專利名稱：污水中細菌的基因芯片檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌的基因芯片的檢測方法，特別是一種污水中細菌的基因芯片檢測方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，污水中細菌的檢測主要是利用傳統(tǒng)微生物學方法、生物化學方法、血清學方法和PCR方法(Santiago F.Gonzalez，Melissa J.Krug，MichaelE.NIelsen，et al.2004；Call，D.，M.Borucki，and T.Besser.200)。這些方法有一些限制(1)由于需要培養(yǎng)，所需時間長；(2)不能區(qū)別親緣關(guān)系相近的細菌；(3)不能鑒定未知的細菌；(4)交差反應和其他假陽性；(5)靈敏度問題(假陰性)。而利用基因芯片技術(shù)快速檢測細菌對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，可高效地探測到由細菌引起的污染，還能幫助研究人員找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。我們都知道，環(huán)境的變化會引起細胞發(fā)生基因表達水平的變化，基因芯片是高效的監(jiān)測基因表達變化的手段。所以，國外許多實驗室紛紛探索用DNA微陣列技術(shù)監(jiān)測環(huán)境污染和提高環(huán)境保護技術(shù)水平。
與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片技術(shù)的先進性主要體現(xiàn)在(1)基因芯片可以對污水中細菌實現(xiàn)高通量、并行檢測，一次實驗即可得出多個結(jié)果；能提高測試樣品數(shù)量5～10倍，另外測試成本能下降約10倍；(2)操作簡便、快速，整個檢測在數(shù)小時內(nèi)可以完成，而傳統(tǒng)的方法一般需要4～7天的時間；(3)特異性強、敏感性高，可以檢測污水中常見的致病菌；(4)可以區(qū)分到細菌的屬和種。目前多數(shù)基因芯片研究中大都在16SrRNA恒定區(qū)中設(shè)計細菌通用引物，在可變區(qū)設(shè)計檢測探針，雖然可以通過一次PCR反應將所有細菌的相應基因片段擴增出來，但是由于腸道致病菌(沙門氏菌、支賀氏菌和大腸桿菌等)探針所在的16SrRNA序列基本相同，所以只能作為一類細菌被檢出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種污水中細菌的基因芯片檢測方法，該方法以不同細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針，所設(shè)計的引物對目的細菌具有良好的擴增效果，無非特異性擴增。
為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案一種污水中細菌的基因芯片檢測方法，其特征在于該方法步驟如下a)目的細菌的選擇；b)所選細菌的特異引物和種、屬檢測探針的設(shè)計根據(jù)所選取的不同目的細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針；c)根據(jù)所設(shè)計的檢測探針，制備基因芯片；d)目的細菌的DNA的抽提；e)PCR擴增反應用所抽提的目的細菌的DNA作為PCR擴增反應的模板，進行線性擴增f)PCR擴增反應產(chǎn)物的雜交按以下配方配制雜交體系，混勻，避光備用，

其中，雜交液的為20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，10mg/mlSalmon DNA 1ml，去離子水54ml，充分混勻后，用0.45um濾膜去雜質(zhì)；g.雜交后的產(chǎn)物清洗、干燥后掃描。
上述的目的細菌為腸球菌、肺炎克雷白菌、熒光綠膿桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸O-157和大腸桿菌；所述的PCR引物為


所述的種、屬檢測探針為

探針的濃度為10μmol/l。
所述目的細菌的DNA的抽提的方法為1.將污水中的細菌進行微生物培養(yǎng)；2.將培養(yǎng)出的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)16h后，吸取培養(yǎng)液500μl于1.5ml的離心管中；3.將離心管置于100℃水浴鍋中15分鐘左右，加速細胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率；4.取出離心管，室溫下放置5min左右使變性的DNA復性，加入1000μl的細胞裂解液異硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸鈉C2H3O2Na·3H2O 1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，異丙醇C3H8O 17ml，以雙蒸水定容至100ml，放置20分鐘，加入之后要用震蕩器震蕩完全，使細胞壁能夠完全裂開，核酸和蛋白質(zhì)將保留在溶液里；5.4℃、13000rpm離心5分鐘，使細胞碎片可以沉淀下來除去；6.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一體積即400μl的冰無水乙醇于-20℃中，再劇烈震蕩，使之充分混合，否則會出現(xiàn)結(jié)晶；然后放置在-20℃的冰箱中20分鐘或者過夜，使溶液中的DNA能充分沉淀；7.取出，以15000rpm的速度在4℃下離心20分鐘；這時在離心管底部可以看見白色的DNA沉淀；8.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的溫度烘干剩余的無水乙醇；溶解沉淀的DNA，控制DNA的濃度為0.2-2μmol/l.
上述的擴增反應體系為

所述的擴增反應條件為

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下顯而易見的突出實質(zhì)性特點和顯著優(yōu)點本發(fā)明根據(jù)所選取的不同細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針，所設(shè)計的引物具有良好的特異性，對目的細菌擴增效果良好，無非特異性擴增。純細菌DNA的抽提方法簡單易行，2h內(nèi)即可抽提目的細菌的DNA且得率較高；PCR擴增和雜交方法、條件易于實施，雜交檢測結(jié)果穩(wěn)定，有利于該技術(shù)的實際應用。本發(fā)明方法基于基因芯片技術(shù)的檢測方法體現(xiàn)出了高通量、高效率、并行化處理的特點，對于一份食品工業(yè)污水水樣，可以在4h之內(nèi)完成目的菌種的檢測。這種檢測技術(shù)為以后更大規(guī)模的檢測研究奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，可以推廣應用于環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督、商品檢驗檢疫等許多領(lǐng)域。


圖1是本發(fā)明實施例的芯片點陣位置圖。
圖2是本發(fā)明實施例混合PCR引物擴增單鏈DNA圖，圖中1~4泳道為加入引物I擴增的，依次為肺克、0-157、沙門和志賀，其中志賀條帶比較淺，這與擴增效率有關(guān)。5~7泳道為加入引物II的，依次為大腸桿菌、綠膿和腸球菌，由于引物中混和了23SrRNA的引物，所以各泳道中在358bp處都可見條帶。泳道8為陰性對照，陰性無污染。
圖3是本發(fā)明實施例目的細菌DNAPCR擴增反應產(chǎn)物的雜交示意4是本發(fā)明實施例目的細菌DNA模板擴增產(chǎn)物雜交掃描結(jié)果具體實施方式
實施例一本實施例以食品加工污水水樣中選取腸球菌、肺炎克雷白菌、熒光綠膿桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸0-157和大腸桿菌這7種細菌作為目的細菌。
1.細菌特異引物和種、屬檢測探針的特異性設(shè)計首先登陸GeneBank(http//ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，存核酸數(shù)據(jù)庫中檢索，得到與上述7種細菌的16SrRNA基因序列。應用Mac Vector6.5.1軟件包的ClustalW Alignment程序進行序列對齊，得到堿基對齊圖和聚類分析的結(jié)果。根據(jù)堿基對齊圖劃分出16SrRNA基因的恒定區(qū)和可變區(qū)。在可變區(qū)用Primer5.0軟件設(shè)計雙鏈引物，將得到的侯選雙鏈引物進行BLAST比較，篩選出針對細菌特異性最好引物進行合成，并進行5’端Cy3熒光標記，即作為上述7種細菌的PCR引物。再根據(jù)這7種細菌的PCR引物設(shè)計檢測探針，經(jīng)過篩選后在GeneBank進行BLAST對比，找出特異性最好的進行合成，即作為種、屬檢測探針，PCR引物和種、屬檢測探針見附表1和表2。
表1 特異PCR引物序列


表2 種、屬檢測探針

2.基因芯片制備采用基因芯片點樣儀進行點樣，參見圖1，點樣后的芯片經(jīng)過封閉、60℃烘干后4℃保存，制成10*8陣列，每塊玻片上6個陣列。探針的濃度為10μmol/l。
3.基因芯片檢測的步驟A.水樣來源分別從三家企業(yè)取得生產(chǎn)廢水處理前后水樣進行編號，見下表3，放入4℃的冰箱冷藏室待用。
表3 水樣編號表


B.水樣中細菌DNA的抽提(1)培養(yǎng)基的制作和滅菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏0.75克，蛋白胨1.5克，氯化鈉0.75克，瓊脂3克，蒸餾水150mL，pH7.6。取300mL的燒杯一個，裝150mL的蒸餾水。在藥物天平上依次稱取上述配方中的各成分，放入水中溶解，待瓊脂完全融化后停止加熱，補充蒸發(fā)損失的水量。用10％的NaOH調(diào)整pH值為7.6。將培養(yǎng)基分裝5只試管中，其余的全部倒入250mL的錐形瓶中，分別塞上棉塞，包上報紙待滅菌。配置無菌稀釋水取250mL的錐形瓶裝90mL的蒸餾水，放30顆玻璃珠，塞棉塞，包扎，待滅菌。本實驗中使用高壓滅菌鍋進行滅菌將需消毒滅菌的物品放入加好水的高壓滅菌鍋中，旋緊鍋蓋，通電，關(guān)上安全閥，打開放氣閥。待冷空氣放出后，關(guān)上放氣閥，維持氣壓在1.05kg/cm2(約126℃)30min后，關(guān)電源，放氣，打開蓋子取出已滅菌物品放入無菌室內(nèi)。無菌室內(nèi)紫外燈打開照射30min滅菌，以下操作均在無菌室中進行。
(2)純細菌DNA的抽提a.將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)16h后，吸取培養(yǎng)液500μl于1.5ml的離心管中。
b.將離心管置于100℃水浴鍋中15分鐘左右，加速細胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率。
c.取出離心管，室溫下放置5min左右使變性的DNA復性，加入1000μl的細胞裂解液(異硫氰酸胍(CH5N3·CHNS)47.264g，醋酸鈉(C2H3O2Na·3H2O)1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，異丙醇(C3H8O)17ml，以雙蒸水定容至100ml)，放置20分鐘，加入之后要用震蕩器震蕩完全，使細胞壁能夠完全裂開，核酸和蛋白質(zhì)將保留在溶液里。
d.4℃、13000rpm離心5分鐘，使細胞碎片可以沉淀下來除去。
e.取上清液800μl(含DNA)加入到二分之一體積即400μl的冰無水乙醇(-20℃)中，再劇烈震蕩，使之充分混合，否則會出現(xiàn)結(jié)晶。然后放置在-20℃的冰箱中20分鐘或者過夜，使溶液中的DNA能充分沉淀。
f.取出，以15000rpm的速度在4℃下離心20分鐘。這時在離心管底部可以看見白色的DNA沉淀。
g.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的溫度烘干剩余的無水乙醇。
h.可以用100μl左右的8mM/L NaOH溶解沉淀的DNA，普通蒸餾水也可以，但弱堿性的溶劑更佳?？刂艱NA的濃度為1μmol/l。
C.PCR擴增反應及混合引物將7菌和23SrRNA的引物分成兩組進行PCR反應，引物I為(Kp+HlyA+InvA+ipaH)；引物II為(Cadc+OprI+Ent+23SrRNA)，用所抽提的DNA作為PCR反應的模板，按一定的擴增體系(見表4)和反應條件(見表5)線性擴增，之后再將兩組擴增產(chǎn)物進行混合，參見圖2。
表4 PCR引物擴增體系

表5 PCR引物擴增反應條件

D.PCR擴增產(chǎn)物的雜交和掃描，參見圖3及圖4a.用表5配方配制雜交體系，混勻，避光備用。其中雜交液為取20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，10mg/ml Salmon DNA 1ml，去離子水54ml，充分混勻后，用0.45um濾膜去雜質(zhì)后備用。
b.預熱雜交爐或水浴鍋至雜交溫度，將干燥的雜交倉取出向倉內(nèi)加入80μl無菌水以保持雜交時倉內(nèi)的濕度。
c.吸取4μl雜交混合液注入純化好PCR產(chǎn)物的離心管中，小心加入以免產(chǎn)生過多氣泡，溶解管內(nèi)的DNA，靜置1h，使DNA充分溶解。
d.取一張點好探針的芯片，放置在標準位置紙上，對準紙上的點陣位置，將混合液小心點于探針陣列區(qū)域，蓋上蓋玻片后立即放入雜交倉內(nèi)，擰緊螺絲，放入水浴鍋中，48℃雜交2h。
e.雜交后的芯片要經(jīng)過嚴謹條件下的洗滌，以除去未雜交的一切殘留物。取出雜交倉，旋松螺絲，取出芯片。放入洗液A(0.1％SDS，2×SSC)洗8min，然后連架子取出，傾斜，使殘留洗液A流盡，之后連架子放入洗液B(2×SSC)洗8min。
f.取出芯片，放入裝有吸水紙的50ml離心管中，4℃、2000rpm離心2min甩干芯片并放入干燥盒內(nèi)，干燥后即可進行掃描。采用美國Parkard公司的ScanArray4000激光共聚焦掃描儀掃讀芯片，掃讀后，分析圖譜，根據(jù)信號的強弱，可確定待測細菌的存在。
表5 雜交體系

從圖中可以看出，亮點的位置都準確清晰，與PCR反應的結(jié)果一致。由此確定所采水樣中所含細菌見表6。
表6 水樣中所含細菌基因表

權(quán)利要求
1.一種污水中細菌的基因芯片檢測方法，其特征在于該方法的具體步驟如下a.目的細菌的選擇；b.所選細菌的特異引物和種、屬檢測探針的設(shè)計根據(jù)所選取的不同目的細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針；c.根據(jù)所設(shè)計的檢測探針，制備基因芯片；d.目的細菌的DNA的抽提；e.PCR擴增反應用所抽提的目的細菌的DNA作為PCR擴增反應的模板，進行線性擴增f.PCR擴增反應產(chǎn)物的雜交按以下配方配制雜交體系進行雜交，試劑體積6×雜交液 2μCy3(生物素) 1μlSACy3 1μl其中，雜交液的為20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，10mg/ml Salmon DNA 1ml，去離子水54ml，充分混勻后，用0.45um濾膜去雜質(zhì)；g.雜交后的產(chǎn)物清洗、干燥后掃描。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的污水中細菌的基因芯片檢測方法，其特征在于所述的目的細菌為腸球菌、肺炎克雷白菌、熒光綠膿桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸0-157和大腸桿菌；所述的PCR引物為細菌名稱 引物名稱 序列大腸0-157EC-hlyA-F3 AAGCCGGAACAGTTCTCTCAEC-hlyA-R3BBiotin-CACTTGCAGCTGTTGTCGAT沙門氏菌 Sa-InvA-F3 AGCCGCTCAGTATTGAGGAASa-InvA-R3BBiotin-GTTGTACCGTGGCATGTCTG志賀氏菌 Sh-IpaH-F4 CTTTCCGATACCGTCTCTGCSh-IpaH-R4BBiotin-CAGTCTCACGCATCACCTGT大腸桿菌 EC-CadC-F3 TTTTCTGCTCTCGCGTAGGTEC-CadC-R3BBiotin-AGCTGGCGATTCAAAATGAT腸球菌 Ent-F2 TTGATGGTCCTATGCCTCAAAEnt-R2B Biotin-CGATTTCAACTTCGTCACCA肺炎克雷白菌KP16S-F AGCGGTAGCACAGAGAGCTTGKP16S-RB Biotin-CCCACTTTGGTCTTGCGAC熒光綠膿桿菌OprI-F2 GGGGAGATTGCTGTTATGGAOprI-R2B Biotin-TATTACTTGCGGCTGGCTTT細菌通用23SRNA-FBBiotin-CGGCGGCCGTAACTATAAC23SRNA-R AGACCGCCCCAGTCAAAC；所述的種、屬檢測探針為探針名稱 序列 長度EHEC-HlyA-R3TPNNH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAATTATTCTGGCTCAGAGAATGGCACAGGGGTT36ST-InvA-R3TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCT 40Shig-ipaH-R4TPNNH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGC 24EC-CadC-R2TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGATTGAACAATCTCACCTAATAATTCACTGGCACGA40Ent-P NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCAATCACTGGACGTGGTACTGTTGCTAC32KP16S-PNH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 31PS-OprI-RTPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTAACGAGCGTGCCCTGCGCATG 2523SRNA-FTPNNH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACAAGGAATTTCGCTACCTTAGGACC27探針的濃度為10μmol/l。
3.根據(jù)根利要求1所述的污水中細菌的基因芯片檢測方法，其特征在于所述目的細菌的DNA的抽提的方法為A.將污水中的細菌進行微生物培養(yǎng)；B.將培養(yǎng)出的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)16h后，吸取培養(yǎng)液500μl于1.5ml的離心管中；C.將離心管置于100℃水浴鍋中15分鐘左右，加速細胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率；D.取出離心管，室溫下放置5min左右使變性的DNA復性，加入1000μl的細胞裂解液異硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸鈉C2H3O2Na·3H2O 1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，異丙醇C3H8O 17ml，以雙蒸水定容至100ml，放置20分鐘，加入之后要用震蕩器震蕩完全，使細胞壁能夠完全裂開，核酸和蛋白質(zhì)將保留在溶液里；E.4℃、13000rpm離心5分鐘，使細胞碎片可以沉淀下來除去；F.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一體積即400μl的冰無水乙醇于-20℃中，再劇烈震蕩，使之充分混合，否則會出現(xiàn)結(jié)晶；然后放置在-20℃的冰箱中20分鐘或者過夜，使溶液中的DNA能充分沉淀；G.取出，以15000rpm的速度在4℃下離心20分鐘；這時在離心管底部可以看見白色的DNA沉淀；H.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的溫度烘干剩余的無水乙醇；溶解沉淀的DNA，控制DNA的濃度為0.2-2μmol/l。
4.根據(jù)根利要求1所述的污水中細菌的基因芯片檢測方法，其特征在于所述的擴增反應體系為試劑體積，50μl10×PCR Buffer，Mg2+Free 5μlMgcl225mM 3μlDNTP 10mM 1μlrTaq 2500U，5U/μl 0.25μl引物2μl模板2μl滅菌水 36.75μl；所述的擴增反應條件為步驟 溫度(℃)時間 返回 循環(huán)數(shù)初始DNA變性94℃3min變性 94℃30sec退火 54℃1min延伸 72℃1min 步驟235變性 94℃30sec退火 52℃30sec步驟55保留 4℃ Forever。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種污水中細菌的基因芯片檢測方法。本發(fā)明該方法步驟包括目的細菌的選擇、根據(jù)所選取的不同目的細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針、根據(jù)所設(shè)計的檢測探針，制備基因芯片、目的細菌的DNA的抽提、PCR擴增反應、PCR擴增反應產(chǎn)物的雜交、雜交后的產(chǎn)物清洗、干燥后掃描。本發(fā)明根據(jù)所選取的不同細菌的特征基因作為芯片檢測的靶基因，針對不同細菌的特定基因分別設(shè)計PCR引物和種、屬檢測探針，所設(shè)計的引物具有良好的特異性，對目的細菌擴增效果良好，無非特異性擴增。純細菌DNA的抽提方法簡單易行，2h內(nèi)即可抽提目的細菌的DNA且得率較高；PCR擴增和雜交方法、條件易于實施，雜交檢測結(jié)果穩(wěn)定，有利于該技術(shù)的實際應用。
文檔編號C12Q1/68GK1824805SQ200510111330
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者何池全, 胡永雋, 肖華勝, 繆金明, 張慶華, 徐高田 申請人:上海大學, 上海生物芯片有限公司