本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)和基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的引物對(duì)、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

樹鼩(tupaiabelangeri，treeshrew)是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，在分類學(xué)上屬于哺乳綱，有胎盤類，是一個(gè)獨(dú)立的目，稱為攀鼩目(scandentia)。樹鼩主要分布在熱帶和亞熱帶，我國云南、廣西、廣東和海南等地廣泛分布，同時(shí)在東南亞的印度恒河北部、緬甸、越南、泰國、馬來西亞、印尼和菲律賓等地也都有分布。

樹鼩具有體型小，繁殖快，價(jià)較廉，易馴養(yǎng)和飼育，新陳代謝比犬、鼠等動(dòng)物更接近于人，解剖結(jié)構(gòu)也更近似于人，是一種重要的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它的許多分子與細(xì)胞結(jié)構(gòu)與人類近似。在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上的用途很多，受到許多學(xué)者的重視。目前利用樹鼩開展的研究已經(jīng)涉及到形態(tài)解剖學(xué)、生態(tài)學(xué)、行為學(xué)、人類學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、心理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、胚胎學(xué)、寄生蟲學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)以及運(yùn)動(dòng)生理、急慢性壓力的影響和應(yīng)激等社會(huì)生物學(xué)的研究。

樹鼩作為一種新的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物模型，其研究還處于早期階段，目前其重要的配套資源如重要蛋白的抗體的商品化仍未做到如小鼠等動(dòng)物的全面。細(xì)胞因子水平是研究機(jī)體免疫活動(dòng)的重要指標(biāo)，但由于目前樹鼩還未有成熟的商品化的細(xì)胞因子抗體，無法進(jìn)行基于抗原抗體技術(shù)的細(xì)胞因子水平檢測(cè)。但得益于樹鼩全基因組數(shù)據(jù)的獲得，可以通過檢測(cè)相關(guān)mrna的方法進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的引物對(duì)、探針、試劑盒及方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的引物對(duì)，所述引物對(duì)為：針對(duì)il-6檢測(cè)的如seqidno:1和seqidno:2所示的堿基序列、針對(duì)il-8檢測(cè)的如seqidno:3和seqidno:4所示的堿基序列、針對(duì)il-10檢測(cè)的如seqidno:5和seqidno:6所示的堿基序列、針對(duì)il-17a檢測(cè)的如seqidno:7和seqidno:8所示的堿基序列、以及針對(duì)inf-γ檢測(cè)的如seqidno:9和seqidno:10所示的堿基序列。

在其中一些實(shí)施例中，所述引物對(duì)還包括針對(duì)內(nèi)參樹鼩gapdh檢測(cè)的如seqidno:11和seqidno:12所示的堿基序列。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的探針，所述探針為：針對(duì)il-6檢測(cè)的如seqidno:13所示的堿基序列、針對(duì)il-8檢測(cè)的如seqidno:14所示的堿基序列、針對(duì)il-10檢測(cè)的如seqidno:15所示的堿基序列、針對(duì)il-17a檢測(cè)的如seqidno:16所示的堿基序列、以及針對(duì)inf-γ檢測(cè)的如seqidno:17所示的堿基序列。

在其中一些實(shí)施例中，所述探針還包括針對(duì)內(nèi)參樹鼩gapdh檢測(cè)的如seqidno:18所示的堿基序列。

在其中一些實(shí)施例中，所述探針的5'端標(biāo)記有fam熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有bhq1熒光淬滅基團(tuán)。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的試劑盒，所述試劑盒包括針對(duì)il-6檢測(cè)的如seqidno:1～2所示的引物對(duì)和如seqidno:13所示的探針、針對(duì)il-8檢測(cè)的如seqidno:3～4所示的引物對(duì)和如seqidno:14所示的探針、針對(duì)il-10檢測(cè)的如seqidno:5～6所示的引物對(duì)和如seqidno:15所示的探針、針對(duì)il-17a檢測(cè)的如seqidno:7～8所示的引物對(duì)和如seqidno:16所示的探針、以及針對(duì)inf-γ檢測(cè)的如seqidno:9～10所示的引物對(duì)和如seqidno:17所示的探針。

在其中一些實(shí)施例中，所述試劑盒還包括針對(duì)內(nèi)參樹鼩gapdh的如seqidno:11～12所示的引物對(duì)和如seqidno:18所示的探針。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的方法，以上述引物和探針，進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，檢測(cè)。

在其中一些實(shí)施例中，所述熒光定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：樣品核酸模板5μl、5×reactionbuffer5μl、正向引物7-15pmol、反向引物7-15pmol、探針0.5-5pmol、m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶50u、taqdnapolymerase1u、rnase-freedh2o補(bǔ)足25μl。

在其中一些實(shí)施例中，所述熒光定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃10分鐘；94℃2分鐘；94℃10秒、55℃35秒，40個(gè)循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明基于taqman探針法熒光定量pcr檢測(cè)，通過對(duì)常見的感染相關(guān)細(xì)胞因子：interleukin-6(il-6)、il-8、il-10、il-17a、interferon-γ(inf-γ)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)和探針，同時(shí)以樹鼩管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(reducedglyceraldehyde-phosphatedehydrogenase,gapdh)mrna作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物對(duì)和探針，用于監(jiān)測(cè)樣品效果及用于相對(duì)定量分析。設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針具有特異性高、靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單方便、成本低廉等多種優(yōu)點(diǎn)，有利于體內(nèi)細(xì)胞因子水平研究分析。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，不用于限定有權(quán)利要求所界定的本發(fā)明范圍。

圖1為本發(fā)明試驗(yàn)例1中測(cè)序分析樹鼩細(xì)胞因子熒光定量pcr的擴(kuò)增片段圖；

圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例2中樹鼩細(xì)胞因子及其內(nèi)參gapdh熒光定量pcr擴(kuò)增的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例3中樹鼩細(xì)胞因子及其內(nèi)參gapdh熒光定量pcr最低檢測(cè)模板的擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

以下實(shí)施例中所使用的試劑或原料，如無特殊說明，均來源于市售。

實(shí)施例1樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

本實(shí)施例的樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒包括以下成分：

1、樹鼩il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及內(nèi)參樹鼩gapdh跨內(nèi)含子引物、探針

通過genebank中樹鼩的il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及內(nèi)參樹鼩gapdhmrna的序列資料及樹鼩基因組序列信息，對(duì)跨內(nèi)含子保守區(qū)進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，詳細(xì)序列見表1所示。

表1跨內(nèi)含子細(xì)胞因子引物及探針序列

2、其他檢測(cè)試劑

使用優(yōu)化的5×一步法rt-pcr緩沖液(5×reactionbuffer(250mmtris-cl[ph8.9])，375mmkcl，20mmmgcl2，50％甘油)進(jìn)行試劑配制。

單次反應(yīng)總體積為25μl，其中

3、檢測(cè)方法

采用上述pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃10分鐘；94℃2分鐘；94℃10秒、55℃35秒、40個(gè)循環(huán)(讀值)，使用abi7500熒光定量pcr儀。

試驗(yàn)例1本發(fā)明實(shí)施例1的檢測(cè)方法的特異性和排除dna干擾能力試驗(yàn)

為驗(yàn)證本發(fā)明方法的特異性和排除dna干擾能力，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

1、使用樹鼩血液淋巴細(xì)胞、狗來源的mdck細(xì)胞、人來源的hep-2細(xì)胞及e.coli進(jìn)行特異性檢測(cè)，并通過測(cè)序驗(yàn)證；

2、同時(shí)設(shè)置加或不加逆轉(zhuǎn)錄酶m-mlv實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證跨內(nèi)含子引物探針設(shè)計(jì)的排除dna干擾的能力。

步驟如下：

(1)rna提取采用常規(guī)trizol(或柱提取法提取)提取。實(shí)驗(yàn)分別取2只樹鼩各1ml抗凝全血，使用常規(guī)淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，加入500μltrizol中進(jìn)行rna提取，最終得到50μl提取產(chǎn)物；分別提取細(xì)胞數(shù)為5×10⁵左右的mdck細(xì)胞2例、hep-2細(xì)胞2例及1ml過夜培養(yǎng)的e.colitop10、e.colidh5а各1例作為對(duì)照；

(2)一組使用含有m-mlv的完全配方試劑；另一組使用不含有m-mlv的不完全配方試劑(其他成分都一樣)各20μl/反應(yīng)，分別加入提取的核酸各5μl。上機(jī)，反應(yīng)條件為：48℃10分鐘，94℃2分鐘，40個(gè)循環(huán)條件為94℃10秒、55℃35秒(讀值)。設(shè)備使用abi7500熒光定量pcr儀，擴(kuò)增結(jié)果見表2所示。

表2特異性檢測(cè)及排除dna干擾測(cè)試結(jié)果

注：“–”為陰性；m-mlv(+)為完全配方加入逆轉(zhuǎn)錄酶；m-mlv(-)為不完全配方不加入逆轉(zhuǎn)錄酶。il：interleukin；inf-γ：interferon-γ；gapdh：磷酸甘油醛脫氫酶(reducedglyceraldehyde-phosphatedehydrogenase)。

表2結(jié)果表明本發(fā)明的細(xì)胞因子檢測(cè)體系具有良好的特異性和排除dna干擾的能力，未在非樹鼩來源的樣品中檢測(cè)出陽性。

(3)擴(kuò)增后陽性片段使用膠回收后用于pmd-18t(takara)連接，通過連接、轉(zhuǎn)化、單克隆挑取培養(yǎng)后用于測(cè)序分析，并對(duì)比結(jié)果是否為正確的樹鼩細(xì)胞因子序列。特異性篩選測(cè)序結(jié)果見圖1所示，結(jié)果對(duì)比表明確為樹鼩目標(biāo)核酸。同時(shí)，未加逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品檢測(cè)中都為陰性，說明跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的引物探針組合可以排除dna的干擾，解決了樣品中dna去除的問題。保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

綜上，所設(shè)計(jì)的樹鼩常見感染相關(guān)的細(xì)胞因子熒光定量pcr檢測(cè)方法具有良好的特異性。

試驗(yàn)例2本發(fā)明的檢測(cè)試劑的擴(kuò)增線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用已經(jīng)構(gòu)建的含有樹鼩目標(biāo)檢測(cè)片段的t載體克隆質(zhì)粒作為靈敏度實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)其線性范圍及最低檢測(cè)水平進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。具體如下：

(1)質(zhì)粒dna提取，提取含il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及gapdh各目標(biāo)片段的t載體克隆質(zhì)粒dna；

(2)使用nanodropone(thermoscientific)測(cè)量其各自濃度。

(3)根據(jù)其各自分子量和濃度，再根據(jù)1摩爾數(shù)與6.02214129×10²³分子數(shù)，摩爾＝質(zhì)量/分子量計(jì)算得出各質(zhì)粒最終的分子濃度分別為5.85×10¹⁰copies/μl、6.76×10¹⁰copies/μl、7.02×10¹⁰copies/μl、6.46×10¹⁰copies/μl、7.29×10¹⁰copies/μl、5.34×10¹⁰copies/μl；

(4)梯度稀釋質(zhì)粒dna，使模板中分別各含有0.2×10¹⁰、0.2×10⁹、0.2×10⁸、0.2×10⁷、0.2×10⁶、0.2×10⁵、0.2×10⁴、0.2×10³、0.2×10²、0.2×10¹、0.2×10⁰copies/μl的質(zhì)粒。

(5)使用5μl稀釋好的模板進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，驗(yàn)證實(shí)施例1的方法的線性范圍。通過檢測(cè)測(cè)得各細(xì)胞因子檢測(cè)試劑線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表3、圖2所示。

表3熒光定量pcr擴(kuò)增線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3和圖2結(jié)果可見，所建立的方法的有較寬的線性范圍，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r²均大于0.99，說明所建立的系列試劑適用于不同濃度的樣品檢測(cè)。同時(shí)其標(biāo)準(zhǔn)曲線基本平行，有利于進(jìn)行相對(duì)定量分析。

試驗(yàn)例3本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的最低檢測(cè)量

為驗(yàn)證本發(fā)明的試劑盒的最低核酸檢測(cè)量，使用低濃度的含目標(biāo)片段的t載體質(zhì)粒dna，逐步稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

(1)使用0.2×2¹⁰copies/μl(5μl上樣量為1024copies)的含各目標(biāo)片段的t載體質(zhì)粒作為模板，2倍倍比稀釋至0.2×2⁰(5μl上樣量為1copy)即：0.2×2¹⁰、0.2×2⁹、0.2×2⁸、0.2×2⁷、0.2×2⁶、0.2×2⁵、0.2×2⁴、0.2×2³、0.2×2²、0.2×2¹、0.2×2⁰copies/μl。

(2)使用5μl稀釋好的模板進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑最低可檢測(cè)到：il-6：8copies、il-8：8copies、il-10：4copies、il-17a：8copies、inf-γ：128copies及gapdh：4copies。其擴(kuò)增曲線在此濃度下仍可清晰判斷陰陽性。

綜合以上試驗(yàn)例1～3表明，本發(fā)明的常見感染相關(guān)的樹鼩細(xì)胞因子及其內(nèi)參gapdh熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒具有特異性高、靈敏度高、線性范圍廣等特點(diǎn)，可以用于樹鼩常見感染相關(guān)的細(xì)胞因子檢測(cè)工作，具有良好的應(yīng)用前景。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

<110>廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

<120>熒光定量pcr檢測(cè)樹鼩常見感染相關(guān)細(xì)胞因子的引物對(duì)、探針、試劑盒及方法

<160>18

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgctgaagcaaaaggaaacgt21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccatcaagctggcatttgaa20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gacttccaagctggctattgct22

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttcttgtcaaaactgcagcttca23

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gggagggtgaagactttctttcaa24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cttcagcagagactcactcagcaa24

<210>7

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

caaaagagcctcagattactacaaacg27

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gggatatctctcagggtcctcat23

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgctttctatcattttgggatcttc25

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcctggatcagttgcattaaaatagt26

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

aaggtcggagtaaacggatttg22

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cgttgatggccacgacatc19

<210>13

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

ccaagtatagttcccacccctgaccca27

<210>14

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ttggcagccttaatgttctctgcagctc28

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

ccagtgatcagctggaca18

<210>16

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

tccacttcaccttggactctccaccg26

<210>17

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

agctgttactgccaggccccatttatg27

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

tggtcaccagggctgccttcaac23