn)移至384孔板的a1和a2孔，96孔板的a2孔轉(zhuǎn)移至384孔板的a3和a4孔，以此類推。激酶反應(yīng)方法，制備2.5倍量的酶和2.5倍量的fam-標(biāo)記的肽和atp溶液，此時(shí)測(cè)試板已經(jīng)含有5μl化合物gx001或staurosporine的10％dmso溶液。將10μl的2.5倍的酶溶劑加入至384孔板測(cè)試板的各個(gè)孔，在室溫條件下孵育10min。將2.5倍的肽溶劑至測(cè)試板。在28℃的條件下孵化、培養(yǎng)，最終加入25μl終止緩沖液用于終止反應(yīng)。在caliper檢測(cè)平臺(tái)上收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行曲線擬合。

抑制率＝(max-conversion)/(max-min)×100.

max為dmso控制組熒光最大檢測(cè)值；min為dmso控制組熒光最小檢測(cè)值；conversion為化合物檢測(cè)熒光值。

ic50的計(jì)算公式如下：

y＝bottom+(top-bottom)/(1+(logic50/x)×hillslope))

top為梯度濃度檢測(cè)下，測(cè)試化合物最大抑制率；bottom為梯度濃度檢測(cè)下，測(cè)試化合物最小抑制率；hillslope指的是擬合曲線最大斜率的絕對(duì)值(即曲線中點(diǎn))。

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx001的ic50為9.22μm。陽(yáng)性對(duì)照藥staurosporine對(duì)gsk-3β的ic50值為22nm(圖1)。

實(shí)施例14：化合物gx002對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx002的ic50為98.3μm(圖1)。

實(shí)施例15：化合物gx003對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx003的ic50為78.5μm(圖1)。

實(shí)施例16：化合物gx004對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx004的ic50為25.8μm(圖1)。

實(shí)施例17：化合物gx005對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx005的ic50為22.6μm(圖1)。

實(shí)施例18：化合物gx006對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx006的ic50為24.3μm(圖1)。

實(shí)施例19：化合物gx007對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx007的ic50為81.6μm(圖1)。

實(shí)施例20：化合物gx008對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx008的ic50為89.5μm(圖1)。

實(shí)施例21：化合物gx009對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx009的ic50為18.2μm(圖1)。

實(shí)施例22：化合物gx010對(duì)gsk-3β抑制作用的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例13

通過(guò)檢測(cè)8個(gè)梯度濃度下的抑制率后擬合出gx010的ic50為95.3μm(圖1)。

實(shí)施例23-32噻吩類衍生物的體外抗ad活性實(shí)驗(yàn)

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、凝聚態(tài)aβ25-35的制備

用超純水將凍干的aβ25-35溶解配成1mmol/l的儲(chǔ)存液，于-20℃保存，臨用前于37℃放置4h使其凝聚。

2、細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

以每孔1×10⁴個(gè)細(xì)胞將sh-sy5y接種在96孔培養(yǎng)板。用含15％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔3～4d傳代。實(shí)驗(yàn)前16h細(xì)胞換用含n2添加劑的無(wú)血清培養(yǎng)液。通過(guò)mtt及l(fā)dh法觀察不同濃度(10，20，40，80，160μmol/l)的aβ25-35對(duì)sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響；選擇對(duì)細(xì)胞存活影響較小的作用濃度和作用時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)sh-sy5y細(xì)胞中tau蛋白過(guò)度磷酸化。

3、mtt實(shí)驗(yàn)

不同濃度凝聚態(tài)aβ25-35作用24，48，72h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)10μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜75μl，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取490nm處光密度值。設(shè)定正常對(duì)照組(扣除空白對(duì)照組)mtt代謝率為100％，其余各組光密度(扣除空白對(duì)照組)與之相比得到各自的mtt代謝率。

(1)空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

(2)對(duì)照組，加確定濃度的aβ25-35，但不加藥物。

(3)實(shí)驗(yàn)組，加確定濃度的aβ25-35，同時(shí)也加藥物，如果藥物有作用，則細(xì)胞的存活率會(huì)比對(duì)照組高(加藥物的時(shí)間是在加aβ25-35之前1h)。

實(shí)施例23：化合物gx001對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx001對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為65.7％，74.8％，85.2％?？瞻捉M，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例24：化合物gx002對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx002對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為61.6％，68.7％，75.4％?？瞻捉M，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例25：化合物gx003對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx003對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為59.3％，70.8％，73.7％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例26：化合物gx004對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx004對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為41.3％，49.7％，60.4％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例27：化合物gx005對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx005對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為20.8％，32.2％，46.9％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例28：化合物gx006對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx006對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為63.8％，69.1％，75.0％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例29：化合物gx007對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx007對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為32.6％，45.7％，61.9％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例30：化合物gx008對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx008對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為55.6％，68.5％，75.1％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例31：化合物gx009對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx009對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為21.7％，48.7％，52.7％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。

實(shí)施例32：化合物gx010對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的藥理實(shí)驗(yàn)

分別在5μm，10μm和20μm三個(gè)濃度下檢測(cè)化合物gx010對(duì)aβ25-35誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為51.3％，62.4％，68.5％。

空白組，不加aβ25-35也不加藥物。這一組的細(xì)胞存活率為100％。