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一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的制作方法

文檔序號:428992閱讀:286來源:國知局
專利名稱:一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明關(guān)于一群基因,特別關(guān)于一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。
背景技術(shù)
口腔鱗癌占全身惡性腫瘤的4%,由于口腔位于呼吸道與消化道的重要位置,病變結(jié)果嚴(yán)重影響患者的生活和生存質(zhì)量。目前研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的常用方法之一是檢測臨床標(biāo)本中的一些分子標(biāo)記物的表達(dá)情況,從而推測這些分子標(biāo)記物和腫瘤的相關(guān)性。方法二是以已經(jīng)建立的腫瘤細(xì)胞系為研究對象。通過檢測臨床標(biāo)本中的分子標(biāo)記物表達(dá)情況的方法可以在一定程度上闡述某些因子和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,但它受標(biāo)本的限制,不能動態(tài)地觀察細(xì)胞惡變過程,不能系統(tǒng)研究腫瘤的發(fā)生機制;目前已經(jīng)建立的腫瘤細(xì)胞系在一定程度上為腫瘤發(fā)生機制的研究提供了實驗平臺,但也不能在縱向研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制。上述技術(shù)一次性只能研究個別基因與腫瘤的相關(guān)性,而基因芯片技術(shù)可以滿足高通量檢測的要求,更加全面地研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制相關(guān)基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的通過基因芯片技術(shù)篩選口腔鱗癌體外癌變模型各細(xì)胞系間的差異表達(dá)基因,進一步驗證差異基因在細(xì)胞癌變過程中的表達(dá)情況,動態(tài)地研究口腔鱗癌癌變發(fā)生、發(fā)展進程中惡變相關(guān)基因表達(dá)情況,為進一步預(yù)防和治療鱗癌提供候選基因。
首先通過轉(zhuǎn)染HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮細(xì)胞系,采用化學(xué)致癌劑苯丙芘或復(fù)合促癌劑佛波酯誘導(dǎo)永生化細(xì)胞惡變;這樣在生物因素(人乳頭狀瘤病毒),化學(xué)致癌因素(苯丙芘),促癌因素(佛波酯)以及血清等方面體現(xiàn)了癌變過程中多因素作用的過程;細(xì)胞在從正常粘膜上皮細(xì)胞到永生化,然后逐步表現(xiàn)出惡性細(xì)胞特性,最終惡變的過程。這一過程很好地驗證了腫瘤多因素、多階段、多步驟發(fā)生學(xué)說。該模型在一定程度上反映了體內(nèi)口腔黏膜上皮細(xì)胞的癌變過程。(上述部分已經(jīng)申請專利見本申請人申請的中國發(fā)明專利“一種口腔粘膜上皮細(xì)胞癌變模型”其專利申請?zhí)?00510028310.5)進一步通過Affymetrix PLUS 2.0(USA)寡核苷酸芯片檢測永生化上皮細(xì)胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)細(xì)胞基因表達(dá)譜,采用GeneSpring 7.01軟件分析芯片結(jié)果,得到上述各細(xì)胞系間的差異表達(dá)基因譜。篩選差異倍數(shù)在2倍以上的基因,選取可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的候選基因。采用RT-PCR和實時定量PCR驗證差異表達(dá)基因。在口腔鱗狀細(xì)胞癌體外多因素、多階段、多步驟癌變模型的基礎(chǔ)上,篩選到與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。相關(guān)基因具有如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5、SEQID6、SEQID7、SEQID8、SEQID9、SEQID10、SEQID11所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所公開一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其優(yōu)點表現(xiàn)在
(1)首先我們建立的口腔黏膜上皮細(xì)胞體外癌變模型可以動態(tài)地反映腫瘤發(fā)生發(fā)展過程;(2)Affymetrix寡核苷酸基因芯片包含人類全基因組信息,具有高通量和高準(zhǔn)確性的優(yōu)點;(3)芯片檢測結(jié)果通過Genespring軟件分析以及綜合生物信息學(xué)分析可以篩選到與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)候選基因。


圖1顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖2顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖3顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖4顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖5顯示HIOEC-B(a)P細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力。
圖6顯示HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力。
圖7顯示顯微鏡放大200倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖8顯示顯微鏡放大400倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖9顯示顯微鏡放大200倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖10顯示顯微鏡放大400倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖11顯示顯微鏡放大200倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖12顯示顯微鏡放大400倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1I、在已經(jīng)建立的HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,采用化學(xué)致癌劑苯丙芘(benzo(a)pyrene,B(a)P)誘導(dǎo)培養(yǎng),B(a)P的濃度為0.1-1.2μg/ml,體外遞增濃度、間歇誘導(dǎo)培養(yǎng)6個月;誘導(dǎo)細(xì)胞第18代克隆培養(yǎng),第21代改用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);體外連續(xù)傳代培養(yǎng)1年,建立惡性細(xì)胞系HIOEC-B(a)P(見圖1)。
II、通過軟瓊脂集落形成和裸小鼠皮下成瘤性鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性表型。不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞接種裸小鼠皮下形成不同惡性程度的腫瘤。(見圖2,圖3)III、分別培養(yǎng)永生化上皮細(xì)胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)細(xì)胞,待細(xì)胞生長至80%鋪滿培養(yǎng)瓶(25cm2)底時,棄去培養(yǎng)液,每瓶細(xì)胞分別加入2ml TRIzol reagent(Invitrogen,USA),充分吹打后將液體吸入1.5ml離心管中,-80℃保存?zhèn)溆谩C糠N細(xì)胞分別收集4份,其中3份用于芯片檢測重復(fù)實驗3次,1份備做驗證芯片結(jié)果。
IV.總RNA的提取和純化1.樣品置冰上融化后,用加樣槍反復(fù)吸吹,使樣品充分裂解,移入1.5ml離心管中,室溫靜置3~5分鐘。
2.在離心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿,振蕩混勻。
3.將離心管在4℃,12000rcf,離心15分鐘。
4.用移液器小心吸出上層水相,加入另一離心管中,每ml TRIzol起始量加入500ul異丙醇。
5.-20℃,沉淀過夜。
6.4℃,12000rcf,離心10分鐘。
7.小心移出上清。
8.沉淀中加入1mL 75%乙醇,4℃,12000rcf,離心10分鐘。
9.重復(fù)用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀。
10.去上清,稍微晾干,RNA略顯透明,加入適當(dāng)體積(30ul)的RNase-free的水,充分溶解。
V.定量和檢測總RNAa)紫外定量和檢測1)用紫外分光光度計檢測RNA的產(chǎn)量,在260nm處的吸光度,1OD=40ug/ml。
2)根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值,檢測RNA的純度,純RNA的OD260/OD280比值應(yīng)接近2.0(比值最好在1.9~2.1之間)。
b)變性膠電泳質(zhì)檢1)配制1.2%的電泳膠10×MOPS Gel Buffer 10mlAgrose1.2g
RNase-Free Water90ml加熱溶解Agrose,稍微冷卻,加入37%甲醛 1.8mlEB(10mg/ml) 1ul搖勻后倒膠,待膠冷凝后,置于電泳槽中,浸于1×MOPS Gel Buffer中平衡10分鐘,待用。
2)樣品變性5×Loading Buffer2ulRNA樣品 1ugRnase-Free water 調(diào)節(jié)至10ul在65℃,變性5分鐘,立即置于冰上冷卻。
3)電泳將處理好的RNA樣品,稍微離心,70V恒壓電泳1小時。在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。
VI.純化總RNARNeasy Mini Kit1.將總RNA的體積用RNase-free的水調(diào)整到100ul,(因QIAGEN純化柱的最大上樣量為100ugRNA,所以一般取RNA不大于100ug)。
2.加入350ul RLT工作液(1ml RLT中加10ul 2-ME,混勻而成),充分混勻。
3.加入250ul無水乙醇,充分混勻(不要離心)。
4.將混好的700ul樣品加到QIAGEN純化柱中,>8000rpm,離心15秒。
5.棄濾液,加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份無水乙醇混勻而成),>8000rpm,離心15秒。
6.棄濾液,加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份無水乙醇混勻而成),>8000rpm,離心2分鐘。
7.將純化柱放入一個新的收集管,最大轉(zhuǎn)速,離心1分鐘。
8.將純化柱換入一個EP管中,在純化柱膜中間加25ul RNase-free的水,室溫放置1分鐘,最大轉(zhuǎn)速,離心1分鐘。
9.將EP管中的樣品移入一個新的EP管中。
VII.純化總RNA的定量和檢測(同V)a紫外定量和檢測總RNA的濃度和OD260/OD280。
b變性膠電泳質(zhì)檢VIII.cDNA的合成和純化1.1stcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a)總RNA5~16ug(8ug,不足取10ul)b)RNase-free water 補至10ulT7-(dT)24 Primer(50uM) 2ul混勻,70℃溫浴10分鐘,置于冰上至少2分鐘,離心片刻;c)5×1st Strand Buffer 4ulDTT(0.1M) 2uldNTP(10mM) 1ul混勻,42℃,溫浴2分鐘;d)SuperScript II RT(200U/ul)2uL(8~16ug起始)
1uL(5~8ug起始)e)混勻,42℃,溫浴1小時。
2.2ndcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a)將1st cDNA合成產(chǎn)物置于冰上,加入下列試劑Component VolumeRNase-Free water91ul5×2nd Strand Buffer30uldNTP(10mM) 3ulE.coli DNA Ligase(10U/ul) 1ulE.coli DNA Polymerase(10U/ul) 4ulE.coli RNase H(10U/ul) 1ulTotal Volume130ul混勻,16℃,反應(yīng)2小時;b)加入2ul T4 DNA Polymerase,混勻,16℃,5分鐘;c)加入10ul EDTA(0.5M),混勻,終止反應(yīng)。
-20℃保存或進行下步純化。
3.純化cDNA(Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module)a)將600ul cDNA Binding Buffer加入cDNA合成產(chǎn)物中,振蕩混勻3秒。
b)將500ul液體移入cDNA Cleanup Spin Column管中,不要振蕩,>=10000rpm,室溫離心1分鐘,棄濾液。
c)將剩余液體移入cDNA Cleanup Spin Column管中,不要振蕩,>=10000rpm,室溫離心1分鐘,棄濾液。
d)換一個新收集管,加入750ul cDNA Wash Buffer,最大轉(zhuǎn)速離心1Min,棄濾液。
e)打開蓋子,最大轉(zhuǎn)速離心5Min,棄濾液。
f)將柱子轉(zhuǎn)移至1.5mL的收集管中,加入14ul的cDNA Elution Buffer。室溫靜置1分鐘,最大轉(zhuǎn)速離心1分鐘。
IX.cRNA的合成和純化1.IVT合成cRNA(GeneChip IVT Labeling Kit)ReagentVolumeTemplate cDNA 12ulRNase-Free water 8ul10×IVT Labeling Buffer4ulIVT Labeling NTP Mix 12ulIVT Labeling Enzyme Mix4ulTotal Volume 40ul混勻,稍離心,37℃溫浴16小時。
合成產(chǎn)物可保存在-20℃或直接進行下一步純化。
2.純化cRNA(Genechip Sample Cleanup Module)1)加入60ul RNase Free水,振蕩混勻3’。
2)加入350ul IVT cRNA binding Buffer,振蕩混勻3’。
3)加入250ul無水乙醇,用加樣槍混勻。
4)將以上混合液加入cRNA Cleanup Spin Colum,>=10000rpm,離心15’,棄濾液。
5)將柱子移至1.5mL的收集管,加入500ul的IVT cRNA WashBuffer,>=10000rpm,離心15’,棄濾液。
6)加入500ul 80%乙醇,>=10000rpm,離心15’,棄濾液。
7)換一個收集管,打開蓋子,>=10000rpm,離心5min,棄濾液。
8)將柱子轉(zhuǎn)移至1.5mL的收集管,加入11ul的Rnase Free水,>=10000rpm 1min。
9)加入10ul的Rnase Free水,>=10000rpm 1min。
cRNA的定量和檢測a.用紫外分光光度計測量cRNA的濃度和OD260/OD280b.變性膠檢測cRNA取2ug cRNA在1.2%的變性膠上電泳,純化的cRNA應(yīng)該呈彌散狀長條帶。
X.cRNA片段化、配制雜交液1.片段化cRNAa.校正cRNA濃度根據(jù)公式 cRNA的測量濃度;VcRNA的洗脫體積;M合成cRNA時所用總RNA的量;RcRNA的回收得率;[校正cRNA]cRNA校正后的濃度。
b.配制片段化反應(yīng)體系根據(jù)校正cRNA的濃度片段化(40ul)cRNA15ug5×Fragmentation Buffer 6ulRNase-Free Water 補充至30ulc.片段化混勻,94℃溫浴35分鐘,之后置于冰上。
d.片段化cRNA的質(zhì)檢變性膠電泳質(zhì)檢,片段化cRNA約為35~200bp。
2.配制雜交液根據(jù)芯片類型按下表配制適當(dāng)量的雜交液見表1表1

XI.芯片雜交先進行測試芯片的雜交、洗染和分析,根據(jù)測試芯片的結(jié)果再雜交表達(dá)譜芯片。
1和2同時進行,直到第3步1.預(yù)雜交芯片1)取出芯片,平衡至室溫;2)加入1×雜交Buffer;3)45℃,60rpm,預(yù)雜交10分鐘。
2.雜交液的準(zhǔn)備1)雜交液混勻,離心片刻;2)99℃,溫浴5分鐘;
3)將雜交液轉(zhuǎn)至45℃,溫浴5分鐘;4)離心機最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。
3.雜交芯片1)吸出芯片中的1×雜交Buffer;2)將雜交液加入到芯片中;3)45℃,60rpm,雜交16小時;4)雜交結(jié)束后,吸出芯片中的雜交液,加入洗液A,進行后面的洗染過程。
XII.洗脫芯片在洗脫工作站上按照芯片類型,運行洗脫程序。
XII.掃描芯片掃描儀上掃描芯片。
XIV.數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表21.應(yīng)用Genespring 7.01軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2.Normalization方法將芯片所有探針組的Signal從小到大排序,去掉最大的2%和最小的2%后,將剩下探針組的平均信號值調(diào)整到500。
表2 一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因表達(dá)差異結(jié)果

H=HIOEC細(xì)胞A=HIOEC-B(a)P細(xì)胞96G(成瘤)B=HIOEC-B(a)P細(xì)胞56G(不成瘤)C=HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞75G(軟瓊脂克隆)D=HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞47G(軟瓊脂無克隆)
序列表<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院<120>一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因<130>/<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2737<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ctgaacctca gccgcgccgg gaggcgagcc cgttggcgag gggcggggca gatggcgagg 60gagcggggcg agctgctttt tgaggctgcg cactcgcatg gccccacctc gcaggtccac120ttccggcgcc gcggctgttc cgggcggaga ccgcttgtgc tggagtcgga gttgtaacgc180tccactgact gatagagcga ccggccgacc atggcgcccg gagtggcccg cgggccgacg240ccgtactgga ggttgcgcct cggtggcgcc gcgctgctcc tgctgctcat cccggtggcc300gccgcgcagg agcctcccgg agctgcttgt tctcagaaca caaacaaaac ctgtgaagag360tgcctgaaga acgtctcctg tctttggtgc aacactaaca aggcttgtct ggactaccca420gttacaagcg tcttgccacc ggcttccctt tgtaaattga gctctgcacg ctggggagtt480tgttgggtga actttgaggc gctgatcatc accatgtcgg tagtcggggg aaccctcctc540ctgggcattg ccatctgctg ctgctgctgc tgcaggagga agaggagccg gaagccggac600aggagtgagg agaaggccat gcgtgagcgg gaggagaggc ggatacggca ggaggaacgg660agagcagaga tgaagacaag acatgatgaa atcagaaaaa aatatggcct gtttaaagaa720gaaaacccgt atgctagatt tgaaaacaac taaagcgctc cagcacatca gtcccgacgc780ttcctgtgag gtgcacgctc cgcagcccag cccagccggg agaccacgtg gccattgcgg840tctcctgacc ttggccagtg aacctgccag ccttccagga caggcggccg gagagctgcc900cctgaaggac agtcctctcg tcttgcagac tggtgacctt ctattccctg ttcatctctg960tttctagatt tagtcacttg aaataagaaa tctttggggt ttgggctttt ttatactctt 1020
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權(quán)利要求
1.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID1所示的核苷酸序列。
2.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID2所示的核苷酸序列。
3.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID3所示的核苷酸序列。
4.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID4所示的核苷酸序列。
5.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID5所示的核苷酸序列。
6.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID6所示的核苷酸序列。
7.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID7所示的核苷酸序列。
8.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID8所示的核苷酸序列。
9.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID9所示的核苷酸序列。
10.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID10所示的核苷酸序列。
11.一群與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,其特征在于它具有如SEQ ID11所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于在口腔鱗狀細(xì)胞癌體外多因素、多階段、多步驟癌變模型的基礎(chǔ)上,篩選到與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。相關(guān)基因具有如SEQID1、SEQI D2、SEQID3、SEQID4、SEQID5、SEQID6、SEQID7、SEQID8、SEQID9、SEQID10、SEQID11所示的核苷酸序列。本發(fā)明驗證差異基因在細(xì)胞癌變過程中的表達(dá)情況,動態(tài)地研究口腔鱗癌癌變發(fā)生、發(fā)展進程中惡變相關(guān)基因表達(dá)情況,為進一步預(yù)防和治療鱗癌提供候選基因。
文檔編號C12Q1/68GK1800391SQ20051011165
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者潘紅芽, 張志愿, 李金忠, 周曉健, 曹俊, 帕提曼, 陳萬濤, 張萍 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
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