專利名稱：蘿芙木1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
本發(fā)明的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明在提高蘿芙木萜類吲哚生物堿含量上具有明顯的作用。提高生物堿的產(chǎn)量，以滿足全世界對利血平等藥物的巨大需求。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。

具體實施例方式 下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的克隆 1.組織分離(Isolation) 蘿芙木(品種為“云南蘿芙木”)從重慶南山采集，將種子播種于溫室中，待蘿芙木苗長至10cm高時，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation) 取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA) 根據(jù)各種植物的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行 (1)核心片斷的克隆 PCR[BP001(5’-ACYGGYTCHATWGGVACWCAGAC-3’)+BP002(5’-TTCTCRTTDGCDGCRCTNAGRACTCC-3’)]得到2002BP(947bp)的核心片斷，回收后連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知長春花的DXR基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的片段。
(2)3’-RACE PCR[AP+BP003(5’-CAGATAACATCAAGTACCCATCC-3’)]得到2002BP 3’端序列(490bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與長春花的DXR基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因。
(3).5’-RACE 第一輪PCR[AAP+BP004(5’-CATTTCTGACAGCAACTAACTGAGG-3’)] 第二輪PCR[(AUAP+BP005(5’-CCAGCTGCAAGTGCAACAACTCTAAA-3’)]得到2002BP 5’端序列(506bp)，(過程同(1))。
將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DXR編碼區(qū)(BP006F 1(ATGGCTTTGAATTTGCTGTC-3’)+BP007R1(5’-TCATACAAGGGCAGGGCTCA-3’))得到DXR的編碼區(qū)(1425bp)。
BLAST的結(jié)果證明從蘿芙木中新得到的基因確為一個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因。由于已知的同源1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因具有將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸(MEP)的功能，故推測此基因具有相同的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的全長編碼序列。在拼接得到全長(包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物BP008F15’-AATCTCAATTCTTTCGGAGA-3’為正向引物，BP009R15’-GATGATCAATATAGATGCTCATA-3’為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，F(xiàn)1/R2的PCR條件為94℃預(yù)變性2min；然后94變性45s、50退火45s、72延伸2min；30個循環(huán)；最后72延伸8min；電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片斷長度為1733bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，測序，獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
實施例2 蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因序列信息與同源性分析 本發(fā)明新的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因序列全長cDNA的長度為1796bp(包括171bp 5端非編碼區(qū)、1425bp編碼區(qū)和包括200bp的3端非編碼區(qū))，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于172-1596位核苷酸(1425個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶氨基酸序列，共475個氨基酸殘基，分子量為51.46kDa，等電點(pI)為5.88。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1。
將蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與長春花1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因序列在核苷酸水平上具有92％的相同性；在氨基酸水平上，它與長春花DXR在蛋白水平上具有93％的相同性(附表3)。由此可見，蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因與長春花1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶在MEP途徑上也具有相似的作用。
實施例3 蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白或多肽在蘿芙木中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的TIAs含量檢測 含目的基因的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因編碼序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因cDNA克隆至中間載體(如pGEM T-ease)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如改進(jìn)的pCAMBIA1304)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化蘿芙木。
1.發(fā)苗采取蘿芙木成熟的種子，用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分鐘，用無菌水沖洗6次；將蘿芙木種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)蘿芙木的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25℃，12小時光照，光照強(qiáng)度為25μmol.m-2.s-1。等到植株片長到3cm高時時可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
2.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將蘿芙木無菌苗的幼嫩葉片用小刀片削成約1cm2放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
3.除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。4周繼代一次。待除菌培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)基因毛狀根初步篩選。
除菌培養(yǎng)基MS+cb(頭孢菌素)(250mg/l) 篩選培養(yǎng)基MS+hygr(潮霉素)(30mg/l) 4.毛狀根的離體培養(yǎng)當(dāng)毛狀根長至大約4cm長時切下，在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上于25±1.0℃無光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。每三周繼代一次，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后可進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以進(jìn)一步進(jìn)行分子檢測。
5.轉(zhuǎn)基因蘿芙木的分子檢測 毛狀根DNA的提取和純化均參照分子克隆實驗指南(Sambrook，J.et al 1993)根據(jù)Furner等的Ri質(zhì)?；蛐蛄蟹治鲈O(shè)計rolB、rolC基因的特異性引物。rolB基因的一對引物為5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’。rolC基因的一對引物為5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。rolB、rolC基因的片段大小分別423bp和626bp。
由于蘿芙木中含有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因，所以在對轉(zhuǎn)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的毛狀根克隆時不能檢測直接DXR基因，而檢測植物表達(dá)載體上的潮霉素(hygr)抗性基因，潮霉素抗性基因(812bp)的檢測使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’，退火溫度，58℃)。
PCR結(jié)果表明所獲得的根為毛狀根，對潮霉素抗性基因的檢測表明蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因已經(jīng)成功整合到蘿芙木基因組。
6.1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因在蘿芙木毛狀根中的northern blot分析 1).RNA的提取利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)提取蘿芙木轉(zhuǎn)基因毛狀根各個單克隆的RNA。
2).RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1OD260＝40μg/ml。
3).總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4).RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5).膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTM Contents CDP-StarTM labelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。
Northern blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的毛狀根中1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄水平比空白毛狀根的明顯偏高。
7.轉(zhuǎn)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的毛狀根中利血平的HPLC分析 生物堿的提取取蘿芙木的毛狀根，在烘箱里50度恒溫干燥5-6個小時至恒重，取1.0g發(fā)根研磨成細(xì)粉，水潤濕，用超聲波在20ml甲醇中抽提3次，每次15min，提取液濃縮后用5％冰乙酸提取，提取液用石油醚洗滌，而后用氯仿提取，將氯仿提取液濃縮蒸干，得到粗制的生物堿。用流動相溶解，定容至1mL，用0.122μm微孔濾膜過濾后，可用于HPLC分析。
高壓液相檢測標(biāo)準(zhǔn)品的制備精密量取利血平標(biāo)準(zhǔn)品1mg，用流動相溶解成1mg/ml母液。從母液配成50，40，30，20，10mg/ml的濃度梯度，HPLC分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 高壓液相檢測條件色譜柱為C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相0.5％(v/v)三乙胺-水∶乙腈(50∶50)，流速1.0mL.min-1，柱溫室溫。檢測波長268nm。利血平大約在22min處出峰。
HPLC結(jié)果表明轉(zhuǎn)蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的毛狀根中利血平的含量比空白毛狀根的明顯偏高。
序列表
<110>西南大學(xué)
<120>蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因序列
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1796
<212>DNA
<213>蘿芙木(Rauvolfia verticillata)
AATCTCAATT CTTTCGGAGA AAGAGTTTTC TAACGTAAGA ATTTGCTTTT GCGAAGTGTA 60
AGGGCCAAAG GGTTCGTTTG TTTTGTTTTC AATCTTGCAA AAAGAGGGAA TCTTGCAAGC 120
TTCATTTGAA GCGGGTTACT CTGTGTGTGT TTTCTGAGCG GTGGAAGTGA T ATG GCT 177
Met Ala
1
TTG AAT TTG CTG TCC CCG ACT GAA ATC AAG ACT ATT TCG TTC TTG GAT 225
Leu Asn Leu Leu Ser Pro Thr Glu Ile Lys Thr Ile Ser Phe Leu Asp
5 10 15
TCC TCC AAG TCG AAT TAT AAT CTT AAT CTT CTC AAG CTT CAA GGA GGA 273
Ser Ser Lys Ser Asn Tyr Asn Leu Asn Leu Leu Lys Leu Gln Gly Gly
20 25 30
TTT GCT TTC AAG AAG AAA GAT TGT GGA GCA ACT GTT GGA AAG AAA ATT 321
Phe Ala Phe Lys Lys Lys Asp Cys Gly Ala Thr Val Gly Lys Lys Ile
35 40 45 50
CAA TGT TCA GTA CAG CCA CCT CCA CCA GCA TGG CCA GGG AGG GCT GTG 369
Gln Cys Ser Val Gln Pro Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Arg Ala Val
55 60 65
GCA GAA CCA GGT TAT AAG ACT TGG GAA GGT CAA AAG CCC ATT TCA ATA 417
Ala Glu Pro Gly Tyr Lys Thr Trp Glu Gly Gln Lys Pro Ile Ser Ile
70 75 80
GTT GGA TCT ACA GGC TCC ATT GGA ACT CAG ACA CTG GAC ATA GTT GCT 465
Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile Val Ala
85 90 95
GAA AAT CCA GAC AAA TTT AGA GTT GTT GCA CTT GCA GCT GGT TCA AAC 513
Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Ala Gly Ser Asn
100 105 110
GTG ACT CTT CTT GCT GAT CAG GTT AAA ACA TTC AAA CCT CAG TTA GTT 561
Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Lys Thr Phe Lys Pro Gln Leu Val
115 120 125 130
GCT GTC AGA AAT GAA TCG TTG GTT GAT GAA CTC AAA GAG GCT TTA TCT 609
Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Val Asp Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser
135 140 145
GAT GTT GAA GAC AAA CCT GAG ATC ATT CCT GGA GAA CAA GGT GTT GTT 657
Asp Val Glu Asp Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly Glu Gln Gly Val Val
150 155 160
GAG GTT GCC CGC CAT CCA GAT GCT GTC ACT GTT GTT ACT GGA ATA GTT 705
Glu Val Ala Arg His Pro Asp Ala Val Thr Val Val Thr Gly Ile Val
165 170 175
GGC TGT GCA GGT CTT AAG CCT ACA GTT GCT GCC ATA GAA GCC GGA AAA 753
Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala Gly Lys
180 185 190
AAC ATT GTT TTG GCC AAT AAA GAG ACA CTA ATT GCT GGT GGT CCC TTT 801
Asn Ile Val Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Gly Gly Pro Phe
195 200 205 210
GTA CTT CCT CTT GCA CAC AAG CAT AAA GTG AAG ATT CTT CCT GCT GAT 849
Val Leu Pro Leu Ala His Lys His Lys Val Lys Ile Leu Pro Ala Asp
215 220 225
TCA GAA CAT TCT GCT ATA TTC CAG TGT ATC CAA GGC TTG CCA GAG GGT 897
Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln Gly Leu Pro Glu Gly
230 235 240
GCT CTA AGG CGC GTA ATT TTA ACA GCT TCT GGA GGT GCT TTC AGG GAT 945
Ala Leu Arg Arg Val Ile Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Phe Arg Asp
245 250 255
TGG CCA GTT GAG AAA TTG AAG GAA GTT AAA GTA GCG GAT GCT TTG AAG 993
Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val Ala Asp Ala Leu Lys
260 265 270
CAT CCC AAC TGG AAT ATG GGA AAG AAG ATT ACT GTG GAT TCT GCT ACT 1041
His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser Ala Thr
275 280 285 290
CTC TTC AAT AAG GGT CTA GAA GTT ATT GAG GCC CAC TAC CTT TTT GGC 1089
Leu Phe Asn LVs Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu Phe Gly
295 300 305
GCT GAA TAT GAC AAC ATT GAC ATA GTC ATT CAT CCC CAA TCT ATC ATA 1137
Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Asp Ile Val Ile His Pro Gln Ser Ile Ile
310 315 320
CAC TCA ATG GTT GAA ACA CAG GAT TCA TCT GTC TTG GCA CAA TTG GGG 1185
His Ser Met Val Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly
325 330 335
TGG CCT GAT ATG CGT TTG CCT ATT CTT TAT ACT CCA TCC TGG CCT GAC 1233
Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Pro Ser Trp Pro Asp
340 345 350
AGA ATT TAC TGT TCT GAG ATA ACT TGG CCC CGC CTT GAT CTT TGC AAG 1281
Arg Ile Tyr Cys Ser Glu Ile Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu Cys Lys
355 360 365 370
CTT GGG TCT CTG ACA TTT AAA GCC CCA GAT AAC ATC AAG TAC CCA TCC 1329
Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Ala Pro Asp Asn Ile Lys Tyr Pro Ser
375 380 385
ATG GAA TTG GCA TAT GCT GCT GGT CGA GCA GGA GGG ACG ATG ACC GGA 1377
Met Glu Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met Thr Gly
390 395 400
GTT CTT AGT GCA GCA AAT GAG AAG GCA GTT GAG TTG TTT ATC AAT GAA 1425
Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Leu Phe Ile Asn Glu
405 410 415
AAA ATT AGC TAT TTG GAC ATT TTC AAG GTG GTT GAG CTG ACA TGC GAG 1473
Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu Leu Thr Cys Glu
420 425 430
AAG CAT CAA GCA GAA CTG GTA ACC TCA CCA TCC CTC GAG GAA ATT ATA 1521
Lys His Gln Ala Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser Leu Glu Glu Ile Ile
435 440 445 450
CAT TAC GAC TTG TGG TCT AGG GAC TAT GCT GCC GGT GTG CAA GGC ACT 1569
His Tyr Asp Leu Trp Ser Arg Asp Tyr Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr
455 460 465
CTC GGT TTG AGC CCT GCC CTT GTA TGA CGATGAACAA TATCATCCAT 1616
Leu Gly Leu Ser Pro Ala Leu Val ***
470 474
CGGTCTTCTT TGTACTGTCA CATCTTTGCC TAAATTTGAG CAGATGGGTG ATGGGGCTGC 1676
AATGCAATTG TATCACATTC AAGAGAATGA AATATATGAG CATCTATATT GATCATCAAA 1736
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGAAAA AAAAAAAAAA 1796
<210>2
<211>474
<212>PRT
<213>蘿芙木(Rauvolfia verticillata)
<400>2
Met Ala Leu Asn Leu Leu Ser Pro Thr Glu Ile Lys Thr Ile Ser Phe
1 5 10 15
Leu Asp Ser Ser Lys Ser Asn Tyr Asn Leu Asn Leu Leu Lys Leu Gln
20 25 30
Gly Gly Phe Ala Phe Lys Lys Lys Asp Cys Gly Ala Thr Val Gly Lys
35 40 45
Lys Ile Gln Cys Ser Val Gln Pro Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Arg
50 55 60
Ala Val Ala Glu Pro Gly Tyr Lys Thr Trp Glu Gly Gln Lys Pro Ile
65 70 75 80
Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile
85 90 95
Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Ala Gly
100 105 110
Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Lys Thr Phe Lys Pro Gln
115 120 125
Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Val Asp Glu Leu Lys Glu Ala
130 135 140
Leu Ser Asp Val Glu Asp Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly Glu Gln Gly
145 150 155 160
Val Val Glu Val Ala Arg His Pro Asp Ala Val Thr Val Val Thr Gly
165 170 175
Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala
180 185 190
Gly Lys Asn Ile Val Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Gly Gly
195 200 205
Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala His Lys His Lys Val Lys Ile Leu Pro
210 215 220
Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln Gly Leu Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ala Leu Arg Arg Val Ile Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Phe
245 250 255
Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val Ala Asp Ala
260 265 270
Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser
275 280 285
Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu
290 295 300
Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Asp Ile Val Ile His Pro Gln Ser
305 310 315 320
Ile Ile His Ser Met Val Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln
325 330 335
Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Pro Ser Trp
340 345 350
Pro Asp Arg Ile Tyr Cys Ser Glu Ile Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu
355 360 365
Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Ala Pro Asp Asn Ile Lys Tyr
370 375 380
Pro Ser Met Glu Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met
385 390 395 400
Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Leu Phe Ile
405 410 415
Asn Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu Leu Thr
420 425 430
Cys Glu Lys His Gln Ala Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser Leu Glu Glu
435 440 445
Ile Ile His Tyr Asp Leu Trp Ser Arg Asp Tyr Ala Ala Gly Val Gln
450 455 460
Gly Thr Leu Gly Leu Ser Pro Ala Leu Val ***
465 470 47權(quán)利要求
1.一種蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明對提高利血平等萜類吲哚生物堿含量具有明顯的作用，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/61GK101182528SQ20061005459
公開日2008年5月21日 申請日期2006年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日
發(fā)明者廖志華, 敏 陳, 容 諶 申請人:西南大學(xué)