專利名稱：基因重組融合蛋白pfk－k5的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤即癌癥，是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一。惡性實體腫瘤的常規(guī)治療包括手術摘除、化學治療、放射治療等，這些治療方法存在易復發(fā)，對人體的毒副作用大，會誘導抗藥性產生等不理想之處。生命科學基礎研究的突破和生物技術的發(fā)展，為惡性腫瘤的最終攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世紀70年代初，F(xiàn)olkman博士提出“腫瘤增殖具有血管依賴性”的觀點，即體積超過1mm3～2mm3的腫瘤需要新生血管維持營養(yǎng)和氧氣的供給并且排出代謝產物，還需要新生血管提供轉移的通道。從這個觀點出發(fā)，提出一種治療腫瘤的新策略，即不直接從正面攻擊腫瘤，而是阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應，間接地抑制腫瘤生長，使其處于休眠狀態(tài)。這就是抗血管生成療法，也被形象地稱為腫瘤的“餓死療法”。
抗血管生成療法是近幾年來腫瘤生物治療研究的熱點，與以往的方法相比，有著顯著的優(yōu)越性①廣泛的抑瘤譜；②不易產生耐藥性；③無明顯毒副作用；④藥物易于到達靶部位；⑤可同時治療腫瘤的轉移；⑥與化療和放療有協(xié)同作用。目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生成抑制劑，有數(shù)百種藥物進入了臨床試驗階段，大多數(shù)處于二期臨床，有十幾種藥物進入了三期臨床，它們都顯示出了初步療效和光明的治療前景。
PF4(人血小板第四因子)能抑制內皮細胞增殖和血管新生，它的COOH末端是活性關鍵部位。目前PF4已進入二期臨床試驗。
Angiostatin(血管抑素)是人纖溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4區(qū)域，具有抑制血管內皮細胞增殖的能力。目前血管抑素已進入一期臨床試驗。其中K1(Kringle 1)不僅能有效抑制內皮細胞的增殖，還具有結合賴氨酸的能力(可以用賴氨酸親和柱純化蛋白)。
K5是人纖溶酶原的kringle 5區(qū)域，研究表明具有抑制內皮細胞生長的功能，且活性明顯高于血管抑素。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，該方法利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)對重組基因PFK-K5進行表達，從而得到一種多靶點、多功能、高效的抗腫瘤血管生成基因重組融合蛋白PFK-K5。
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建重組質粒pPICZαA-PFK-K5包括3個功能域片段和2段連接臂，3個功能域片段分別是PF4 COOH端的13個氨基酸、K1基因和K5基因；2段連接臂分別是連接PF4 COOH端13個氨基酸和K1基因的柔性連接臂(Gly)3；連接K1基因和K5基因的柔性連接臂(Ser(Gly)4)3；其構建方法包括如下步驟(1)重組質粒pPICZαA-PFK的構建；(2)重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建；c.重組融合蛋白PFK-K5的表達；d.重組融合蛋白PFK-K5的純化。
上述的重組質粒pPICZαA-PFK的構建方法為PFK片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-PFK。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建的方法為以K5基因為模板進行PCR擴增，得到300bp的K5基因，K5片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-PFK中，構成重組質粒pPICZαA-PFK-K5；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-PFK-K5用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
上述的重組融合蛋白PFK-K5的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到1.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為0.5％，至重組酵母表達目的蛋白的量達到要求的值。
上述的重組融合蛋白PFK-K5的純化為用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，將發(fā)酵上清液加入用0.02M PBS，PH＝8.0平衡好的親和柱，0.2M NaCl/0.02MPBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M 6-氨基正己酸EACA/0.02M PBS，PH＝7.4洗脫，再經0.02M PBS，PH＝7.4，2×24小時透析后凍存在-20℃。
畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(PAOX1)，在甲醇的誘導下能表達外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取與純化。畢赤酵母能通過發(fā)酵罐發(fā)酵生產大量的目的蛋白，不需要外加熱源，成本低，規(guī)模大。


圖1為重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建流程2為PFK-K5蛋白對PIEC細胞生長的抑制率曲線圖具體實施方式
本發(fā)明主要包括三大部分重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建，重組融合蛋白PFK-K5的表達與純化，重組融合蛋白PFK-K5生物活性的測定。具體方案敘述如下1重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建和鑒定融合基因PFK-K5包括3個功能域片段和2段連接臂。3個功能域片段分別是PF4COOH端的13個氨基酸、K1基因和K5基因；2段連接臂分別是連接PF4 COOH端13個氨基酸和K1基因的柔性連接臂(Gly)3；連接K1基因和K5基因的柔性連接臂(Ser(Gly)4)3。實驗操作時，參見圖1，首先將PF4 COOH端的13個氨基酸和K1基因連接，構建融合基因PFK，再進一步將PFK和K5基因連接，構建融合基因PFK-K5。
1.1重組質粒pPICZαA-PFK的構建和鑒定根據K1和PF4 COOH-末端13個氨基酸的核苷酸序列設計PFK的上下游引物上游引物5’-GGGGAA TTCCCG CTG TAC AAG AAA ATA ATT AAG AAA CTT TTG GAGAGT GGC CCG GGC GTG TAT CTC TCA GAG TGC-3’；下游引物5’-ACGGT ACCGCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA ACCACC AGA ACA CAC-3’。
為了能以K1基因為模板，通過PCR直接得到PFK融合基因，我們在PFK的上游引物中引入PF4 COOH端的39個核苷酸和連接臂(Gly)3的核苷酸序列，在下游引物中引入柔性連接臂(Ser(Gly)4)3的核苷酸序列，這樣在PCR擴增之后就能直接得到350bp的融合基因PFK?；厥占兓瘮U增產物。
PFK片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-PFK。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。重組質粒pPICZαA-PFK用EcoRI和Kpn I雙酶切，得到350bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，PFK基因的序列正確。
1.2構建重組質粒pPICZαA-PFK-K5根據K5的核苷酸序列設計K5的上下游引物上游引物5’-AATGGT ACCCCT GTT GTC CTG CTT CCA-3’；下游引物5’-TTCGCG GCC GCT CAT TAA TCA AAT-3’。
以K5基因為模板進行PCR擴增，得到300bp的K5基因。K5片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-PFK中，構成重組質粒pPICZαA-PFK-K5。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
重組質粒pPICZαA-PFK-K5用EcoRI和NotI雙酶切，得到650bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，PFK-K5基因的序列正確。
2重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建和鑒定重組質粒pPICZαA-PFK-K5用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。挑選Zeocin濃度為1000ug/ml平板上長出的克隆。用玻璃珠法提取重組酵母的染色體組，以其為模板，以PFK的上游引物和K5的下游引物進行PCR擴增，得到650bp大小的片段，說明融合基因PFK-K5成功地整合到了酵母染色體上。
3重組融合蛋白PFK-K5的表達將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到1.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為0.5％，并且每隔24小時(0，24，48，72，96小時)取出1ml菌液，將取出來的菌液離心，把上清液和菌體分別保存在-80℃。
將甲醇誘導不同時間(0，24，48，72，96小時)的發(fā)酵上清液濃縮后用SDS-PAGE分析，從圖4觀察到在39KD處有特異性蛋白條帶；并且隨誘導時間延長，重組酵母表達目的產物的量也隨之增加。Bradford法測定發(fā)酵液中總蛋白含量并用凝膠圖像掃描測定目的蛋白所占的比例，計算出

4重組融合蛋白PFK-K5的純化融合蛋白PFK-K5中的K1具有結合賴氨酸的能力，因此可以用Sepharose 4B-Lys親和柱純化。用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，將發(fā)酵上清液加入用0.02MPBS(PH＝8.0)平衡好的親和柱，0.2M NaCl/0.02M PBS(PH＝7.4)洗去雜蛋白，0.2MEACA(6-氨基正己酸)/0.02M PBS(PH＝7.4)洗脫。取10uL的洗脫液進行SDS-PAGE分析，剩余部分透析(0.02M PBS，PH＝7.4，2×24小時)后凍存在-20℃。
SDS-PAGE電泳圖經凝膠圖像密度掃描表明，純化的重組融合蛋白PFK-K5的純度到達95％。本發(fā)明保留進一步提高純度的可能。
5 12.8升發(fā)酵罐生產重組融合蛋白PFK-K5在優(yōu)化了的發(fā)酵條件下，重組融合蛋白PFK-K5的表達量達到275mg/L。
6MTT法測定重組融合蛋白PFK-K5的生物活性將純化得到的重組融合蛋白PFK-K5，分別以終濃度100，50，25，10，5ng/ml加入豬髖動脈內皮細胞(PIEC)培養(yǎng)液中，用MTT比色分析法測定PFK-K5蛋白對PIEC細胞生長的抑制率。圖2的抑制率曲線表明PFK-K5能抑制豬髖動脈內皮細胞的生長，ID50≈78ng/ml。
7重組菌株的遺傳穩(wěn)定性將重組酵母菌pPICZαA-PFK-K5/GS115傳代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍穩(wěn)定地整合在染色體上，SDS-PAGE結果說明目的蛋白仍然表達，Bradford法測定和凝膠圖像密度掃描證實目的蛋白的表達量基本維持不變。
最終獲得的重組融合蛋白PFK-K5的氨基酸序列為PLYKKIIKKLLESGPGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEESGGGSGGGSGGGTPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFD.
權利要求
1.一種基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建重組質粒pPICZαA-PFK-K5包括3個功能域片段和2段連接臂，3個功能域片段分別是PF4 COOH端的13個氨基酸、K1基因和K5基因；2段連接臂分別是連接PF4 COOH端13個氨基酸和K1基因的柔性連接臂(Gly)3；連接K1基因和K5基因的柔性連接臂(Ser(Gly)4)3；其構建方法包括如下步驟(1)重組質粒pPICZαA-PFK的構建；(2)重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建；c.重組融合蛋白PFK-K5的表達；d.重組融合蛋白PFK-K5的純化。
2.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-PFK的構建方法為PFK片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-PFK；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
3.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-PFK-K5的構建的方法為以K5基因為模板進行PCR擴增，得到300bp的K5基因，K5片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-PFK中，構成重組質粒pPICZαA-PFK-K5；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
4.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-PFK-K5/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-PFK-K5用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
5.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白PFK-K5的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至0.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其0.D.值達到1.0，在28℃下進行甲醇誘導；每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為0.5％，至重組酵母表達目的蛋白的量達到要求的值。
6.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白PFK-K5的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白PFK-K5的純化為用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，將發(fā)酵上清液加入用0.02M PBS，PH＝8.0平衡好的親和柱，0.2M NaCl/0.02M PBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M 6-氨基正己酸EACA/0.02M PBS，PH＝7.4洗脫，再經0.02M PBS，PH＝7.4，2×24小時透析后凍存在-20℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因重組融合蛋白PFK－K5的制備方法。該方法包括以下步驟重組質粒pPICZαA－PFK－K5的構建，其中包括重組質粒pPICZαA－PFK的構建、重組質粒pPICZαA－PFK－K5的構建、重組酵母基因工程菌pPICZαA－PFK－K5/GS115的構建、重組融合蛋白PFK－K5的表達、重組融合蛋白PFK－K5的純化。畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(P
文檔編號C12N1/19GK1818069SQ20051011133
公開日2006年8月16日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權日2005年12月9日
發(fā)明者陳宇光, 黃筱穎, 張尚權, 談利松, 張培德 申請人:上海大學