本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及krba1基因突變在制備乳腺癌檢測試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
:乳腺癌是一種全身性疾病、其發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此,基因突變在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。乳腺癌是一個多因素遺傳變異性疾病,只有不足10%是由于單基因缺陷引起的。隨著高通量基因技術(shù)的發(fā)展,越來越多與乳腺癌相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn),這些基因上潛在的遺傳變異(單核苷酸多態(tài)和拷貝數(shù)變異)可能引起乳腺癌藥物治療效果的差異。由于遺傳變異的存在使抗腫瘤藥物的代謝途徑以及藥物作用的目標(biāo)基因可能受到影響,進(jìn)而影響療效以及預(yù)后。突變位點(diǎn)的存在被認(rèn)為賦予個體不同表型性狀,以及對環(huán)境暴露、藥物治療等的不同反應(yīng),因此突變位點(diǎn)可能是導(dǎo)致個體疾病發(fā)生發(fā)展差異的重要遺傳基礎(chǔ)。將疾病易感的突變譜用于疾病的輔助診斷,具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來,利用突變位點(diǎn)對疾病進(jìn)行輔助診斷已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn),在腫瘤、先天性疾病和心腦血管疾病等常見重大疾病上的應(yīng)用價值已初見端倪。然而,目前還沒有將krba1基因的突變位點(diǎn)應(yīng)用于乳腺癌診斷和預(yù)后的報(bào)道,若能篩選出與乳腺癌診斷和預(yù)后相關(guān)的突變作為預(yù)測指標(biāo),并研制相應(yīng)的試劑盒,將對乳腺癌個體化治療產(chǎn)生重要指導(dǎo)意義,并為其藥物篩選及藥效評價開辟新的途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題,提供一種用于乳腺癌檢測的krba1基因的新突變位點(diǎn)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測乳腺癌的試劑盒。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明首先提供了一種用于乳腺癌檢測的krba1突變基因,所述krba1突變基因?yàn)閚m_001290187:exon8:c.875-3->t剪切位點(diǎn)突變。進(jìn)一步地,本發(fā)明提供了所述krba1突變基因在制備乳腺癌檢測試劑或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。優(yōu)選的,所述的檢測設(shè)備優(yōu)選包括含有檢測krba1:nm_001290187:exon8:c.875-3->t突變位點(diǎn)的基因芯片的檢測平臺。優(yōu)選的,所述的檢測試劑選自:引物、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多種。進(jìn)一步地,本發(fā)明還提供了一種檢測乳腺癌的試劑盒,所述試劑盒包括引物組和與該引物組配合使用的探針。優(yōu)選的,所述引物組序列為:正向引物:如seqidno.1所示;反向引物:如seqidno.2所示。優(yōu)選的,所述探針包括野生型探針和突變型探針,野生型探針如seqidno.3所示,突變型探針如seqidno.4所示;所述探針5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。優(yōu)選的,擴(kuò)增krba1:nm_001290187:exon8:c.875-3->t突變位點(diǎn)的特異性引物和探針是通過上海生工設(shè)計(jì)合成,所述引物和探針特異性強(qiáng),擴(kuò)增效果好。優(yōu)選的,所述報(bào)告熒光基團(tuán)為fam或vic,淬滅基團(tuán)為nfq。優(yōu)選的,所述試劑盒還包括含mg2+的pcr反應(yīng)緩沖液、dntp混合物、taq酶和ddh2o。優(yōu)選的,所述試劑盒還包括陰性對照組,所述陰性對照組為正常人的dna。進(jìn)一步地,本發(fā)明還提供了一種檢測乳腺癌krba1:nm_001290187:exon8:c.875-3->t突變的方法,包括以下步驟:1)分離受試者外周血的dna;2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行taqman-mgbpcr擴(kuò)增;3)對步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行krba1基因的等位基因鑒別分析,若用于標(biāo)記seqidno:3的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度呈s型增長,同時用于標(biāo)記seqidno:4的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度無增長,表示野生型基因型;反之,表示純合突變基因型;若兩種熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度同時呈s型增長,則表示雜合突變基因型;4)根據(jù)步驟3)的基因型分析結(jié)果進(jìn)行判斷,具有純合突變基因型或雜合突變基因型的受試者的krba1突變檢測結(jié)果為陽性。本發(fā)明有益效果:本發(fā)明利用krba1基因的突變位點(diǎn)開發(fā)評估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的檢測試劑盒,該試劑盒具有敏感性強(qiáng),準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn),且方法簡單、快速,對乳腺癌的早期篩查、預(yù)后評估具有重要的意義,也為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明的技術(shù)方案具體包括:系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料,采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本進(jìn)行dna提??;突變位點(diǎn)篩選:選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照,利用高通量測序,找出與乳腺癌相關(guān)的突變;突變位點(diǎn)的驗(yàn)證:sanger測序進(jìn)一步驗(yàn)證,鑒定致病基因;剪切位點(diǎn)改變預(yù)測:借助一系列剪切位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站對可能產(chǎn)生的剪切位點(diǎn)改變進(jìn)行了預(yù)測;乳腺癌檢測試劑盒的制備:利用上述突變位點(diǎn)開發(fā)乳腺癌檢測試劑盒。實(shí)施例1外周血dna的提取和純化1、樣品收集發(fā)明人于2015年1月至2016年12月在深圳市第二人民醫(yī)院收集了大量的新發(fā)乳腺癌患者血標(biāo)本,通過對樣品資料的整理,發(fā)明人從中選擇了35例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本,同時選擇10例年齡在25-55歲健康女性作對照進(jìn)行全外顯子芯片檢測,樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的乳腺癌病例,其中有3例病人具有癌癥家族史并分別標(biāo)記為x1、x2、x3;(2)采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史;(3)與病例年齡匹配的健康女性對照并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。2、dna的提取在上述符合條件的35例乳腺癌患者和10例健康女性對照中,兩組年齡均衡可比。具體步驟為:(1)向儲存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液,40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通x-100(amresco0694)20ml混合后,用trishcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。(2)去除紅細(xì)胞:用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘,棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。(3)抽提dna:向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2m氯化鈉,14.4ml0.5m乙二胺四乙酸,15ml10%十二烷基硫酸鈉,148.1ml雙蒸水,下同)和8μl蛋白酶k,振蕩器上充分振蕩混勻,37℃水浴過夜。(4)去除蛋白質(zhì):加1ml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1,v/v,下同),充分混勻后(手搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個1.5ml的離心管)。(5)dna沉淀:在上清液中加入3m的醋酸鈉60μl,再加入與上清液等體積的冰無水乙醇,上下輕搖,可見白色絮狀沉淀物,再以12000rpm離心10min。(6)dna洗滌:在沉淀中加入冰無水乙醇1ml,12000rpm離心10min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。(7)測量濃度:通常能得到20-50ng/μldna,純度(紫外2600d:2800d)在1.8-2.0。實(shí)施例2高通量二代測序挖掘患者的致病突變將實(shí)施例1中兩組人群經(jīng)全外顯子芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。1、文庫構(gòu)建北京諾禾致源科技股份有限公司采用agilent的液相芯片捕獲系統(tǒng),對人的全外顯子區(qū)域dna進(jìn)行高效富集,然后在illuminahiseq平臺上進(jìn)行高通量、高深度測序。建庫和捕獲實(shí)驗(yàn)采用agilentsureselecthumanallexonv5試劑盒,嚴(yán)格使用說明書推薦的試劑和耗材,并參照最新的經(jīng)過優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)基本流程:將基因組dna經(jīng)covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為180-280bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)和加a尾后在片段兩端分別連接上接頭制備dna文庫。帶有特異index的文庫pooling后與多達(dá)543,872個生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交,再使用帶鏈霉素的磁珠將20,965個基因的334,378個外顯子捕獲下來,經(jīng)pcr線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢,合格即可進(jìn)行上機(jī)測序。2、庫檢文庫構(gòu)建完成后,先使用qubit2.0進(jìn)行初步定量,稀釋文庫至1ng/μl,隨后使用agilent2100對文庫的insertsize進(jìn)行檢測,insertsize符合預(yù)期后,使用q-pcr方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2nm),以保證文庫質(zhì)量。3、上機(jī)測序庫檢合格,根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)行illuminahiseq平臺測序。4、數(shù)據(jù)分析與處理外顯子組測序后獲得原始數(shù)據(jù),經(jīng)過去污染等數(shù)據(jù)過濾、與人類參考基因組進(jìn)行比對分析,檢測個體攜帶的變異,包括snp(單核苷多態(tài)性)、indels(插入、缺失片段),并完成相應(yīng)的注釋和統(tǒng)計(jì)分析工作;保留位于編碼區(qū)可能影響蛋白功能以及位于側(cè)翼區(qū)可能影響轉(zhuǎn)錄本剪接的突變,包括無義突變、錯義突變、移碼突變、插入缺失以及剪切突變,將獲得的突變與公共數(shù)據(jù)庫dbsnp144、千人基因組計(jì)劃1000genome、hapmap、yanhuangproject進(jìn)行比對,濾除人群中的高頻突變,篩除已知的snp及indel位點(diǎn),篩選出新的致病性突變位點(diǎn)。最終確定“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的53個突變位點(diǎn)為優(yōu)選敏感級位點(diǎn);其中,krba1基因nm_001290187:exon8:c.875-3->t的剪切體突變,該位點(diǎn)經(jīng)過生物信息學(xué)分析,可以確認(rèn)為乳腺癌候選標(biāo)志物。實(shí)施例3sanger測序驗(yàn)證,鑒定致病基因1、在實(shí)施例1中35例乳腺癌患者和10例健康女性的樣本進(jìn)行sanger測序驗(yàn)證,提取血液dna樣本同實(shí)施例1;2、分別針對krba1基因的8號外顯子及其側(cè)翼設(shè)計(jì)引物,所用引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。所用pcr的反應(yīng)體系(25μl體系)為:taqbuffer2.5μl,dna1μl,正向引物0.5μl,反向引物0.5μl,10mmdntp0.5μl,taq酶0.2μl,ddh2o19.8μl。pcr反應(yīng)程序:95℃3min,35個循環(huán)(94℃30s,60℃30s,72℃1min),72℃10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,與紫外線切膠儀下切取pcr產(chǎn)物凝膠并純化。對所有的pcr產(chǎn)物分別以正、反向引物序列測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。其中檢測krba1:nm_001290187:exon8:c.875-3->t突變位點(diǎn)的正向引物序列為seqidno.5所示,反向引物序列為seqidno.6所示。3、結(jié)果分析通過chromas序列分析軟件,將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對,并結(jié)合“健康女性對照”組序列,尋找突變位點(diǎn)。結(jié)果顯示:患者krba1基因nm_001290187:exon8:c.875-3位點(diǎn)插入了堿基t,使得序列由ctt變成cttt與全外外顯子測序結(jié)果相符合。從而進(jìn)一步確認(rèn)所述突變位點(diǎn)可用于乳腺癌的檢測、治療、診斷、預(yù)后評估等輔助診斷。實(shí)施例4剪切位點(diǎn)改變預(yù)測針對實(shí)施例1中所檢測出的krba1基因nm_001290187:exon8:c.875-3->t位點(diǎn)突變可能引起的剪切異常進(jìn)行預(yù)測。1、實(shí)驗(yàn)方法:借助一系列剪切位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站對可能產(chǎn)生的剪切位點(diǎn)改變進(jìn)行了預(yù)測,包括:(1)netgene2server,網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/netgene2/;(2)humansplicingfinder,網(wǎng)址:http://www.umd.be/hsf3/hsf.html。2、剪切位點(diǎn)改變預(yù)測結(jié)果(1)netgene2server軟件預(yù)測結(jié)果提示該突變能夠引起正常剪切位點(diǎn)的消失,引起krba1基因所編碼的krba1蛋白結(jié)構(gòu)的改變;(2)humansplicingfinder軟件預(yù)測結(jié)果提示該突變能夠引起正常受體剪切位點(diǎn)的消失,并產(chǎn)生新的異常受體剪切位點(diǎn),從而引起krba1基因所編碼的krba1蛋白結(jié)構(gòu)的改變。實(shí)施例5乳腺癌檢測試劑盒組裝組裝本發(fā)明所述的用于乳腺癌檢測試劑盒,所述試劑盒包括包含引物及其對應(yīng)的taqman-mgb探針、taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液、ddh2o和陰性對照的正常人dna。根據(jù)krba1(genbank號:ng_029620.1)序列,通過primerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增krba1:nm_001290187:exon8:c.875-3->t突變位點(diǎn)的特異性引物和探針,并由上海生工設(shè)計(jì)合成,引物及探針序列見表1所示。表1引物和探針序列編號序列正向引物seqidno.1acactgagctccaggtgaaaaca反向引物seqidno.2cagggtctgctacactgtctga野生型探針seqidno.3vic-ttccttagtgaagac-nfq突變型探針seqidno.4fam-ttcctttagtgaagac-nfq每個pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μl,包含10×pcr反應(yīng)緩沖液2.0μl、25mmmgcl2溶液2.4μl、2.5mm的dntp混合液1.6μl、5u/μltaq酶0.1μl、dna模板1μl(50ng左右)、20μm上下游引物各0.5μl、10μm突變野生探針各0.5μl,ddh2o補(bǔ)至20μl。實(shí)施例6檢測試劑盒的使用1、取45例臨床確診為乳腺癌患者的血液樣本,提取dna方法同實(shí)施例1;2、熒光pcr檢測將配置好的20μlpcr體系放入熒光pcr儀器中,進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增檢測;pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃1min,進(jìn)行40個循環(huán)。熒光pcr儀器:羅氏lightcycler@480型實(shí)時熒光定量pcr儀。3、基因分型通過熒光定量pcr儀上顯示的fam和vic探針的ct值,確定所檢測的snp位點(diǎn)的基因型?;蛐团凶x:只在fam頻道中有擴(kuò)增信號產(chǎn)生的樣本為純合突變基因型;只在vic頻道中有擴(kuò)增信號產(chǎn)生的樣本為野生基因型;在fam和vic頻道中都有擴(kuò)增信號產(chǎn)生的樣本為雜合突變基因型;具有純合突變基因型和雜合突變基因型的受試者的krba1基因突變檢測結(jié)果均為陽性。在45例乳腺癌血液樣本中,本試劑盒共檢測到krba1突變?yōu)?5例,其中有16例為雜合突變基因型,有9例為純合突變基因型,突變率為55.6%。本試劑盒可為評估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)提供有效參考依據(jù)。雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京大學(xué)深圳醫(yī)院(北京大學(xué)深圳臨床醫(yī)學(xué)院)安徽醫(yī)科大學(xué)<120>krba1基因突變在制備乳腺癌檢測試劑盒中的應(yīng)用<130>p16rxa96<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1acactgagctccaggtgaaaaca23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cagggtctgctacactgtctga22<210>3<211>15<212>dna<213>人工序列<400>3ttccttagtgaagac15<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列<400>4ttcctttagtgaagac16<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tccatggcttccctctttgc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6atccggatcctcttcccgac20當(dāng)前第1頁12