本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種喉鱗癌的診斷標志物及其治療靶標，具體的所述診斷標志物及其治療靶標為myoz3。

背景技術(shù)：

喉癌分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。原發(fā)性喉癌指原發(fā)部位在喉部的腫瘤，以鱗狀細胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma，lscc)最為常見，占90％以上。喉癌的發(fā)生是經(jīng)過多個階段逐步發(fā)展形成的，從正常黏膜、增生肥厚、輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、侵襲性癌到轉(zhuǎn)移。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們對喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展有了一定的了解，但是其具體發(fā)病機制仍不清楚。喉癌雖可通過手術(shù)、化療、放療等多種手段進行綜合治療，但仍有部分患者，雖經(jīng)根治手術(shù)和放化療，仍因局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移，難以救治以致死亡。喉癌依然嚴重威脅著患者的生命安全，迫切需要找到更為有效的腫瘤診斷和治療方法。

高通量技術(shù)的發(fā)展為疾病發(fā)病機理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，高通量測序技術(shù)因其產(chǎn)生數(shù)字化信號、高靈敏度以及全基因組分析而得到廣泛的應用。通過對患者的樣本進行高通量測序，尋找在疾病中差異表達的基因，并通過進一步實驗排除假陽性，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)的基因，從而為疾病機理的研究，以及疾病的預測和藥物開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種喉鱗癌的診斷標志物，通過檢測樣本中標志物的表達水平來判斷患者是否患有喉鱗癌或者患喉鱗癌的風險。

本發(fā)明的目的之二，提供一種喉鱗癌的治療靶標，通過改變患者中靶標的表達水平，從而達到治療喉鱗癌的目的。

本發(fā)明的目的之三，提供一種篩選預防或治療喉鱗癌的潛在物質(zhì)的方法，通過所述物質(zhì)能否調(diào)節(jié)生物靶標的表達水平來判斷所篩選的物質(zhì)是否是預防或治療喉鱗癌的潛在物質(zhì)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測myoz3表達水平的試劑在制備診斷喉鱗癌的產(chǎn)品中的應用。

進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒。其中，所述產(chǎn)品可以通過rt-pcr、實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或芯片技術(shù)等檢測技術(shù)來檢測myoz3的表達。

本發(fā)明提供了一種芯片、制劑或試劑盒，包括檢測樣本中myoz3基因或其編碼的蛋白表達水平的試劑。

進一步，所述試劑包括特異性識別myoz3的探針或特異性擴增myoz3的引物；或特異性結(jié)合myoz3編碼的蛋白的抗體或配體。

進一步，所述試劑至少包括一對特異性擴增myoz3的引物，優(yōu)選的所述特異性擴增myoz3的引物的序列如seqidno.1～2所示。

在本發(fā)明中，所述芯片、制劑或試劑盒可用于檢測包括myoz3在內(nèi)的與喉鱗癌相關(guān)的多個基因和/或其表達產(chǎn)物的表達水平。多個基因聯(lián)合診斷，可以增加喉鱗癌診斷的準確性。

本發(fā)明提供了myoz3在篩選預防或治療喉鱗癌的潛在物質(zhì)中的應用。

進一步，所述潛在物質(zhì)為可以促進myoz3基因和/或其編碼的蛋白表達水平或活性的物質(zhì)。

進一步，篩選潛在物質(zhì)的步驟如下：

用候選物質(zhì)處理表達或含有myoz3基因或其編碼的蛋白的體系；和

檢測所述體系中myoz3基因或其編碼的蛋白的表達或活性；

其中，若所述候選物質(zhì)可促進myoz3基因或其編碼的蛋白的表達或活性(優(yōu)選顯著升高，如高20％以上，較佳的高50％以上；更佳的高2倍以上)，則表明該候選物質(zhì)是預防或治療喉鱗癌的潛在物質(zhì)。

進一步，所述步驟還包括：對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從潛在物質(zhì)中進一步選擇和確定對于預防、緩解或治療喉鱗癌有用的物質(zhì)。

在本發(fā)明中，所述體系包括(但不限于)：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。所述候選化合物包括(但不限于)：針對myoz3基因或其上游或下游基因設(shè)計的核酸促進物、蛋白促進劑、蛋白結(jié)合分子。

本發(fā)明提供了myoz3功能性表達的促進劑在制備治療喉鱗癌的藥物組合物中的應用。

進一步，所述促進劑包括提高myoz3基因或其表達產(chǎn)物穩(wěn)定性、上調(diào)myoz3基因或其表達產(chǎn)物的表達水平、增加myoz3基因或其表達產(chǎn)物有效作用時間的物質(zhì)。

本發(fā)明提供了一種治療喉鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括myoz3功能性表達的促進劑。所述促進劑包括提高myoz3基因或其表達產(chǎn)物穩(wěn)定性、上調(diào)myoz3基因或其表達產(chǎn)物的表達水平、增加myoz3基因或其表達產(chǎn)物有效作用時間的物質(zhì)。

進一步，所述藥物組合物還包括與所述促進劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

所述藥學上可接受的載體和/或輔料，包括(但不限于)稀釋劑、粘合劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤滑劑、填充劑、崩解劑。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測myoz3基因在喉鱗癌組織中的表達情況圖；

圖2是利用westernblot檢測myoz3蛋白在喉鱗癌組織中的表達情況圖；

圖3是myoz3在喉鱗癌細胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；其中，圖a是利用qpcr檢測轉(zhuǎn)染對喉鱗癌細胞中myoz3mrna表達的影響圖；圖b是利用westernblot檢測轉(zhuǎn)染對喉鱗癌細胞中myoz3蛋白的影響圖；

圖4是用mtt法檢測myoz3基因?qū)眵[癌細胞增殖的影響圖；

圖5是用流式細胞儀檢測myoz3基因?qū)眵[癌細胞凋亡的影響圖；

圖6是利用細胞劃痕實驗檢測myoz3對喉鱗癌細胞遷移的影響圖；

圖7是利用transwell小室檢測myoz3對喉鱗癌細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量測序方法，檢測喉鱗癌標本中基因在腫瘤組織和正常癌旁粘膜組織的表達，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的基因，探討其與喉鱗癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為喉鱗癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了喉鱗癌中myoz3顯著性下調(diào)。實驗證明，通過增加myoz3的表達水平，能夠有效地抑制喉鱗癌細胞的生長、凋亡和侵襲，提示檢測myoz3基因的表達水平可成為喉鱗癌早期診斷的輔助診斷指標之一，上調(diào)myoz3基因表達可成為預防或治療喉鱗癌或喉鱗癌轉(zhuǎn)移的新途徑。

myoz3基因

myoz3是位于人5號染色體長臂3區(qū)3帶上，本發(fā)明中的myoz3包括野生型、突變型或其片段。一種代表性的myoz3基因序列如目前國際公共核酸數(shù)據(jù)庫genebank中myoz3基因(nc_000005.10)所示。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標志物的表達水平。

芯片、制劑、試劑盒

在本發(fā)明中，“芯片”、“微陣列”、“陣列”可以等同替代，包括(但不限于)：dna微陣列(例如，cdna微陣列和寡核苷酸微陣列)、蛋白質(zhì)微陣列、組織微陣列、轉(zhuǎn)染或細胞微陣列、化學化合物微陣列和抗體微陣列。通常稱為基因芯片、dna芯片或生物芯片的dna微陣列是微觀dna點的集合，這些點連接到固體表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于對數(shù)千種基因同時進行表達譜分析或表達水平監(jiān)測的陣列。固定的dna片段稱為探針，其數(shù)千個可用于單個dna微陣列中。微陣列可用于通過比較疾病和正常細胞中的基因表達而識別疾病基因或轉(zhuǎn)錄本(例如，ncrna)。微陣列可使用多種技術(shù)加以制造，包括但不限于：用細尖針印刷到載玻片上、使用預制的掩模進行光刻、使用動態(tài)微鏡器件進行光刻、噴墨印刷或微電極陣列上的電化學方法。

術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

本發(fā)明中針對myoz3基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測myoz3的表達。優(yōu)選的，所述的制劑或試劑盒中還含有用于標記rna樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

本發(fā)明的試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑盒進行檢測，和如何利用檢測結(jié)果對腫瘤發(fā)展進行判斷、對治療方案進行選擇。

在本發(fā)明中，與myoz3特異性結(jié)合的抗體或配體包括單克隆抗體、多克隆抗體；本發(fā)明不僅包括完整的抗體分子，也包括抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與myoz3蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體

促進劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種所述myoz3促進劑，所述促進劑包括提高myoz3基因或其表達產(chǎn)物穩(wěn)定性、上調(diào)myoz3基因或其表達產(chǎn)物的表達水平、增加myoz3基因或其表達產(chǎn)物有效作用時間的物質(zhì)。

通常，可將這些促進劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中ph通常約為5-8，較佳地ph約為6-8，盡管ph值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的myoz3的促進劑是一種myoz3的表達載體。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。

在本發(fā)明中，是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達載體向宿主細胞中的導入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、deae葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細胞膜透過性肽的結(jié)合等周知的方法。

在本發(fā)明中，“宿主細胞”胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅s2或sf9的昆蟲細胞；cho、cos、或293細胞的動物細胞等。

用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的myoz3的促進劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于治療喉鱗癌。任何前述的myoz3的促進劑均可用于組合物的制備。所述藥學上可接受的載體和/或輔料，包括(但不限于)稀釋劑、粘合劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤滑劑、填充劑、崩解劑。

其中，稀釋劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合劑如淀粉、預膠化淀粉、糊精、麥芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸鹽、黃原膠、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤滑劑如硬脂酸鋅、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末、氫化植物油、硬脂富馬酸鈉、聚氧乙烯單硬脂酸酯、單月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸鈉、月桂醇硫酸鎂、十二烷基硫酸鎂等；填充劑如甘露醇(粒狀或粉狀)、木糖醇、山梨醇、麥芽糖、赤蘚糖、微晶纖維素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉等；崩解劑如交聯(lián)乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基甲基、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、大豆多糖等。

本發(fā)明中的藥物組合物還可以包括穩(wěn)定劑、殺菌劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑及表面活性劑等添加劑。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。促進劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：所述的myoz3基因的促進劑的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。

本發(fā)明的藥物組合物還可以與其他治療喉鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將myoz3的促進劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶myoz3的促進調(diào)劑的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，具體情況需視所述的促進劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明中，術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。意在包括從任何來源獲得的標本或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品，諸如血漿、血清等。然而，此類樣本不應解釋為限制適用于本發(fā)明的樣本類型。

在本發(fā)明的具體實施例中，實驗都是按照至少重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，癌組織與正常癌旁粘膜組織的配對比較采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與喉鱗癌相關(guān)的基因標志物

1、樣品收集

各收集6例喉鱗癌組織及對應的正常黏膜組織樣本，組織樣本的取得獲得患者的知情同意，并且取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

1)加入液氮研磨組織至粉末，加入1mltrizol(invitrogen)溶液，吹打混勻，使組織充分裂解，靜置5min；

2)12000rpm4℃離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mlrnasefreeep管中；

3)加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置15min；

4)4℃環(huán)境中12000g離15min，溶液離心為三層，rna在上層水相，移至另一個新的rnasefreeep管；

5)加入0.5ml異丙醇，輕柔充分混勻，室溫靜置10min；

6)4℃下，12000g離心10min，加入與rnaisoplus等體積的75％乙醇沉淀rna，7500g4℃離心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗滌兩次，超凈臺風干；加入30μldepc水溶解沉淀。

8)rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanodrop2000對所提取的rna濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

使用ribo-zero試劑盒除去總rna中的核糖體rna。

4、構(gòu)建cdna文庫

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit進行cdna文庫的構(gòu)建，具體操作按說明書進行。

5、上機測序

使用hiseq4000測序平臺對cdna文庫進行測序，具體操作按說明書進行。

6、高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

對測序結(jié)果進行生物信息學分析，利用tophatv1.3.1進行rna-seq讀段定位，通過cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進行標準化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度，利用cuffdiff檢測差異表達，當p值<0.001，|log2(fold_change)normalized|>2時，認為mrna顯著差異表達。

7、結(jié)果

rna-seq結(jié)果顯示，在喉鱗癌患者中差異表達的基因有665個，上調(diào)的450個，下調(diào)的215個，其中基因myoz3在喉鱗癌組織中的表達量顯著低于正常癌旁黏膜組織中的表達量。

實施例2qpcr測序驗證myoz3基因的差異表達

1、對myoz3基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇喉鱗癌患者正常癌旁粘膜組織和喉鱗癌組織各50例。

2、rna提取具體步驟如實施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

3、逆轉(zhuǎn)錄：采用fastquantcdna第一鏈合成試劑盒(貨號：kr106)進行mrna反轉(zhuǎn)錄。具體步驟如下：

(1)加入5×gdnabuffer2.0μl，總rna1μg，加rnasefreeddh2o使總體積至10μl，水浴鍋中42℃加熱3min；

(2)構(gòu)建20μl反應體系，10×fastrtbuffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混勻；

(3)水浴鍋中42℃加熱15min，95℃加熱3min，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

4、qpcr擴增

(1)引物設(shè)計

根據(jù)genebank中myoz3基因和管家基因gapdh基因的編碼序列設(shè)計qpcr擴增引物，由博邁德公司合成。

myoz3基因的引物序列：

正向引物序列為5’-actacgcaacaacagagg-3’(seqidno.1)；

反向引物序列為5’-tgctaactcgaaagtgaact-3’(seqidno.2)。

gapdh基因的引物序列：

正向引物序列為5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.3)；

反向引物序列為5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.4)。

(2)pcr反應體系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×superrealpremixplus10μl，dna模板2μl，ddh2o7.4μl，50×roxreferencedye^△2μl，滅菌蒸餾水4.8μl。

(3)pcr反應條件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40個循環(huán)，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在abi7300型熒光定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與喉鱗癌正常癌旁粘膜組織相比，myoz3在喉鱗癌組織中表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，同高通量測序結(jié)果一致。

實施例3蛋白免疫印記實驗檢測myoz3蛋白的差異表達

1、組織總蛋白的提取

用剪刀剪碎組織后將其放入置于冰內(nèi)的玻璃勻漿器內(nèi)，ripa裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，按照每20mg組織標本加入100μl裂解液的比例加入相應量的ripa裂解液，玻璃勻漿器碾碎組織直至其充分裂解，將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min，收集上清。

2、總蛋白濃度測定

按照bca蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行蛋白濃度的測定。

3、sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進行電泳。

4、western檢測

1)電轉(zhuǎn)移

將pvdf膜放入甲醇溶液中激活5min，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡20min。取出page膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，切下相應的page膠，按照由下到上依次為濾紙、pvdf膜、page膠、濾紙的順序放到半干的轉(zhuǎn)膜儀中，恒壓25v轉(zhuǎn)膜1.5h；

2)免疫雜交

取出pvdf膜，pbs沖洗后置于5％bsa溶液中室溫下?lián)u動封閉2h，將pvdf膜放入雜交袋中，加入一抗過夜，用tbst緩沖液洗滌pvdf膜，再加入相應的二抗，室溫下孵育2h，tbst緩沖液洗滌。

3)dab顯色

pvdf膜稍干后滴加新鮮配制的dab顯色液，pvdf膜顯色后掃描記錄。以β-actin作為內(nèi)參照，采用quantityone凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行半定量灰度分析，實驗重復3次，結(jié)果取平均灰度值；

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，myoz3蛋白在喉鱗癌組織中的表達水平顯著低于正常癌旁粘膜組織。

實施例4myoz3基因的過表達

1、細胞培養(yǎng)

人喉鱗癌細胞株hep2，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，細胞生長良好，呈單層貼壁生長。使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、轉(zhuǎn)染

1)轉(zhuǎn)染前細胞的處理

轉(zhuǎn)染前一天，6孔培養(yǎng)板上種3～5×10⁵個細胞/孔，在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，轉(zhuǎn)染時細胞密度為30～50％，于轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)基。

2)基因過表達載體的構(gòu)建

根據(jù)genebank中myoz3的序列合成特異的pcr擴增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ccgaagcttgccaccatgatccccaaggagcag-3’(seqidno.5)

反向引物：5’-cggctcgagcagctcctcggactctgggaggtt-3’(seqidno.6)

在5’端引物和3’端引物分別添加hindiii和xhoi兩個限制性酶切位點。以肺腺癌患者組織提取和反轉(zhuǎn)錄得到的cdna作為擴增模板，上述cdna序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶hindiii和xhoi雙酶切后插入到經(jīng)hindiii和xhoi雙酶切的真核細胞表達載體pcdna3.1中，連接獲得的重組載體pcdna3.1-1用于后續(xù)實驗。

3)轉(zhuǎn)染

將肺腺癌細胞分為3組，分別為對照組(hep2)、空白對照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.1-nc)、實驗組(轉(zhuǎn)染pcdna3.1-1)。使用脂質(zhì)體2000進行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說明書的指示進行。pcdna3.1空載體和pcdna3.1-1的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。

3、qpcr檢測myoz3基因的表達水平

1)細胞總rna的提取

采用qiagen的細胞rna提取試劑盒對細胞中的rna進行提取，實驗操作按照說明書進行。

2)逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

3)qpcr擴增步驟同實施例2。

4、westernblot檢測myoz3蛋白的表達水平

1)細胞總蛋白的提取

收集處于對數(shù)期的不同處理組的細胞，用預冷的pbs洗滌細胞。將ripa細胞裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，向細胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用細胞刮刀將裂解的細胞刮下來，使用移液器將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min。小心收集離心后的上清。

2)總蛋白濃度的測定

按照bca蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行蛋白濃度的測定。

3)sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進行電泳。

4)western檢測

步驟詳見實施例3。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染myoz3組中的myoz3過表達，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例5myoz3基因?qū)眵[癌細胞增殖的影響

采用mtt實驗檢測myoz3基因?qū)眵[癌細胞增殖能力影響。

1、取生長狀況良好的細胞，常規(guī)消化成單細胞懸液后，計數(shù)細胞，將細胞稀釋成合適濃度的細胞懸液；

2、于96孔培養(yǎng)板中，將稀釋后的不同處理組細胞每孔接種2000細胞，至少設(shè)3個平行孔，37℃、5％co2培養(yǎng)24h；

3、于接種后1、2、3、4、5天每天取出3孔細胞以mtt法檢測其490nm的od值，進行計數(shù)，計算平均值；

4、檢測前棄去上清液，培養(yǎng)液洗3次，每孔加入mtt無血清培養(yǎng)基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h；

5、終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μldmso，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀上用波長為490nm測定光密度(od)值，以時間為橫軸，光密度值為縱軸繪制細胞生長曲線。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與對照相比，實驗組細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，說明myoz3具有抑制細胞增殖的作用。

實施例6myoz3基因?qū)眵[癌細胞凋亡的影響

使用流式細胞儀檢測myoz3基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

3、步驟

1)將處于對數(shù)生長期的不同處理組的細胞經(jīng)胰酶消化后吹打成細胞懸液并計數(shù)。取10⁶量的細胞懸液，1000rpm離心5min；

2)棄上清，加入195μlannexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞；

3)加入5μl的annexinv-fitc，輕柔混勻，室溫下避光孵育10min；

4)1000rpm離心5min，棄上清，加入190μl的annexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞；

5)加入10μl碘化丙啶(pi)染色液，輕柔混勻，冰浴避光放置，進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，所有實驗均重復3次，結(jié)果取平均值。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖5所示，實驗組與對照組相比，細胞的凋亡率顯著升高，說明myoz3的過表達促進喉鱗癌細胞的凋亡(p<0.05)。

實施例7細胞劃痕實驗

1、向6孔板中每孔加入1ml50μg/ml的纖連蛋白，并置于4℃冰箱中過夜；

2、棄去剩余的纖連蛋白溶液，用無血清培養(yǎng)基清洗，將處于對數(shù)生長期的不同處理組細胞經(jīng)胰酶消化重懸后，接種于鋪有纖連蛋白的6孔板中，每組細胞設(shè)2個復孔，每孔5×10⁵個細胞；

3、置入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

4、待細胞長至約90％融合時，用10μl的tip頭劃出一條無細胞的細痕，pbs溶液洗去脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

5、分別于劃痕后0h、48h觀察細胞劃痕處的愈合情況并拍照。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖6所示，實驗組相比對照組而言，細胞體外劃痕后的遷移距離明顯降低，而對照組之間無顯著差異，說明myoz3過表達可以抑制喉癌細胞的遷移。

實施例8細胞侵襲實驗

1、transwell小室制備

將50mg/l的matrigel膠用4℃預冷的無血清培養(yǎng)基以1:8的比例稀釋、混勻，包被transwell小室的底部膜的上室面，4℃風干。取60μl～80μl稀釋的matrigel膠(3.9μg/μl)置于孔徑為8μm的transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被matrigel覆蓋，置于37℃30min使matrigel聚合成凝膠。

2、配置細胞懸液

將處于對數(shù)生長期的不同處理組的細胞經(jīng)胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細胞濃度為5×10⁴個/ml。

3、細胞接種

在transwell上室加入2ml的細胞懸液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)20-24h；取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細胞。

4、染色

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細胞，下室面用95％酒精固定15min后，蘇木素染色2min，倒置顯微鏡下隨機取5個高倍鏡視野觀察、計數(shù)并拍照。計數(shù)小室下室面的細胞數(shù)即為穿透matrigel膠的細胞數(shù)，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果，并以該細胞數(shù)代表腫瘤細胞的侵襲力，實驗重復3次，每組細胞設(shè)3個復孔。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，實驗組的細胞穿過transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數(shù)明顯減少，而對照組之間無明顯差異，結(jié)果說明myoz3過表達可以抑制喉鱗癌的侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

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<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>一種喉鱗癌的診斷標志物及其治療靶標

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