本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種與喉鱗癌相關(guān)的基因及其應(yīng)用，具體的所述基因為spocd1。

背景技術(shù)：

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年隨著空氣污染的日益加重，喉癌的發(fā)病率逐年上升。男性發(fā)病居多，越發(fā)達國家的發(fā)病率越高。每年新發(fā)病人男性為3.5～5.5/10萬，女性為0.6/10萬，男性死亡率約2.4/10萬，女性死亡率約0.3/10萬。喉癌患者中鱗狀細胞癌所占比例最大，約95％左右。喉癌雖可通過手術(shù)、化療、放療等多種手段進行綜合治療，但仍有部分患者，雖經(jīng)根治手術(shù)和放化療，仍因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，難以救治以致死亡。喉癌依然嚴重威脅著患者的生命安全，迫切需要找到更為有效的腫瘤預(yù)防和治療方法。

早期診斷和治療對喉癌的預(yù)后至關(guān)重要。臨床上，診斷喉癌的主要方法有：影像學(xué)檢查，內(nèi)窺鏡檢查，組織細胞學(xué)檢查及生物化學(xué)檢查等。但即使目前最精確的檢測方法或手段也僅僅只能發(fā)現(xiàn)0.1cm左右的腫塊。當(dāng)腫瘤從無癥狀長到為所能覺察的大小時，部分腫瘤已經(jīng)處于中晚期，甚至有的腫瘤已經(jīng)發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移，進而喪失了治療的最佳時機。目前，喉癌綜合治療5年生存率為60％-70％。其中，早期喉癌治療效果較好，喉功能可得以保留，5年生存率可達80％-95％；晚期喉癌由于浸潤和轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率較高，治療效果差，5年生存率在60％以下。因此，深入研究喉癌的發(fā)病機制，篩選用于喉癌早期診斷、預(yù)后相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物，具有重大的科學(xué)意義與臨床價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，通過檢測樣本中該基因的表達水平，可以判斷患者是否患有喉鱗癌或者患喉鱗癌的風(fēng)險的大小，通過靶向于該基因，改變該基因的表達水平或活性，可以實現(xiàn)喉鱗癌患者的精準靶向治療。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測spocd1表達水平的試劑在制備診斷喉鱗癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進一步，所述試劑包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、免疫檢測、原味雜家或芯片技術(shù)檢測spocd1表達水平用試劑。

進一步，所述試劑包括針對spocd1基因的引物和/或探針，或針對spocd1蛋白的抗體和/或配體。

本發(fā)明提供了一種診斷喉鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括樣本中檢測spocd1表達水平的芯片、制劑或試劑盒。

進一步，所述試劑盒包括至少一對特異性擴增spocd1基因的引物；優(yōu)選的，所述引物具有seqidno.1～2所示的序列。

本發(fā)明提供了spocd1在篩選預(yù)防或治療喉鱗癌的候選化合物中的應(yīng)用。

進一步，篩選候選化合物的步驟如下：

用候選物質(zhì)處理表達或含有spocd1基因或其編碼的蛋白的體系；和

檢測所述體系中spocd1基因或其編碼的蛋白的表達或活性；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低spocd1基因或其編碼的蛋白的表達或活性優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療喉鱗癌的候選化合物。

在本發(fā)明中，所述體系包括(但不限于)：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。所述候選化合物包括(但不限于)：針對spocd1基因或其上游或下游基因設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物。

在本發(fā)明中，所述的步驟還包括：對獲得的候選化合物進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選化合物中進一步選擇和確定對于預(yù)防、緩解或治療喉鱗癌有用的物質(zhì)。

本發(fā)明提供了spocd1功能性表達的抑制劑在制備預(yù)防或治療喉鱗癌的藥物組合物中的應(yīng)用。所述spocd1功能性表達的抑制劑包括核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子。其中核酸抑制物選自：以spocd1或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制spocd1基因表達或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物。蛋白結(jié)合分子選自：與spocd1蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)，如能夠抑制spocd1蛋白活性的抗體或配體。

進一步，所述抑制劑為sirna；優(yōu)選的，所述sirna序列如seqidno.9～10所示。在篩選有效的sirna序列時，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染喉鱗癌細胞系進行驗證，選出干擾效果最佳的sirna(在本發(fā)明中，最佳sirna序列如seqidno.9～10所示)。

本發(fā)明中的核酸抑制劑如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。

本發(fā)明提供了一種治療喉鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括spocd1功能性表達的抑制劑，和/或與所述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

所述spocd1功能性表達的抑制劑是指任何可降低spocd1蛋白的活性、降低spocd1基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)spocd1蛋白的表達、減少spocd1蛋白有效作用時間、或抑制spocd1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)spocd1有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療喉鱗癌。例如所述的抑制劑包括核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子。

所述藥學(xué)上可接受的載體包括(但不限于)稀釋劑、賦形劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤滑劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測spocd1基因在喉鱗癌組織中的表達情況圖；

圖2是利用westernblot檢測spocd1蛋白在喉鱗癌組織中的表達情況圖；

圖3是利用qpcr檢測sirna轉(zhuǎn)染對喉鱗癌細胞中spocd1基因表達的影響圖；

圖4是利用westernblot檢測sirna轉(zhuǎn)染對喉鱗癌細胞中spocd1蛋白表達的影響圖；

圖5是用mtt法檢測spocd1基因?qū)眵[癌細胞增殖的影響圖；

圖6是用流式細胞儀檢測spocd1基因?qū)眵[癌細胞凋亡的影響圖；

圖7是利用細胞劃痕實驗檢測spocd1對喉鱗癌細胞遷移的影響圖；

圖8是利用transwell小室檢測spocd1對喉鱗癌細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量測序方法，檢測喉鱗癌標(biāo)本中基因在腫瘤組織和正常癌旁粘膜組織的表達，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的基因，探討其與喉鱗癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為喉鱗癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了喉鱗癌中spocd1顯著性上調(diào)。實驗證明，通過降低spocd1的表達水平，能夠有效地抑制喉鱗癌細胞的生長、凋亡和侵襲，提示檢測spocd1基因的表達水平可成為喉鱗癌早期診斷的輔助診斷指標(biāo)之一，干擾spocd1基因表達可成為預(yù)防或治療喉鱗癌或喉鱗癌轉(zhuǎn)移的新途徑。

spocd1基因

spocd1是位于人1號染色體短臂3區(qū)5帶上，本發(fā)明中的spocd1包括野生型、突變型或其片段。一種代表性的spocd1基因序列如目前國際公共核酸數(shù)據(jù)庫genebank中spocd1基因(nc_000001.11)所示；本發(fā)明的人spocd1核苷酸全長序列或其片段通常可以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。

本發(fā)明的基因使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種檢測技術(shù)進行檢測，這些技術(shù)包括但不限于：核酸測序、核酸雜交、核酸擴增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、免疫檢測技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，所有的檢測技術(shù)都可作為本發(fā)明的輔助手段以實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案。

芯片、試劑盒

在本發(fā)明中，“芯片”、“微陣列”、“陣列”可以等同替代，包括但不限于：dna微陣列(例如，cdna微陣列和寡核苷酸微陣列)、蛋白質(zhì)微陣列、組織微陣列、轉(zhuǎn)染或細胞微陣列、化學(xué)化合物微陣列和抗體微陣列。通常稱為基因芯片、dna芯片或生物芯片的dna微陣列是微觀dna點的集合，這些點連接到固體表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于對數(shù)千種基因同時進行表達譜分析或表達水平監(jiān)測的陣列。固定的dna片段稱為探針，其數(shù)千個可用于單個dna微陣列中。微陣列可用于通過比較疾病和正常細胞中的基因表達而識別疾病基因或轉(zhuǎn)錄本(例如，ncrna)。微陣列可使用多種技術(shù)加以制造，包括但不限于：用細尖針印刷到載玻片上、使用預(yù)制的掩模進行光刻、使用動態(tài)微鏡器件進行光刻、噴墨印刷或微電極陣列上的電化學(xué)方法。

本發(fā)明中的試劑盒可用于檢測spocd1的表達，優(yōu)選的，所述的試劑盒包括檢測有效量的檢測spocd1基因的試劑，選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑。例如用于混懸或固定細胞的溶液，可檢測的標(biāo)簽或標(biāo)記，使核酸易于雜交的溶液，用于裂解細胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。

本發(fā)明的試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑盒進行檢測，和如何利用檢測結(jié)果對腫瘤發(fā)展進行判斷、對治療方案進行選擇。

采用本發(fā)明的試劑盒，可通過選自下組的各種方法(包括但不限于)檢測spocd1：實時定量反轉(zhuǎn)錄pcr、生物芯片檢測法、dna印跡法、或rna印跡法或原位雜交法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)實際條件和需要對檢測方式進行調(diào)整和改變。

抑制劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種spocd1的抑制劑的用途，用于制備抑制喉鱗癌的藥物組合物。如本文所用，所述的spocd1的抑制劑包括但不限于抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。

所述的spocd1基因或蛋白的抑制劑是指任何可降低spocd1蛋白的活性、降低spocd1基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)spocd1蛋白的表達、減少spocd1蛋白有效作用時間、或抑制spocd1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明。

作為本發(fā)明的一種選擇方式，所述的spocd1的抑制劑是一種特異性與spocd結(jié)合的抗體。所述特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體；本發(fā)明不僅包括完整的抗體分子，也包括抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與spocd1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述spocd1的抑制劑是一種spocd1特異性的小干擾rna分子。如本文所用，所述的“小干擾rna”是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補序列的mrna為靶目標(biāo)降解特定的mrna，這個過程就是rna干擾(rnainterference)過程。小干擾rna可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈rna復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈rna復(fù)合物。

在篩選有效的sirna序列時，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染喉鱗癌細胞系進行驗證，選出干擾效果最佳的sirna，它們分別具有seqidno.9、seqidno.10所示的序列，進一步地在細胞水平實驗，結(jié)果證明對于細胞試驗而言抑制效率非常高。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。

作為本發(fā)明的一種可選方式，所述的spocd1的抑制劑也可以是一種“小發(fā)夾rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小rna分子，小發(fā)夾rna能夠通過rna干擾途徑來抑制基因的表達。如上述，shrna可以由雙鏈dna模板來表達。雙鏈dna模板被插進一個載體，例如質(zhì)?；虿《据d體，然后在體外或體內(nèi)連接到一個啟動子進行表達。shrna在真核細胞內(nèi)dicer酶的作用下，可被切割成小干擾rna分子，從而進入rnai途徑。“shrna表達載體”是指一些本領(lǐng)域常規(guī)用于構(gòu)建shrna結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，通常該質(zhì)粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點或供替換序列，從而人們可以將shrna(或類似物)相應(yīng)的dna序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點或替換其上的供替換序列，該dna序列轉(zhuǎn)錄后的rna可形成shrna(shorthairpin)結(jié)構(gòu)。所述的“shrna表達載體”目前已經(jīng)完全可以通過商購的途徑購買獲得，例如一些病毒載體。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的spocd1的抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制喉鱗癌。任何前述的spocd1的抑制劑均可用于組合物的制備。所述載體包括(但不限于)稀釋劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤滑劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：所述的spocd1基因的抑制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。

本發(fā)明的藥物組合物還可以與其他治療喉鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將spocd1的抑制劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶spocd1的抑制劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點上，并使之表達活性的spocd1抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明中，術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的組織或材料，其可包括本發(fā)明的標(biāo)志物。在本發(fā)明的具體實施例中，樣品可以是腫瘤或肺腫瘤組織，并且可包括例如含有來自其的與喉組織相關(guān)的細胞或標(biāo)志物的任何組織或材料。

在本發(fā)明的具體實施例中，實驗都是按照至少重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，癌組織與正常癌旁粘膜組織的配對比較采用t檢驗，認為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與喉鱗癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例喉鱗癌組織及對應(yīng)的正常黏膜組織樣本，組織樣本的取得獲得患者的知情同意，并且取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

1)加入液氮研磨組織至粉末，加入1mltrizol(invitrogen)溶液，吹打混勻，使組織充分裂解，靜置5min；

2)12000rpm4℃離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mlrnasefreeep管中；

3)加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置15min；

4)4℃環(huán)境中12000g離15min，溶液離心為三層，rna在上層水相，移至另一個新的rnasefreeep管；

5)加入0.5ml異丙醇，輕柔充分混勻，室溫靜置10min；

6)4℃下，12000g離心10min，加入與rnaisoplus等體積的75％乙醇沉淀rna，7500g4℃離心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗滌兩次，超凈臺風(fēng)干；加入30μldepc水溶解沉淀。

8)rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanodrop2000對所提取的rna濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

使用ribo-zero試劑盒除去總rna中的核糖體rna。

4、構(gòu)建cdna文庫

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit進行cdna文庫的構(gòu)建，具體操作按說明書進行。

5、上機測序

使用hiseq4000測序平臺對cdna文庫進行測序，具體操作按說明書進行。

6、高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，利用tophatv1.3.1進行rna-seq讀段定位，通過cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進行標(biāo)準化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度，利用cuffdiff檢測差異表達，當(dāng)p值<0.001，|log2(fold_change)normalized|>2時，認為mrna顯著差異表達。

7、結(jié)果

rna-seq結(jié)果顯示，在喉鱗癌患者中差異表達的基因有665個，上調(diào)的450個，下調(diào)的215個，其中基因spocd1在喉鱗癌組織中的表達量顯著高于正常癌旁黏膜組織中的表達量。

實施例2qpcr測序驗證spocd1基因的差異表達

1、對spocd1基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇喉鱗癌患者正常癌旁粘膜組織和喉鱗癌組織各50例。

2、rna提取具體步驟如實施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

3、逆轉(zhuǎn)錄：采用fastquantcdna第一鏈合成試劑盒(貨號：kr106)進行mrna反轉(zhuǎn)錄。具體步驟如下：

(1)加入5×gdnabuffer2.0μl，總rna1μg，加rnasefreeddh2o使總體積至10μl，水浴鍋中42℃加熱3min；

(2)構(gòu)建20μl反應(yīng)體系，10×fastrtbuffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混勻；

(3)水浴鍋中42℃加熱15min，95℃加熱3min，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

4、qpcr擴增

(1)引物設(shè)計

根據(jù)genebank中spocd1基因和管家基因gapdh基因的編碼序列設(shè)計qpcr擴增引物，由博邁德公司合成。其中，spocd1基因的引物序列如seqidno.1～2所示；gapdh基因的引物序列如seqidno.3～4所示。

(2)pcr反應(yīng)體系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×superrealpremixplus10μl，dna模板2μl，ddh2o7.4μl，50×roxreferencedye^△2μl，滅菌蒸餾水4.8μl。

(3)pcr反應(yīng)條件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40個循環(huán)，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在abi7300型熒光定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與喉鱗癌正常癌旁粘膜組織相比，spocd1在喉鱗癌組織中表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，同高通量測序結(jié)果一致。

實施例3蛋白免疫印記實驗檢測spocd1蛋白的差異表達

1、組織總蛋白的提取

用剪刀剪碎組織后將其放入置于冰內(nèi)的玻璃勻漿器內(nèi)，ripa裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，按照每20mg組織標(biāo)本加入100μl裂解液的比例加入相應(yīng)量的ripa裂解液，玻璃勻漿器碾碎組織直至其充分裂解，將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min，收集上清。

2、總蛋白濃度測定

按照bca蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行蛋白濃度的測定。

3、sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進行電泳。

4、western檢測

1)電轉(zhuǎn)移

將pvdf膜放入甲醇溶液中激活5min，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡20min。取出page膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，切下相應(yīng)的page膠，按照由下到上依次為濾紙、pvdf膜、page膠、濾紙的順序放到半干的轉(zhuǎn)膜儀中，恒壓25v轉(zhuǎn)膜1.5h；

2)免疫雜交

取出pvdf膜，pbs沖洗后置于5％bsa溶液中室溫下?lián)u動封閉2h，將pvdf膜放入雜交袋中，加入一抗過夜，用tbst緩沖液洗滌pvdf膜，再加入相應(yīng)的二抗，室溫下孵育2h，tbst緩沖液洗滌。

3)dab顯色

pvdf膜稍干后滴加新鮮配制的dab顯色液，pvdf膜顯色后掃描記錄。以β-actin作為內(nèi)參照，采用quantityone凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行半定量灰度分析，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均灰度值；

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，spocd1蛋白在喉鱗癌組織中的表達水平顯著高于正常癌旁粘膜組織。

實施例4spocd1基因的沉默

1、細胞培養(yǎng)

人喉鱗癌細胞株hep2，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，細胞生長良好，呈單層貼壁生長。使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、轉(zhuǎn)染

1)轉(zhuǎn)染前細胞的處理

轉(zhuǎn)染前一天，6孔培養(yǎng)板上種3～5×10⁵個細胞/孔，在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，轉(zhuǎn)染時細胞密度為30～50％，于轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)基。

2)sirna的設(shè)計

陰性對照sirna序列(sirna-nc)的序列如seqidno.5～6所示，sirna1序列如seqidno.7～8所示；sirna2序列如seqidno.9～10所示。

將實驗分為三組：對照組(hep2)、陰性對照組(sirna-nc)和實驗組(sirna1、sirna2)，其中陰性對照組sirna與spocd1基因的序列無同源性。

3)轉(zhuǎn)染

a.取濃度為50pmol的sirna3μl加入47μl的無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5min；

b.取1μllipofectamine2000加入49μl無血清培養(yǎng)基。輕輕混勻，室溫孵育5min；

c.將上述兩種混合物混合(總體積100μl)，輕輕混勻，室溫下孵育25min，以使復(fù)合體形成；

d.在6孔板中每孔加入100μl的復(fù)合物及適量培養(yǎng)基，輕輕混勻；

e.孵育48～96h后觀察基因的沉默效應(yīng)。

5、qpcr檢測spocd1基因的轉(zhuǎn)錄水平

5.1細胞總rna的提取

采用qiagen的細胞rna提取試劑盒對細胞中的rna進行提取，實驗操作按照說明書進行。

5.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

5.3qpcr擴增步驟同實施例2。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染sirna-nc組相比，實驗組sirna2表達水平降低最為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

實施例5westernblot檢測轉(zhuǎn)染sirna對spocd1蛋白表達的影響

1、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

步驟同實施例4

2、細胞總蛋白的提取

收集處于對數(shù)期的不同處理組的細胞，用預(yù)冷的pbs洗滌細胞。將ripa細胞裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，向細胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用細胞刮刀將裂解的細胞刮下來，使用移液器將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min。小心收集離心后的上清。

3、總蛋白濃度測定

按照bca蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行蛋白濃度的測定。

4、sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進行電泳。

5、western檢測

步驟詳見實施例3。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染sirna2組的細胞中的spocd1蛋白表達量顯著下調(diào)。

實施例6spocd1基因?qū)眵[癌細胞增殖的影響

采用mtt實驗檢測spocd1基因?qū)眵[癌細胞增殖能力影響。

1、取生長狀況良好的細胞，常規(guī)消化成單細胞懸液后，計數(shù)細胞，將細胞稀釋成合適濃度的細胞懸液；

2、于96孔培養(yǎng)板中，將稀釋后的不同處理組細胞每孔接種2000細胞，至少設(shè)3個平行孔，37℃、5％co2培養(yǎng)24h；

3、于接種后1、2、3、4、5天每天取出3孔細胞以mtt法檢測其490nm的od值，進行計數(shù)，計算平均值；

4、檢測前棄去上清液，培養(yǎng)液洗3次，每孔加入mtt無血清培養(yǎng)基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h；

5、終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μldmso，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上用波長為490nm測定光密度(od)值，以時間為橫軸，光密度值為縱軸繪制細胞生長曲線。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與對照相比，實驗組在轉(zhuǎn)染sirna2后，細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)說明spocd1具有促進細胞增殖的作用。

實施例7spocd1基因?qū)眵[癌細胞凋亡的影響

使用流式細胞儀檢測spocd1基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

3、步驟

1)將處于對數(shù)生長期的不同處理組的細胞經(jīng)胰酶消化后吹打成細胞懸液并計數(shù)。取10⁶量的細胞懸液，1000rpm離心5min；

2)棄上清，加入195μlannexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞；

3)加入5μl的annexinv-fitc，輕柔混勻，室溫下避光孵育10min；

4)1000rpm離心5min，棄上清，加入190μl的annexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞；

5)加入10μl碘化丙啶(pi)染色液，輕柔混勻，冰浴避光放置，進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖6所示，實驗組與對照組相比，細胞的凋亡率顯著升高，說明spocd1的過表達抑制喉鱗癌細胞的凋亡(p<0.05)。

實施例8細胞劃痕實驗

1、向6孔板中每孔加入1ml50μg/ml的纖連蛋白，并置于4℃冰箱中過夜；

2、棄去剩余的纖連蛋白溶液，用無血清培養(yǎng)基清洗，將處于對數(shù)生長期的不同處理組細胞經(jīng)胰酶消化重懸后，接種于鋪有纖連蛋白的6孔板中，每組細胞設(shè)2個復(fù)孔，每孔5×10⁵個細胞；

3、置入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

4、待細胞長至約90％融合時，用10μl的tip頭劃出一條無細胞的細痕，pbs溶液洗去脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

5、分別于劃痕后0h、48h觀察細胞劃痕處的愈合情況并拍照。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)染sirna2組的細胞相比對照組而言，細胞體外劃痕后的遷移距離明顯降低，而對照組之間無顯著差異，說明spocd1過表達可以促進喉癌細胞的遷移。

實施例9細胞侵襲實驗

1、transwell小室制備

將50mg/l的matrigel膠用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1:8的比例稀釋、混勻，包被transwell小室的底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。取60μl～80μl稀釋的matrigel膠(3.9μg/μl)置于孔徑為8μm的transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被matrigel覆蓋，置于37℃30min使matrigel聚合成凝膠。

2、配置細胞懸液

將處于對數(shù)生長期的不同處理組的細胞經(jīng)胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細胞濃度為5×10⁴個/ml。

3、細胞接種

在transwell上室加入2ml的細胞懸液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)20-24h；取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細胞。

4、染色

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細胞，下室面用95％酒精固定15min后，蘇木素染色2min，倒置顯微鏡下隨機取5個高倍鏡視野觀察、計數(shù)并拍照。計數(shù)小室下室面的細胞數(shù)即為穿透matrigel膠的細胞數(shù)，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果，并以該細胞數(shù)代表腫瘤細胞的侵襲力，實驗重復(fù)3次，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，實驗組的細胞穿過transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數(shù)明顯減少，而對照組之間無明顯差異，結(jié)果說明spocd1過表達可以促進喉鱗癌的侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>一種與喉鱗癌相關(guān)的基因及其應(yīng)用

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