本發(fā)明涉及一種榛種質(zhì)鑒定的方法，尤其涉及一種利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法。

背景技術(shù)：

榛為榛科(corylaceae)榛屬(corylus)植物，在這些榛種中既包含有喬木類型也涵蓋灌木類型(張宇和等，2005)。世界榛屬植物約有20個(gè)種，廣泛地分布在北半球的亞洲、歐洲、北美洲的溫帶地區(qū)。我國榛屬植物資源豐富，我國天然分布的有8個(gè)種和2個(gè)變種，分布范圍也很廣泛，經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值較高。

20世紀(jì)50年代以來，我國榛屬植物的分類仍是完全依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行劃分，不同分類學(xué)家由于基于的形態(tài)尺度和依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)不同，因而分類結(jié)果不盡相同。尤其對于我國榛屬植物種與變種的劃分，分類學(xué)家們存在很多分歧。胡先嘯(1948)在撰寫的《中國樹木圖志》中首次提出中國榛屬植物應(yīng)屬于榛科(corylaceae)榛屬(corylus)，其中包括6個(gè)種2個(gè)變種。陳嶸(1975)在《中國樹木分類學(xué)》中認(rèn)為中國榛屬植物應(yīng)劃分成3個(gè)種和3個(gè)變種。俞德浚(1979)在《中國果樹分類學(xué)》中將中國榛屬植物劃分成4個(gè)種2個(gè)變種?！吨袊参镏尽?1979版)將我國榛屬植物劃分了7個(gè)種2個(gè)變種，并首次提及1個(gè)存疑種。鄭萬鈞(1985)在《中國樹木志》中介紹中國榛屬植物包含7個(gè)種和3個(gè)變種。梁維堅(jiān)(1988，2005)認(rèn)為川榛應(yīng)是一個(gè)獨(dú)立的種，并認(rèn)定了具有典型短柄特征的川榛變種短柄川榛。由此可見，植物分類學(xué)家對我國榛屬植物的分類存在很多爭議，對榛屬植物資源種類記載不一，分類地位不明確，這對我國榛屬植物資源的收集、保存及利用造成一定的影響，進(jìn)而影響榛屬植物雜交育種工作的開展。

葉綠體基因組(cpdna)相當(dāng)保守，而且有獨(dú)立的進(jìn)化路線，不依賴其他任何數(shù)據(jù)即可構(gòu)建分子進(jìn)化樹，可在較低的分類階元上(如種間)解決植物分類鑒別問題。這克服了傳統(tǒng)研究方法的弱點(diǎn)，提高了植物種質(zhì)資源鑒別的水平。

現(xiàn)有技術(shù)一：

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是以植物的表型性狀為遺傳標(biāo)記，目前的榛屬植物分類主要依靠形態(tài)學(xué)的研究，依賴于表型的差異。從遺傳角度看，表型性狀分為數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀兩類。但是表型性狀受環(huán)境、氣候、營養(yǎng)狀況等多種因素影響，往往提供的信息不夠全面，且依據(jù)形態(tài)進(jìn)行鑒別分類工作量大、周期長、成本高。例如：川榛和平榛兩者在樹形、葉片、花序及果實(shí)形態(tài)上非常相似，不易區(qū)分，尤其是在兩者交叉分布地帶經(jīng)常混淆，給科研調(diào)查和生產(chǎn)利用帶來了很大困擾。又如，虎榛子屬的虎榛子和榛屬的毛榛在表型上也非常相近，不易區(qū)分。

現(xiàn)有技術(shù)二：

隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展，像rflp標(biāo)記(restrictionfragmentlengthpolymorphism)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性rapd(randomamplificationpolymorphismdna)、簡單重復(fù)序列ssr(simplesequencerepeats)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性aflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、序列標(biāo)簽位點(diǎn)sts(sequence-taggedsite)等，用于木本植物的分類鑒別中。但這些分子標(biāo)記方法都有一定的缺陷，如rflp標(biāo)記操作繁瑣，技術(shù)要求高，價(jià)格也較高；rapd標(biāo)記分析的結(jié)果并不是非常準(zhǔn)確；snp標(biāo)記信息位點(diǎn)有限，成本昂貴等。

上述標(biāo)記大多是基于無全基因組序列信息的技術(shù)開發(fā)出來，有一定的應(yīng)用價(jià)值，但隨機(jī)性強(qiáng)、穩(wěn)定性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法，利用以下3對葉綠體cpdna引物對標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用3對引物對待鑒定的目標(biāo)種質(zhì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將得到的目標(biāo)種質(zhì)的擴(kuò)增序列與標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)的擴(kuò)增序列進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果是否一致進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定；

所述3對葉綠體cpdna引物包括：

第一對：正向引物：5'-ggcgatcagttggacctttg-3'；

反向引物：5'-ttggtagcgcgtttgttttg-3'；

第二對：正向引物：5'-gctacatccgcccctatact-3'；

反向引物：5'-ccctctagacttagctgctgt-3'；

第三對：正向引物：5'-gccagtaatacctgtgctattt-3'；

反向引物：5'-tattcttcacgtccaggattac-3'。

由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法，利用的cpdna序列標(biāo)記鑒別能力強(qiáng)、重復(fù)性好，能夠有效的鑒別易混淆榛種質(zhì)資源或其他屬植物，對我國榛屬植物資源的種間分類、親緣關(guān)系分析及遺傳進(jìn)化分析提供了重要的技術(shù)支撐，同時(shí)對我國開展榛屬植物野生資源調(diào)查選優(yōu)及雜交育種具有重大的意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中不同榛種的cpdna序列差異圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中不同榛種種質(zhì)的聚類圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法，其較佳的具體實(shí)施方式是：

利用以下3對葉綠體cpdna引物對標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用3對引物對待鑒定的目標(biāo)種質(zhì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將得到的目標(biāo)種質(zhì)的擴(kuò)增序列與標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)的擴(kuò)增序列進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果是否一致進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定；

所述3對葉綠體cpdna引物包括：

第一對：正向引物：5'-ggcgatcagttggacctttg-3'；

反向引物：5'-ttggtagcgcgtttgttttg-3'；

第二對：正向引物：5'-gctacatccgcccctatact-3'；

反向引物：5'-ccctctagacttagctgctgt-3'；

第三對：正向引物：5'-gccagtaatacctgtgctattt-3'；

反向引物：5'-tattcttcacgtccaggattac-3'。

所述利用3對葉綠體cpdna引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增步驟前，還需要提取標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)和目標(biāo)種質(zhì)的全基因組dna。

所述提取標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)和目標(biāo)種質(zhì)的全基因組dna包括如下步驟：

步驟1、在65℃水浴鍋中預(yù)熱2％ctab提取液和2％β-疏基乙醇；

步驟2、取0.2克葉片，加入液氮充分研磨，然后迅速轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，加入預(yù)熱的ctab提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min輕輕顛倒混勻；

步驟3、水浴結(jié)束后，取出離心管冷卻至室溫；13000rpm條件下離心5min，取上清液800μl轉(zhuǎn)入新離心管；

步驟4、加入800μl氯仿/異戊醇(v:v＝24∶1)，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入2ml新離心管；

步驟5、重復(fù)步驟4，加入等體積氯仿/異戊醇(v:v＝24∶1)，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入2ml新離心管；

步驟6、加入上清液2/3體積的異丙醇和1/10體積的3mnaac,輕輕顛倒混勻，靜置15min至產(chǎn)生絮狀沉淀；

步驟7、12000rpm條件下離心6min后棄上清液，將底部白色dna沉淀小心取出，轉(zhuǎn)入1.5ml新的離心管中，用1000μl70％的乙醇洗滌兩次，每次13000rpm離心6min，棄乙醇，超凈工作臺(tái)風(fēng)干殘留的酒精；

步驟8、提取產(chǎn)物用100μlte緩沖液溶解，取2～3μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?/p>

(1)94℃預(yù)變性4min；

(2)94℃30s，60℃30s，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；

(3)94℃30s，50℃30s，72℃2min，26個(gè)循環(huán)；

(4)72℃延伸10min；

(5)4℃保存。

本發(fā)明的利用cpdna序列進(jìn)行榛種質(zhì)鑒定的方法，利用的cpdna序列標(biāo)記鑒別能力強(qiáng)、重復(fù)性好，能夠有效的鑒別易混淆榛種質(zhì)資源或其他屬植物，對我國榛屬植物資源的種間分類、親緣關(guān)系分析及遺傳進(jìn)化分析提供了重要的技術(shù)支撐，同時(shí)對我國開展榛屬植物野生資源調(diào)查選優(yōu)及雜交育種具有重大的意義。本發(fā)明可以利用所述榛cpdna序列的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增分析。

本發(fā)明根據(jù)通用引物，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到榛屬植物cpdna序列，擴(kuò)增得到序列后通過比對分析，以確定得到的序列為cpdna序列，然后設(shè)計(jì)引物以我國榛屬植物不同種為材料進(jìn)行pcr擴(kuò)增，純化和測序，篩選得到3對(irfidno:a/b、irfidno:c/d和irfidno:e/f)可用于鑒別不同榛種植物的特異引物，所述特異引物可以有效鑒別混淆未知材料為何種榛種或鑒定為非榛屬植物。該方法具有操作簡單、重復(fù)性好、高效的特點(diǎn)，對我國榛屬植物資源的種間分類、親緣關(guān)系分析及遺傳進(jìn)化分析提供了重要的技術(shù)支撐，同時(shí)對我國開展榛屬植物野生資源調(diào)查選優(yōu)及雜交育種具有重大的意義。

具體應(yīng)用中，利用本發(fā)明獲得的cpdna序列可以設(shè)計(jì)不同于本發(fā)明irfidno:a/b、irfidno:c/d或irfidno:e/f的引物或兼并引物，或利用相關(guān)cpdna序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行榛屬植物不同種的擴(kuò)增以獲得cpdna序列進(jìn)行鑒別分析。

具體實(shí)施例：

第一實(shí)施例，榛屬植物材料的獲得：

根據(jù)實(shí)際調(diào)查從我國不同地域采集14份榛屬植物材料，14份標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)材料信息如表1所示。從陜西太白縣采集1份待鑒別榛屬植物材料a。陜西秦嶺山脈位于川榛和平榛的交叉分布區(qū)域，根據(jù)文獻(xiàn)記載平榛和川榛在這一區(qū)域都有分布，依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)無法準(zhǔn)確的鑒別待鑒別材料為何種榛屬植物。另外，還有1份材料采自內(nèi)蒙赤峰，其形態(tài)與毛榛以及虎榛相似，為待鑒別材料b。

表114個(gè)榛屬植物材料的具體信息

第二實(shí)施例，榛屬植物材料基因組dna的提?。?/p>

采用優(yōu)化后的ctab法從上述16份材料樣品中提取全基因組dna，具體方法如下：

步驟201、在65℃水浴鍋中預(yù)熱2％ctab提取液和2％β-疏基乙醇；

步驟202、取0.2克葉片，加入液氮充分研磨，然后迅速轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，加入預(yù)熱的ctab提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min輕輕顛倒混勻；

步驟203、水浴結(jié)束后，取出離心管冷卻至室溫；13000rpm條件下離心5min，取上清液800μl轉(zhuǎn)入新離心管；

步驟204、加入800μl氯仿/異戊醇(v:v＝24∶1)，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入2ml新離心管；

步驟205、重復(fù)步驟204，加入等體積氯仿/異戊醇(v:v＝24∶1)，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入2ml新離心管；

步驟206、加入上清液2/3體積的異丙醇和1/10體積的3mnaac,輕輕顛倒混勻，靜置15min至產(chǎn)生絮狀沉淀；

步驟207、12000rpm條件下離心6min后棄上清液，將底部白色dna沉淀小心取出，轉(zhuǎn)入1.5ml新的離心管中，用1000μl70％的乙醇洗滌兩次，每次13000rpm離心6min，棄乙醇，超凈工作臺(tái)風(fēng)干殘留的酒精；

步驟208、提取產(chǎn)物用100μlte緩沖液溶解，取2～3μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第三實(shí)施例，引物的篩選：

1、獲得目的基因片段

以具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)平榛材料dna為模板，參考petg-trnp(muetal,2006)、trnh-psba(hamiltonetal,1999)、psbk-psbi(zhangetal,2014)等的cpdna序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，測序后分別得到467bp、524bp、422bp的基因片段。

2、篩選引物

根據(jù)上述3個(gè)基因片段分別設(shè)計(jì)引物，以14份榛屬植物標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)dna為模板，按照下述體系(如表2所示)和程序(如表3所示)進(jìn)行pcr擴(kuò)增：

表2、pcr反應(yīng)體系

表3、pcr擴(kuò)增程序

上述方法獲得的pcr產(chǎn)物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠含有g(shù)elred染料。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄電泳條帶。利用膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純化pcr產(chǎn)物，然后在abi3730xl測序儀上進(jìn)行雙向測序。

通過上述pcr擴(kuò)增和測序，最終篩選出3對可用于鑒別我國不同榛種資源的特異性引物。引物信息如下：

irfidno:a：正向引物：5'-ggcgatcagttggacctttg-3'；

irfidno:b：反向引物：5'-ttggtagcgcgtttgttttg-3'；

irfidno:c：正向引物：5'-gctacatccgcccctatact-3'；

irfidno:d：反向引物：5'-ccctctagacttagctgctgt-3'；

irfidno:e：正向引物：5'-gccagtaatacctgtgctattt-3'；

irfidno:f：反向引物：5'-tattcttcacgtccaggattac-3'。

第四實(shí)施例，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：

利用第三實(shí)施例中所述方法和篩選得到的3對引物對14份榛屬植物材料和2份待檢測植物材料(a和b)進(jìn)行pcr擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及測序。

對14份榛屬植物材料和2份待檢測植物材料(a和b)的測序序列使用contig-express(version9.1)校對后，使用clustalx(version2.11)進(jìn)行多序列比對。序列對齊后，將序列聯(lián)合起來，利用mega(version5.0)軟件的最大似然法(maximumlikelihood)建立最似然樹。

圖1結(jié)果表明：不同榛種的序列差異明顯，通過序列差異可以清楚的分辨不同種材料。并且不同地域的相同種榛子材料在序列上無差異，如3個(gè)不同地域的毛榛材料序列無差異，2個(gè)不同地域的平榛材料序列無差異。待檢測材料a與川榛序列一致無差異。本方法高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高。

圖2結(jié)果表明：待檢測材料a與榛屬植物的川榛和短柄川榛聚到一起，待檢測材料b與所有榛屬植物距離較遠(yuǎn)，包括形態(tài)相似的毛榛。

經(jīng)上述方法鑒定，待檢測材料a與川榛(編號(hào)9)序列一致，且與川榛聚類到一起，鑒定其為榛屬植物的川榛；待檢測材料b與毛榛及其他榛屬植物種質(zhì)相距較遠(yuǎn)，鑒別其為虎榛子屬材料。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。