專利名稱：一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶的生產(chǎn)，更具體的，本發(fā)明涉及磷酸丙糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
東畢吸蟲病是由分體科東畢屬的各種吸蟲寄生于牛羊等哺乳動物的門靜脈和腸系膜靜脈而引起的一種血吸蟲病。慢性感染可引起家畜貧血，腹瀉，水腫，發(fā)育不良，影響受胎或發(fā)生流產(chǎn)，急性感染可引起牛羊等家畜死亡。該病在我國分布極其廣泛，給畜牧業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失。同時東畢吸蟲的尾蚴可使人患尾蚴性皮炎，也稱稻田皮炎，嚴(yán)重影響人類的身體健康，是一種非常重要的人畜共患寄生蟲病。
東畢吸蟲病的診斷分為臨床診斷和實驗室診斷，實驗室診斷又可分病原檢查和免疫學(xué)檢測。病原檢查包括糞便水洗沉淀法，沉淀集蟲法和毛蚴孵化法，以上方法的缺點(diǎn)是檢出率較低，而且，只要當(dāng)蟲體在體內(nèi)發(fā)育成熟時才能從糞便中檢出蟲卵，這時急性期已經(jīng)過了，而東畢吸蟲對牛羊的危害，大多是急性期蟲體在實質(zhì)器官移行時引起損傷造成的，這樣就延誤了有效治療時間而影響了對該病的控制。免疫檢測方法包括血凝試驗(Indirect Haemagglutination，IHA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，酶聯(lián)免疫印漬技術(shù)(ELIB)和斑點(diǎn)免疫金滲漏法(DIGFA)等，與病原檢查相比，免疫檢測方法具有檢出率高，特異性強(qiáng)，敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，但上述幾種免疫檢測方法也具有操作復(fù)雜，抗原獲得比較困難，這又給東畢吸蟲病的確診帶來一定困難，本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶，其表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)1200mg/l，從而為東畢吸蟲病免疫診斷方法提供了便利。
關(guān)于東畢吸蟲病的防治，目前主要采用化學(xué)藥物治療，吡喹酮是目前公認(rèn)的驅(qū)血吸蟲的良藥，但也存在治療費(fèi)用高，不能防止重復(fù)感染及耐藥性和藥物殘留等缺點(diǎn)，因此抗寄生蟲感染疫苗的研究逐漸受到人們的重視，1995年WHO推薦了曼氏血吸蟲6種候選抗原基因，磷酸丙糖異構(gòu)酶基因是其中的一種，受到血吸蟲疫苗研究者的關(guān)注。
磷酸丙糖異構(gòu)酶是一種糖酵解酶，催化磷酸二羥丙酮與3-磷酸甘油醛之間的可逆反應(yīng)，因此它在糖酵解，脂肪酸合成，糖原異生和戊糖途徑中發(fā)揮著重要的作用。磷酸丙糖異構(gòu)酶在血吸蟲的各個生長發(fā)育階段，在包括表皮在內(nèi)的各種組織中廣泛分布。
綜上所述，目前磷酸丙糖異構(gòu)酶已被視為非常有前景的抗寄生蟲病疫苗的候選抗原之一。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，目前仍然沒有一種高表達(dá)磷酸丙糖異構(gòu)酶的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)的生產(chǎn)方法，本發(fā)明采用畢赤酵母表達(dá)磷酸丙糖異構(gòu)酶，由于畢赤酵母自身分泌的蛋白很少，有利于純化，是一種低廉且產(chǎn)量高的表達(dá)TPI的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，包括以下步驟(1)將磷酸丙糖異構(gòu)酶的全長基因克隆入表達(dá)載體，將重組后的表達(dá)載體進(jìn)行增殖；(2)酶切增殖后的表達(dá)載體，使其線性化，然后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細(xì)胞中，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)；(3)收集表達(dá)產(chǎn)物。
更特別的，在步驟(2)中還包括在培養(yǎng)基中加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所述甲醇在培養(yǎng)基中的重量百分比濃度為0.1-3％。更特別的，所述的甲醇在培養(yǎng)基中的重量百分比濃度為0.2-1％。最佳的，所述甲醇在培養(yǎng)基中的重量百分比濃度為0.5％。
更特別的，所述的培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基。
更特別的，所述的表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)達(dá)載體pPIC9k，重組后形成pPIC9k-TPI重組質(zhì)粒。
更特別的，所述的畢赤酵母細(xì)胞為GS115。
更特別的，在步驟(3)后還包括用葡聚糖凝膠過濾層析柱分離純化TPI。更特別的，在步驟(2)中，畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為28-32℃。進(jìn)一步的，畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為30℃。
在本發(fā)明的第二方面，提供了畢赤酵母細(xì)胞的用途，用于作為表達(dá)系統(tǒng)，來生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶。
為了獲得高表達(dá)的磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)，本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)TPI蛋白，為抗東畢吸蟲感染疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1為土耳其斯坦東畢吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因大片段的電泳圖，其中1為TPI大片斷，M為DL2000Marker。
圖2為土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因5’端序列的電泳圖，其中1為TPI5’端序列，M為DL2000Marker。
圖3為土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因3’端序列的電泳圖，其中1為TPI3’端序列，M為DL2000Marker。
圖4為土耳其斯坦東畢吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因全長序列。
圖5為pPIC9k-TPI構(gòu)建示意圖。
圖6為細(xì)胞培養(yǎng)上清液SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白Marker，2、3、4、5、6為1、2、3、4、5天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1為空載體陰性對照。
圖7為純化后的土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶SDS-PAGE電泳圖，其中，1為純化后的TPI2為純化前TPI細(xì)胞培養(yǎng)上清液，M為蛋白Marker。
圖8為純化蛋白Western blot圖，其中1為陰性對照，M為蛋白Marker，2、3、4為純化蛋白。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本說明是如何實現(xiàn)的，以下說明不用于限制本發(fā)明的范圍。
由于目前磷酸丙糖異構(gòu)酶已被視為重要的抗寄生蟲病疫苗的候選抗原之一，因此，對于磷酸丙糖異構(gòu)酶的研究顯得特別有意義。本發(fā)明人在研究過程中，發(fā)現(xiàn)選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，可以顯著提高磷酸丙糖異構(gòu)酶的表達(dá)水平，并且更特別的，利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，可進(jìn)一步誘導(dǎo)磷酸丙糖異構(gòu)酶的高表達(dá)。
畢赤酵母可快速利用培養(yǎng)基中的碳源，穩(wěn)定復(fù)制基因組中的DNA，采用高密度連續(xù)培養(yǎng)，蛋白產(chǎn)量高，它除含有真核表達(dá)系統(tǒng)共有的翻譯后修飾功能等優(yōu)點(diǎn)外，同時皆有原核表達(dá)系統(tǒng)方便、簡單和廉價等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明中用畢赤酵母表達(dá)磷酸丙糖異構(gòu)酶，并利用葡聚糖凝膠過濾層析的方法分離純化TPI，這是一種低廉且產(chǎn)量高的表達(dá)TPI的方法，畢赤酵母同時具有原核表達(dá)系統(tǒng)快速、簡單、低廉和真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)加工折疊和翻譯后的修飾等優(yōu)點(diǎn)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是它自身分泌的蛋白很少，有利于純化，所得產(chǎn)物應(yīng)用于東畢吸蟲病的免疫診斷和免疫預(yù)防。
具體的，本發(fā)明的發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的1.磷酸丙糖異構(gòu)酶全長基因的克隆根據(jù)日本血吸蟲和曼氏血吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的保守區(qū)設(shè)計引物，用RT-PCR擴(kuò)增出土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的大片斷(電泳檢測結(jié)果見圖1)，再利用5’RACE和3’RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出土耳其斯坦東畢吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的5’端和3’端(電泳檢測結(jié)果見圖2和3)，將三部分序列拼接獲得土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的全長cDNA序列(已提交GenBank，登錄號為DQ092331)。
2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因全長cDNA序列設(shè)計含EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)的特異性引物，用RT-PCR從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA中擴(kuò)增出磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的全長序列(見圖4)。通過TA克隆將磷酸丙糖異構(gòu)酶全長序列連接到pMD18-T載體上，用EcoRI和NotI分別酶切重組載體pMD18-T/TPI和表達(dá)載體pPIC9k，純化后的酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒pPIC9k-TPI(見圖5)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中進(jìn)行增殖，PCR鑒定正確后，測序確認(rèn)。
3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選SalI酶切重組質(zhì)粒pPIC9k-TPI使其線性化，1.5kv，200Ω，25μF電擊轉(zhuǎn)化入酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)，3天后出現(xiàn)菌落，菌落為GS115/pPIC9k-TPI。所有菌落在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上連續(xù)培養(yǎng)三次后，將菌液滴加到1.0mg/mlG418的YPD平板篩選多拷貝質(zhì)粒菌株。
4.細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白誘導(dǎo)分泌表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基對篩選出的GS115細(xì)胞30℃培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)2-6時離心收集細(xì)胞，用含0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)基30℃誘導(dǎo)表達(dá)，每天添加甲醇至0.5％，然后收集上清。
5.表達(dá)產(chǎn)物的純化將收集的上清液濃縮至1/5后，于25mM Tris-HCL PH9.0緩沖液中透析，3小時換液一次，透析過液，0.22μm濾膜過濾。用葡聚糖G-75凝膠過濾層析柱純化透析蛋白，洗脫液為25mM Tris-HCL PH9.0，洗脫程序為2CV洗脫液洗脫，進(jìn)樣量2ml，5CV洗脫，流速0.5ml/min.280nmUV檢測，收集最高峰。
6.純化蛋白分子量、抗原性的鑒定將收集到的蛋白峰電泳分析。用12％的PAGE膠做凝膠檢測分子量的大小并做Western blot，封閉液中溫育1.5小時，加一抗作用2小時，洗滌三次后加二抗作用1小時。
7.結(jié)果成功克隆了土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶的全長基因，見圖4。
PCR證實重組載體pPIC9k/TPI，測序結(jié)果表明沒有移碼突變和堿基錯誤。
電擊轉(zhuǎn)化后，MD平板長出菌斑，1.0mg/mlG418的YPD平板篩選得到多拷貝質(zhì)粒菌株。
誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白電泳表明，分泌蛋白中含有43KD蛋白，見圖6。
凝膠過濾層析分離到一個高峰和若干個小峰。收集到的高峰為43KD蛋白見圖7。
Western blot顯示了高峰蛋白能與自然感染東畢吸蟲的羊血清特異性結(jié)合，見圖8。
由于TPI基因能整合到畢赤酵母基因組DNA中去的，所以能夠在高密度連續(xù)培養(yǎng)的情況下穩(wěn)定表達(dá)。酵母表達(dá)所使用的培養(yǎng)基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油等低廉原料組成，成本低。約5天為一個培養(yǎng)周期，每升培養(yǎng)基中可獲的約1200mg蛋白。凝膠過濾層析分離純化TPI蛋白操作簡單，易用推廣應(yīng)用。
本發(fā)明中畢赤酵母表達(dá)土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶，并用葡聚糖凝膠過濾層析柱分離純化TPI。這是一種低廉且高產(chǎn)的表達(dá)TPI的方法，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。且畢赤酵母可快速利用培養(yǎng)基中的碳源，穩(wěn)定復(fù)制基因組中的DNA，采用高密度連續(xù)培養(yǎng)，蛋白產(chǎn)量高，它除含有真核表達(dá)系統(tǒng)共有的翻譯后修飾功能等優(yōu)點(diǎn)外，同時也具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
實施例1磷酸丙糖異構(gòu)酶全長基因的克隆1.1TPI基因大片斷的擴(kuò)增根據(jù)已報道的日本血吸蟲菲利浦株磷酸丙糖異構(gòu)酶基因cDNA序列GenBankU50847和曼氏血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因cDNA序列GenBank M83294的保守區(qū)應(yīng)用Dnaman設(shè)計一對引物P15’-TGTCTGGATCTCGGAAA-3’(SEQ ID NO1)P25’-GCTCCACCATAGATAATACG-3’(SEQ ID NO2)利用oligo(dT)18從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA中反轉(zhuǎn)錄出TPI基因cDNA序列。再利用P1和P2擴(kuò)增出TPI基因大片斷。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃2min，94℃45s，53℃1min，72℃1min，35cycles，72℃10min。
1.2TPI基因的5’端序列的擴(kuò)增根據(jù)TPI中間大片段設(shè)計三條引物，分別為TPI5P15’-CATAGGCTACAACAATAC-3’(SEQ ID NO3)TPI5P25’-CAGATTCACGCTCTGATAATGTTTCAC-3’(SEQ ID NO4)TPI5P35’-CAAGCGATCACACTTAGACCTTCATC-3’(SEQ ID NO5)利用TPI5P1從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA中反轉(zhuǎn)錄出TPI基因5’端cDNA序列，TPI基因5’端cDNA序列經(jīng)純化、TdT加尾之后，利用Abridged Anchor Primer和TPI5P2進(jìn)行第一輪PCR，PCR參數(shù)為94℃2min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35cycles，72℃10min.再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板利用Abridged UniversalAmplificatian Primer(AUAP)和TPI5P3進(jìn)行第二輪PCR，PCR參數(shù)同第一輪PCR參數(shù)。將第二輪PCR產(chǎn)物通過TA克隆到pMD18-TVector上，PCR鑒定正確后測序。
1.3TPI基因的3’端序列的擴(kuò)增根據(jù)TPI中間大片段設(shè)計兩條引物，分別為TPI3P15’-GATCGCTCCACCTTTCGTATTCCTAC-3’(SEQID NO6)TPI3P25’-GAACCTGTATGGGCTATTGGTCTG-3’(SEQ ID NO7)
利用Adapter Primer從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA中反轉(zhuǎn)錄出TPI基因cDNA序列。利用TPI3P1和Abridged Universal Amplificatian Primer(AUAP)進(jìn)行第一輪PCR，PCR參數(shù)為94℃2min，94℃45s，61℃30s，72℃1min，35cycles，72℃.10min.再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板用TPI3P2和AmplificatianPrimer(AUAP)進(jìn)行第二輪PCR，PCR參數(shù)同第一輪PCR反應(yīng)參數(shù)。將第二輪PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector，PCR鑒定正確后測序。
1.4TPI基因全長序列的拼接TPI基因的三個片段測序后進(jìn)行序列拼接獲得的全長cDNA序列1130bp，將序列提交GenBank，登錄號為DQ092331。
結(jié)果，成功克隆了土耳其斯坦東畢吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的大片段和5’端及3’端，電泳檢測結(jié)果見附圖1、2、3，并將三個片斷拼接成TPI基因全長序列，見附圖4(SEQ ID NO10)。
實施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.1TPI基因全長序列的擴(kuò)增根據(jù)已登錄的TPI全長cDNA序列，設(shè)計一對含EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)的特異性引物，P15’-GCAGAATTCGAGAAAATGTCTGGATC-3’(SEQ ID NO8)P15’-GGTGCGGCCGCGTTCGAACTAATAAGGATG-3’(SEQ ID NO9)利用oligo(dT)18從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA中反轉(zhuǎn)錄出TPI基因cDNA序列。再通過P1和P2擴(kuò)增出TPI全長序列，PCR參數(shù)為94℃2min，94℃45s，52℃30s，72℃30s，5個循環(huán)，72℃.10min.將PCR產(chǎn)物利用通過TA克隆連接到pMD18-T Vector上，PCR鑒定正確后測序。
2.2pPIC9k-TPI的構(gòu)建用EcoRI和NotI分別酶切重組載體pMD18-T/TPI和表達(dá)載體pPIC9k(上海農(nóng)科院生物技術(shù)中心提供)，37℃水浴過夜后終止反應(yīng)，用DNA膠回收試劑盒(購自TaKaRa公司)回收TPI相應(yīng)條帶和pPIC9k，T4連接酶16℃連接過夜。
2.3重組質(zhì)粒的鑒定將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌TG1中，挑取氨芐抗性克隆(100mg/ml)，接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確后測序。
結(jié)果，測序證明并未發(fā)生堿基錯誤、移碼突變。
實施例3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選3.1重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒經(jīng)SalI酶切(37℃5h)使之線性化，1.5kv，200Ω，25μF電擊轉(zhuǎn)化入制備好的感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115(上海農(nóng)科院生物技術(shù)中心提供)中。
3.2多拷貝重組質(zhì)粒的篩選電擊轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，30℃培養(yǎng)，3天后出現(xiàn)菌落。長出的各個菌落連續(xù)通過3塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)一周使菌液具有相同的細(xì)胞密度，將菌液分別滴加于含1mg/mlG418的YPD平板上，30℃培養(yǎng)，待菌落生長。
結(jié)果，獲得多拷貝質(zhì)粒菌株。
實施例4細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白誘導(dǎo)分泌將獲得的含多拷貝pPIC9k-TPI質(zhì)粒的GS115菌用以甘油為碳源的BMGY培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600值為2-6時，4000rpm離心10min收集細(xì)胞沉淀，改用含0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)基30℃誘導(dǎo)表達(dá)，每24h添加0.5％的甲醇，3天后收集上清。
誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白電泳表明，分泌蛋白中含有一個43KD的蛋白，見圖6。
實施例5分離純化將細(xì)胞上清濃縮至1/5后于25mM Tris-HCL PH9.0的緩沖液中透析。每3h換液一次，透析過夜。再通過0.22μm濾膜過濾。用葡聚糖G-75凝膠過濾層析柱純化透析蛋白，洗脫液為25mM Tris-HCL PH9.0，洗脫程序為2CV洗脫液平衡，進(jìn)樣量2ml，5CV洗脫，流速0.5ml/min.280nmUV檢測，收集最高峰。
葡聚糖G-75凝膠層析柱純化得到43KD的目的蛋白，見圖7。
實施例6表達(dá)產(chǎn)物的生物特性鑒定
6.1分子量測定將收集的上清及收集到的蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳.分離膠和積層膠的濃度分別為12％和5％，加樣20μL，電壓條件分別為130V和80V，以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對照?？捡R斯亮蘭染色3h，脫色液脫色數(shù)次拍照。
6.2抗原性檢測將收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，100V1h轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，10mmol/lTris-cl(PH8.0)，150mmol/l Nacl，0.05％(v/v)Tween-20，3％BSA，0.05％疊氮鈉的封閉液中溫育1.5小時，與1∶100自然感染東畢吸蟲羊血清(由王春仁老師提供)反應(yīng)2h，PBST洗脫三次，每次10min，再與兔抗羊IgG-HRP(購自華美生物工程公司)1∶2000室溫作用1小時。PBST洗滌三次后，置于底物溶液中顯色。
Western blot顯示43KD的蛋白能與自然感染東畢吸蟲羊血清結(jié)合，證明43KD蛋白的確是磷酸丙糖異構(gòu)酶，結(jié)果見圖8。
本發(fā)明磷酸丙糖異構(gòu)酶在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)1200mg/l，并且畢赤酵母自身分泌的蛋白含量很少，這就大大簡化了純化過程，給實踐應(yīng)用帶來很大便利。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所<120>一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17<212>DNA<213>引物<400>1tgtctggatc tcggaaa 17<210>2<211>20<212>DNA<213>引物<400>2gctccaccat agataatacg20<210>3<211>18<212>DNA<213>引物<400>3cataggctac aacaatac 18<210>4<211>27<212>DNA<213>引物<400>4cagattcacg ctctgataat gtttcac 27<210>5<211>26<212>DNA
<213>引物<400>5caagcgatca cacttagacc ttcatc 26<210>6<211>26<212>DNA<213>引物<400>6gatcgctcca cctttcgtat tcctac 26<210>7<211>24<212>DNA<213>引物<400>7gaacctgtat gggctattgg tctg24<210>8<211>26<212>DNA<213>引物<400>8gcagaattcg agaaaatgtc tggatc 26<210>9<211>30<212>DNA<213>引物<400>9ggtgcggccg cgttcgaact aataaggatg 30<210>10<211>1130<212>DNA<213>人工序列
<400>10ttttctctat tactgattac atcgatttca tacgttgaga aaatgtctgg atctcgcaaa 60ttttttgttg gaggaaactg gaaaatgaat ggaagtcaag aagaaaacaa aaagttgcta 120catatactct ctgatgctca ttttggtgac aacacagagg ttttgatcgc tccacctttc 180gtattcctac aagaagttcg acgaactttg aagaaagaaa tacatgtggc tgctcaaaat 240tgctataaag ttccaaaggg tgcatttact ggagaaatta gtcccgcaat gataaaagat 300atcggttgtg attgggttat acttgggcat tcagagagga ggagcatttt tggtgaatct 360gatgaactta ttgctgataa agttgaacat gcaattgatg gaggtctaaa tgtgatcgct 420tgtattggtg aaacattatc agagcgtgaa tctggtaaaa cagaagaagt atgcgtaaga 480caattaaaag ctatcgcaaa taaaattaaa tcagctgatc aatggaaacg aattgttata 540gcttatgaac ctgtatgggc tatcggcact ggtaaagtgg ctacaccaca acaagctcaa 600gatgttcatc attttcttcg tcaatggttt aaaactaata caccaagtgg tgttgatgaa 660aaaatacgta ttatctatgg tggatcagtg actgccgcca attgtaaaga attagcacat 720caacctgatg ttgatggatt tctagttggt ggtgcatcat tgaaaccgga atttactgat 780atatgtaaag ctaagtaatg ttgttgaaca ttgttgaaca tgttctataa aaaatttttc 840ttcttgttcc ccctcccctc ctcttcaatt ttatctcttc tcctttttat gtcctttttt 900gtttgctttg ttattgttat tattattagt aatatctcaa tgtttactgt ataaaaaaaa 960caagacatcc ttattagttc gaacccccgt tcaatcatta tcaatgaaga aataataata1020atatatgtta atttagttca ttatttcagt tattatcctt taaaatttaa atttgttatg1080ttctaaatat acaatgaaat aattttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1130
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將磷酸丙糖異構(gòu)酶的全長基因克隆入表達(dá)載體，將重組后的表達(dá)載體進(jìn)行增殖；(2)酶切增殖后的表達(dá)載體，使其線性化，然后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細(xì)胞中，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)；(3)收集表達(dá)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，在步驟(2)中還包括在培養(yǎng)基中加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所述甲醇在培養(yǎng)基中的重量百分比濃度為0.1-3％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k，重組后形成pPIC9k-TPI重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母細(xì)胞為GS115。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，在步驟(3)后還包括用葡聚糖凝膠過濾層析柱分離純化磷酸丙糖異構(gòu)酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，在步驟(2)中，畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為28-32℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，在步驟(2)中，畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為30℃。
9.畢赤酵母細(xì)胞的用途，其特征在于，用于作為表達(dá)系統(tǒng)，來生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法，包括以下步驟(1)將磷酸丙糖異構(gòu)酶的全長基因克隆入表達(dá)載體，將重組后的表達(dá)載體進(jìn)行增殖；(2)酶切增殖后的表達(dá)載體，使其線性化，然后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細(xì)胞中，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)；(3)收集表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了畢赤酵母細(xì)胞的用途，用于作為表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)磷酸丙糖異構(gòu)酶。本發(fā)明的方法是一種低廉且產(chǎn)量高的表達(dá)磷酸丙糖異構(gòu)酶的方法。本發(fā)明中磷酸丙糖異構(gòu)酶在畢赤酵母中的表達(dá)量可達(dá)1200mg/l，較原核表達(dá)系統(tǒng)高出數(shù)倍且易于純化，便于投入實踐應(yīng)用中。
文檔編號C12N15/61GK1978637SQ20051011121
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者何國聲, 魏佳, 徐梅倩, 朱順海, 曹杰, 趙其平, 張大兵, 梁婉琪, 黃燕, 嚴(yán)鳳, 高興春, 郭敏, 黃俠, 姚寶安 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所