本發(fā)明涉及分子生物學領域，更具體地，涉及鑒別無蠟粉不結球白菜的引物、試劑盒以及鑒別方法。

背景技術：

植物蠟質(zhì)是指覆蓋在植物表皮細胞外的一層由親脂性一系列大于18個碳原子、主要由24到34個碳原子構成的超長鏈脂肪酸(very-long-chainfattyacids)化合物構成的疏水層，植物的葉、莖、花以及果實等器官和組織的表面均有蠟質(zhì)覆蓋。植物蠟質(zhì)由長鏈飽和脂肪酸、醇類、烷烴類、醛類、酮類等物質(zhì)組成(kunst和samuels2003)。分布在植物角質(zhì)層表面的表皮蠟質(zhì)層是植物抵抗外界環(huán)境刺激的第一道屏障，具有防止非氣孔性水分喪失、抵抗病菌入侵和防止昆蟲蠶食等作用，還能抵抗紫外輻射和霜凍等非生物逆境的影響。不同的植物種類其蠟質(zhì)組成和含量有很大的差別，甚至同一植物的不同部位其蠟質(zhì)含量都有很大的差異。通過對模式植物擬南芥及其他一些植物的研究發(fā)現(xiàn)，表皮蠟質(zhì)的脂肪族成份是由長鏈飽和脂肪酸(vlcfa)在表皮細胞中合成的。vlcfa蠟質(zhì)前體的形成是一個復雜的過程，它通過在不同亞細胞部位的兩個階段來合成，具體可分為兩步，即：質(zhì)體內(nèi)c16和c18?；溨舅岬膹念^合成和質(zhì)體外c16或c18飽和脂肪酸延長及各種衍生物的合成。大多數(shù)植物蠟質(zhì)的合成有兩條基本途徑：脫羰途徑和酰基還原途徑。脫羰途徑生成醛、烷烴、次級醇和酮，而?；€原途徑生成初級醇和蠟酯。

不結球白菜根據(jù)葉片和薹莖的表皮蠟質(zhì)的有無，分為有蠟粉和無蠟粉兩種類型，一般情況下，有蠟粉類型的不結球白菜生長勢旺盛發(fā)薹能力強，產(chǎn)量高，抗逆性強，無蠟粉類型的不結球白菜生長勢較弱，產(chǎn)量相對低些，其優(yōu)點是菜薹表皮上無蠟粉，光亮，商品性好。目前對于蕓薹屬植物無蠟粉性狀遺傳規(guī)律有了較廣泛的研究，但其在不同材料之間存在著多樣性。因此，如何有效地鑒別無蠟粉性狀的不結球白菜，更好地滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不同需求，是目前亟需解決的問題之一。而關于不結球白菜無蠟粉性狀分子標記方面的研究，目前尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決如何有效地鑒別無蠟粉性狀的不結球白菜，本發(fā)明提供了一種用于鑒別無蠟粉不結球白菜葉片的引物，該引物包括：

brcer1-sf：5’-ctaccattcccaccaccac-3’，如seqidno.1所示；

brcer1-sr：5’-gaaagacgctatggatgccg-3’，seqidno.2所示。

本發(fā)明通過兩個有無蠟粉性狀的不結球白菜自交系構建f1和f2分離群體，在分析蠟粉性狀的遺傳基礎上，通過對蕓薹屬作物中已克隆的控制無蠟粉性狀基因在兩個親本中的基因序列和啟動子序列比對，根據(jù)39-bp序列丟失設計基因特異引物(共顯性標記)并驗證該標記與無蠟粉性狀共分離，得出brcer1基因為控制不結球白菜無蠟粉性狀的候選基因。得到的基因特異性引物(共顯性標記)brcer1-sf和brcer1-sr能有效地鑒別出無蠟粉性狀的不結球白菜。

本發(fā)明還提供了一種含有上述引物的試劑盒。

本發(fā)明還提供了一種含有上述引物的鑒別試劑。

進一步地，試劑盒或鑒別試劑中還包括tris-hcl、(nh4)2so4、mgcl2、tritonx-100、dntps、taq酶和模板dna。

該試劑盒或鑒別試劑包括用于鑒別無蠟粉性狀的不結球白菜的引物，通過引物結合上述試劑，能夠高效地鑒別出無蠟粉性狀的不結球白菜。

為了使鑒別更快速和高效，該試劑盒中還包括10mmol/ltris-hcl、10mmol/l(nh4)2so4、10mmol/lmgcl2、0.1％tritonx-100、0.2mmol/ldntps、0.5utaq酶和100ng模板dna。

本發(fā)明還提供了一種鑒別無蠟粉不結球白菜的方法，包括：

(1)提取樣品dna；

(2)以步驟(1)提取的dna為模板，利用權利要求1所述引物對所述不結球白菜植株樣品進行pcr擴增；其中，所述引物包括：

brcer1-sf：5’-ctaccattcccaccaccac-3’，如seqidno.1所示；

brcer1-sr：5’-gaaagacgctatggatgccg-3’，seqidno.2所示；

(3)分析pcr產(chǎn)物。

進一步地，為了更精確的鑒別，步驟(1)具體為：

播種不結球白菜植株樣品于穴盤中，在苗期采用ctab法提取dna。

本發(fā)明實施例中的ctab法為本領域中常用的ctab法。其中，ctab的濃度優(yōu)選為0.8wt％。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，為了能更好地擴增，使結果更準確，步驟(2)中，pcr擴增體系包括：以10μl計，10mmol/ltris-hcl、10mmol/l(nh4)2so4、10mmol/lmgcl2、0.1％tritonx-100、0.2mmol/ldntps、0.5utaq酶、100ng模板dna、10ng引物brcer1-sf和10ngbrcer1-sr。

其中，brcer1-sf和brcer1-sr的核苷酸序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示。

進一步地，在該步驟(2)中，pcr反應條件為：94℃預變性1min后，94℃反應30s，55℃反應30s，72℃反應1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸8min。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，步驟(3)具體為：將pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、eb染色后，應用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄；統(tǒng)計帶型，鑒別出aa基因型無蠟粉性狀不結球白菜。

其中，瓊脂糖凝膠電泳通常為1.5％瓊脂糖凝膠電泳，和eb染色均可以使用本領域中常見的瓊脂糖凝膠電泳和eb染色步驟。

其中，凝膠圖像分析系統(tǒng)為gds-7600(uvp)。

在鑒別出無蠟粉不結球白菜后，將其篩選出，并將對應的植株適時移栽到大田里。

本發(fā)明運用分子生物學技術，通過兩個有無蠟粉性狀的不結球白菜自交系構建f1和f2分離群體，得到一對引物brcer1-sf和brcer1-sr，使用上述引物可以有效地鑒別出無蠟粉的不結球白菜，為中國特色蔬菜-不結球白菜的品質(zhì)性狀育種提供理論依據(jù)和材料來源，為實現(xiàn)品質(zhì)性狀育種提供理論依據(jù)，材料來源連鎖標記輔助篩選有助于提高品質(zhì)育種方法的效率，更有助于根據(jù)實際情況培育出所需要的品種。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中基因特異引物(共顯性標記)在f2單株中的擴增結果。

圖2為本發(fā)明實施例1中不結球白菜有臘粉自交系和無蠟粉自交系的田間性狀表型圖；

圖3為本發(fā)明實施例1中的技術路線圖。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)技術手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。

實施例1

本實施例的技術路線圖如圖3所示。

引物的選擇

(1)親本選擇

親本材料13s126(無蠟粉)為綠色光亮的多代自交不親和系，中熟，株高中等，植株開展度較小，葉較小，葉柄長，產(chǎn)量低，品質(zhì)好；另一自交不親和系親本材料13s106(有蠟粉),中熟，株高中等，植株開展度較小，葉較大，葉柄長，產(chǎn)量高，品質(zhì)較差。

(2)親本和f1、f2后代田間表型調(diào)查

2014年-2016年在華中農(nóng)業(yè)大學蔬菜改良中心試驗田，種植兩個親本、f1并套袋自交，單株收獲種子播成小區(qū)，成熟期調(diào)查親本和后代表型。f2代蠟粉植株與無蠟粉植株接近3:1。其中，圖2是不結球白菜有臘粉自交系和不結球白菜無蠟粉自交系的田間性狀表型圖。不結球白菜中無蠟粉性狀的遺傳規(guī)律見下表1。

表1不結球白菜中無蠟粉性狀的遺傳規(guī)律信息

(3)連鎖標記的開發(fā)和驗證

根據(jù)在蕓薹屬作物中已克隆的控制無蠟粉性狀基因，驗證不結球白菜無蠟粉性狀中是否由相同位點控制，對兩個不結球白菜親本進行cgl1和brwax1進行全長基因和啟動子的克隆，通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)無蠟粉親本在brcer1基因(與cgl1基因同源)中發(fā)生了39-bp的丟失。根據(jù)丟失區(qū)域設計了1對共顯性標記(基因特異性引物)對無蠟粉植株進行篩選，發(fā)現(xiàn)該標記與無蠟粉性狀共分離。共顯性標記，也稱基因特異性引物，其信息見下表2。

表2brcer1-sf和brcer1-sr序列

無蠟粉不結白菜的鑒別和選育

(4)播種不結球白菜植株于穴盤中，苗期采用ctab法(ctab濃度為0.8％)提取dna。

(5)用步驟(4)得到的dna，用步驟(3)中得到的共顯性標記(基因特異引物)對植株進行pcr擴增；

其中，pcr擴增反應總體積為10μl，內(nèi)含10mmol/ltris-hclph9.0、10mmol/l(nh4)2so4、10mmol/lkcl、2.0mmol/lmgcl2、0.1％tritonx-100、0.2mmol/ldntps、基因特異引物brcer1-sf和brcer1-sr各10ng、taq酶0.5u、模板dna100ng,使用的擴增儀為eastwin(etc811)。

其中，pcr擴增程序為94℃預變性1min后，94℃反應30s、55℃反應30s、72℃反應1min反應，總共30個循環(huán),最后在72℃延伸8min。

(6)擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳、eb染色后,應用凝膠圖像分析系統(tǒng)gds-7600(uvp)記錄。

(7)統(tǒng)計帶型，篩選aa基因型(無蠟粉)，將對應的植株適時移栽到大田里。得到的無蠟粉的不結球白菜菜薹表皮上無蠟粉，光亮，商品性好。

其中，圖1為步驟(3)中得到的共顯性標記(基因特異引物)在f2單株中的pcr擴增結果。從圖中可以看出，使用本發(fā)明的共顯性標記(基因特異引物)分別在兩個親本13s106和13s126、以及f2分離群體中表現(xiàn)出了pcr擴增產(chǎn)物大小差異，該結果與理論上得出的結論即13s126無蠟粉親本丟失39bp后產(chǎn)物小一致。同時，得到的pcr擴增結果穩(wěn)定。

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>華中農(nóng)業(yè)大學

<120>鑒別無蠟粉不結球白菜的引物、試劑盒及鑒別方法

<130>khp171113871.0

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctaccattcccaccaccac19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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