本發(fā)明涉及疾病診斷治療領(lǐng)域，具體的涉及心肌梗死生物標志物mir-1283，更具體的涉及mir-1283及其靶基因在診治心肌梗死中的應用。
背景技術(shù)：
：急性心肌梗死(ami)是最嚴重的一種心血管疾病，早期、準確的診斷可以保證再灌注治療的立即開始可能減少死亡率。一些生物標志物如心肌肌鈣蛋白i已應用與診斷ami，可提高目前診斷，為急性心肌梗死的新方法。然而，mirna在急性心肌梗死的表達和可能的作用是研究較少，以往的研究表明mir-30a是與心肌肥厚相關(guān)，mir-195的靶基因調(diào)節(jié)細胞凋亡，細胞增殖和細胞周期，他們可作為診斷急性心肌梗死生物標志物的潛在臨床價值，但是這些還遠遠不夠，臨床的精準診斷和治療需要更多候選分子標志物?，F(xiàn)有研究顯示mir-1283的前體與hbv相關(guān)肝癌的易感性顯著相關(guān)(mirna-snps的遺傳關(guān)聯(lián)研究以及肝癌的整合生物學研究，2011博士論文，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院)，此外，mir-1283在非結(jié)核分枝桿菌感染者血漿中低表達，是潛在的用以鑒別結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染的分子標志物(結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌感染者血漿中差異表達micrornas篩選，現(xiàn)代預防醫(yī)學，2016)。本發(fā)明基于高通量測序方法，獲得心肌梗死m(xù)irna和mrna的表達數(shù)據(jù)，同時，結(jié)合geo數(shù)據(jù)庫中心肌梗死相關(guān)mirna和mrna數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析驗證，從候選的mirna和mrna中挑選出mir-1283及其靶基因進行分子生物學驗證，結(jié)果顯示，mir-1283及其靶基因與心肌梗死密切相關(guān)?？捎糜谛募」Ｋ赖呐R床診斷及預防檢測，為臨床上相關(guān)診斷試劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：檢測mir-1283的制劑在制備診斷心肌梗死試劑中的應用。所述mir-1283的序列見序列表seqidno1。進一步，診斷心肌梗死試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測樣本中mir-1283。優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細胞術(shù)檢測樣本中mir-1283的轉(zhuǎn)錄。所述的樣本為外周血。優(yōu)選的，基于定量pcr方法包括特異性擴增mir-1283的引物，進一步優(yōu)選，特異性擴增mir-1283的引物序列為seqidno2；基于探針雜交方法包括與mir-1283的核酸序列雜交的探針。本發(fā)明的目的在于提供mir-1283的靶基因在制備診斷心肌梗死制劑中的應用。所述靶基因為diana-microt、microrna.org、mirdb、rna22-has、targetminer、targetscan-vert數(shù)據(jù)庫公開的mir-1283靶基因。優(yōu)選的，所述靶基因為hdac4、phc2、thoc5、il17ra。進一步，診斷心肌梗死試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測樣本mir-1283靶基因的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測方法檢測樣本中mir-1283靶基因的表達情況。優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細胞術(shù)檢測樣本中mir-1283靶基因的轉(zhuǎn)錄；采用elisa和/或膠體金試紙條檢測樣本中mir-1283靶基因的表達情況。本發(fā)明的目的在于提供上調(diào)mir-1283的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1283的活性的試劑在制備防治心肌梗死制劑中的應用。優(yōu)選的，采用基于rna的microrna功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性mirmimics技術(shù)上調(diào)mir-1283的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1283的活性。優(yōu)選人工合成短發(fā)夾rna或通過調(diào)控啟動子上調(diào)mir-1283。本發(fā)明的目的在于提供mir-1283的靶基因的抑制劑在制備防治心肌梗死制劑中的應用。本發(fā)明的目的在于提供一種心肌梗死診斷試劑，心肌梗死診斷試劑能夠檢測心肌梗死樣本中mir-1283的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測方法檢測心肌梗死樣本中mir-1283調(diào)控的靶基因的表達情況。進一步，心肌梗死診斷試劑包括檢測mirna調(diào)控的靶基因hdac4、phc2、thoc5、il17ra表達的特異性引物。本發(fā)明的目的在于提供上述防治心肌梗死的制劑在制備心肌梗死治療藥物或試劑中的應用。定義：現(xiàn)階段檢測mirna的表達水平的方法主要包括基于高通量測序技術(shù)、基于核苷酸雜交和基于pcr的mirna檢測方法?；谔结橂s交技術(shù)的mirna檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本rna進行預擴增，包括northern雜交方法、mirna表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細胞術(shù)等技術(shù)。(1)northern雜交又稱rna印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測真核生物rna大小，估計其豐度的實驗方法。基本原理如下：首先在載體(如硅片、微球或膜等)上固定mirna樣本，再與經(jīng)過標記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶mirna序列互補的dna探針，然后與經(jīng)過標記的樣本mirna雜交，再進行信號檢測。信號標記的方法包括同位素標記、熒光標記和納米金標記等。(2)mirna表達譜芯片原理同樣是使用標記探針檢測固相支持物上的目標分子。通過設(shè)計芯片上mirna基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應mirna的表達水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu)點，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又稱多功能懸浮點陣(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標記探針的球形基質(zhì)都帶有一個獨特的色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進行，檢測速度極快。(3)核酶保護分析技術(shù)(rpa)mirna的檢測還可以采用核酶保護分析技術(shù)，將標記好的探針和待測rna樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的rna和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護的rna分子，最后通過變性page電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基礎(chǔ)上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna與固定的dna探針雜交的方法。rake可以敏感特異地檢測mirna，適用于大量快速的篩選所有己知的mirna。能夠在特定的細胞和腫瘤中檢測mirna表達譜情況。不僅如此，rake法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出mirna并對其進行分析，為從存檔標本中分析mirna開啟了希望之門。(5)原位雜交(insituhybridization)原位雜交技術(shù)可直觀了解mirna表達方式，是觀測mirna時空表達的一種較簡便的方法，常標記方式包括地高辛、生物素、熒光標記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是當前應用較多的探針方式。(6)基于微球的流式細胞術(shù)(bead-basedflowcytometry)是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細胞檢測與芯片技術(shù)有機地結(jié)合起來，兼有通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點。(7)實時熒光定量pcr技術(shù)(real-timepcr，rt-pcr)熒光檢測pcr儀可對整個pcr過程中擴增序列的累積速率繪制動態(tài)變化曲線。在反應混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的pcr循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)ct來表達)越少。由于mirna長度僅為22nt，傳統(tǒng)的qrt-pcr不適合擴增如此短的片段。現(xiàn)今有幾種用于mirna的實時定量pcr方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種理想的mirna檢測qrt-pcr方法：首先設(shè)計特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測mirna為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，該cdna一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了cdna的長度，隨后以合成的cdna為模板設(shè)計引物進行實時定量pcr擴增。qrt-pcr具有特異性高、靈敏度好、快速簡單等多種優(yōu)點。(8)測序法大部分已知的mirna都是通過cdna克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建mirna的cdna文庫，再進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物隨后克隆到表達載體上測序。takada開發(fā)了一種改進的擴增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端連上接頭，然后用與接頭互補的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因為特定的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉(zhuǎn)錄出的cdna鏈的3’末端。當5’端接頭與cdna鏈的poly(c)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實現(xiàn)對cdna的pcr擴增。由于mrap高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中mirna的表達量。標簽序列克隆法是一種在在基因表達系列分析(sage)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個測序反應可檢測多個mirna，明顯提高了檢測效率。高通量測序(high-throughputsequencing)又稱下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有mirna的序列信息，解密mirna圖譜提供了保證。同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司(roche)的454測序儀(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因組分析儀(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid測序儀(abisolidsequencer)?；趓na的microrna功能獲得性技術(shù)即通過外源性補充mirnas合成的前體物質(zhì)來升高mirnas的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性mirna序列一致的短發(fā)夾樣rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做啟動子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細胞，被dicer酶修飾后載入risc發(fā)揮作用，相當于升高pre-mirna的水平，作用效果穩(wěn)定而持久?；蛱禺愋詍irmimics技術(shù)該技術(shù)避免了mirna與基因的非特異性作用。這種人工合成的與靶基因3’utr互補結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與mirna相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。mirna調(diào)控的主要方式有兩種：一種是與靶基因mrna的3’utr不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達；另一種是與sirna類似，當mirna與mrna完全互補配對時，ago2蛋白通過切割mrna直接導致其降解，實現(xiàn)基因沉默。總之，當前認為mirna以何種方式與目的基因作用和mirna與目的基因的配對程度有關(guān)。mirna與目的基因配對不完全時，mirna就以抑制目的基因的表達發(fā)揮作用；mirna與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導致基因沉默。附圖說明圖1是mir-1283診斷心肌梗死的roc曲線圖圖2是mir-1283相對表達情況圖圖3是hdac4、phc2、thoc5、il17ra基因相對表達情況圖具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。實施例1樣品的收集及總rna提取收集醫(yī)院2015年3月到2016年9月心肌梗死患者外周血及健康對照外周血各6例。急性心肌梗死診斷標準：根據(jù)2012年第三次《心肌梗死全球統(tǒng)一定義》推薦的診斷標準制定。檢測到心肌壞死標志物(主要是肌鈣蛋白)水平上升和/或下降，至少有1次超過參考值上限的第99％百分位值，并至少伴有下列一項缺血的癥狀。1)心肌缺血的癥狀；2)新發(fā)生的缺血性ecg改變；3)心電圖出現(xiàn)病理性q波；4)影像學證據(jù)顯示有新的心肌活性喪失或新發(fā)的局部室壁運動異常；5)冠狀動脈造影或尸檢發(fā)現(xiàn)冠狀動脈內(nèi)存在新鮮血栓。血液rna提取標準：rna純度：od260/280≧1.8，28s/18s≧1；rna完整性：rin值≧7.0。rna完整性檢測方法：agilent2100(rna6000nanokit)、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃度：1％瓊脂糖膠；電壓：5v/cm；時間：20min)。實施例2測序、數(shù)據(jù)分析及電子驗證測序：運用lluminahiseq2500/miseq第二代高通量測序技術(shù)對mirna和mrna進行測序，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對mirna和mrna測序原始數(shù)據(jù)進行背景校正后進行t-test得到p值，然后利用fisher檢驗合并p值，篩選差異表達mirna和mrna。利用包括miranda，mirdb，mirwalk及targetscan這些算法預測差異表達mirna的靶基因，選取≥4個算法預測出來的靶基因，并在mirwalk數(shù)據(jù)庫查找已驗證的差異表達的mirna的靶基因。最終從候選的差異表達mirna和mrna中挑選到mir-1283及其靶基因hdac4、phc2、thoc5、il17ra、進行后期實驗驗證。實施例3電子驗證電子驗證：從geo(geneexpressionomnibus)數(shù)據(jù)庫篩選得到3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)和2套mirna數(shù)據(jù)集(gse61741、gse31568)，3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)共有基因13680個，我們通過使用metama包采用合并p值法計算并合并效應值后得到612個(fdr<0.05)差異表達基因，其中上調(diào)352個，下調(diào)260個；2套數(shù)據(jù)集(gse24371,gse17498)共同mirna數(shù)目848個。使用r包metama對兩套mirna數(shù)據(jù)集進行合并p值分析，找到15個差異表達mirna(fdr<0.001&&|combined.es|>1)。結(jié)果顯示電子驗證結(jié)果與測序結(jié)果表達趨勢一致。對于單個mirna分子或是診斷模型的效能評價的方法為建立受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲線，通過計算曲線下面積(areaundercurve)來判斷診斷的能力。roc曲線下的面積值在1.0和0.5之間，在auc>0.5的情況下，auc越接近于1，說明診斷效果越好，auc在0.5-0.7時有較低準確性，auc在0.7-0.9時有一定準確性，auc在0.9以上時具有較高準確性。我們將利用gse31568數(shù)據(jù)集(包括70例對照組和20例病例組)，進而進行分析，結(jié)果顯示，mir-1283診斷心肌梗死的auc為0.886(見圖1)，顯示其準確率較高，表明mir-1283可以作為診斷心肌梗死的分子標志物。實施例4樣品的采集及總rna的提取1樣品采集：36例心肌梗死患者和22例健康對照人群外周血(采集時間2014年1月-2015年8月)。2總rna提?。合嚓P(guān)實驗物品的去rnase的處理：①將所有玻璃器皿應用前均用depc沖洗侵泡，120℃高壓20min，180℃高溫烤干2小時以上。②將塑料器皿(如：ep管/槍頭)使用前需用0.1％depc水侵泡過夜，后控干液體，120℃高壓20min，烤箱烤干備用。白細胞分離(1)取2m1抗凝外周血(采血時間不超過3h)；(2)加入等體積無菌pbs于外周血中充分混合，形成細胞懸液；(3)加入4m1淋巴細胞分離液于另一離心管；(4)吸取4m1細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面(注意勿與淋巴細胞分離液混合)。離心1500rpm20min；(5)用吸管輕輕吸出界面層(白膜)入另一離心管中。無菌冷pbs洗2次，最后1次洗滌可以將細胞懸液移入ep管中，離心去上清，用于提取rna。rna提取(1)從-80℃冰箱里取出樣本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入trizol于ep管中，進行勻漿處理，室溫靜置5-l0min；(2)每毫升trizol加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min，在4℃下12000轉(zhuǎn)離心15min；(3)小心吸出上清水相約600ul移入另一離心管(注意不要抽到蛋白層)，加入等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；(4)4℃12000g離心l0min，棄上清液，底部可見白色物質(zhì)；(5)加入lml75％冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇；(6)4℃12000g離心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1depc水溶解rna。取3u1rna樣本，于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳；lu1rna樣品于紫外分光光度計檢測濃度，以a260/280在1.8-2.0視為rna樣本合格。實施例5rt-pcr檢測mir-1283及hdac4、phc2、thoc5、il17ra的表達情況1rt-pcr檢測mir-1283的表達逆轉(zhuǎn)錄rt體系的配制：1μg總rna作為模板rna；5×miscripthispecbuffer4μl；10×nucleicsmix2μl；miscriptreversetranscriptasemix2μl；滅菌水補平至20μl。abi9700型pcr儀上37℃保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應完全后，95℃5min終止反應。加入80μlnuclease-freeh2o稀釋至100μl儲存在-20℃冰箱備用。熒光定量pcrmirna的rt-pcr體系的配制：反應體系：mirnas的表達檢測每次設(shè)置3個平行管反應，以snrnau6作為內(nèi)參。擴增程序：95℃10min；40個循環(huán)(95℃10s，60℃30s)。2rt-pcr檢測靶基因hdac4、phc2、thoc5、il17ra的表達逆轉(zhuǎn)錄采用iiireversetranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cdna反轉(zhuǎn)錄。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總rna進行逆反錄合成cdna。rt體系的配制：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μl，10mmol/ldntp1.25μl，0.1mmol/ldtt2.5μl，30μmmol/loligodt2μl,200u/μlmmlv1.25μl，模板rna1μg，加入滅菌水至總體系25μl。42℃孵育1小時，72℃10分鐘，短暫離心。cdna保存放-20℃冰箱備用rna。熒光定量pcr根據(jù)genbank提供的序列hdac4(nm_006037.3)、phc2(nm_001330488.1)、thoc5(nm_001002877.1)、il17ra(nm_001289905.1)設(shè)計引物，送公司進行合成。mrna的rt-pcr體系的配制：組分加入量2×mix10μl上游引物10um0.5μl下游引物10um0.5μl模板2μl加入滅菌蒸餾水至25μl反應體系：用powergreenpcrmastermix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，內(nèi)參選gapdh，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃10min，(95℃15s，55℃60s)×35個循環(huán)。3統(tǒng)計學分析實時定量pcr樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；根據(jù)qrt-pcr的相對定量公式計算實驗組與對照組目的基因表達的倍數(shù)關(guān)系，比較mir-1283在心肌梗死組和對照組中的表達水平。結(jié)果顯示：mir-1283在患病組的表達量為對照組的約0.3倍，hdac4、phc2、thoc5、il17ra在患病組的表達量為對照組的2.6倍、2.3倍、2.2倍和2.5倍，以上結(jié)果驗證了高通量測序數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。實施例6心肌細胞的培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染一、材料準備：人原代心肌細胞(humancardiacmyocytes，hcm)購自美國sciencell公司，培養(yǎng)于專用的心肌細胞培養(yǎng)基。lipofectaminetm2000transfectionreagent(invitrogen)。mir-1283序列發(fā)給合成公司，請其化學合成mir-1283mimics、mir-1283inhibitor及其非特異性對照。二、實驗方法1mirna瞬時轉(zhuǎn)染操作按lipofectaminetm2000試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染前24h將生長狀態(tài)良好的hcm細胞接種到6孔板中，細胞計數(shù)約為4×105/l，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當天，細胞融合度為70-80％時進行實驗。將100nmmir-1283mimics/mir1283inhibitor加入到250μlopti-mem培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用250μlopti-mem培養(yǎng)基稀釋5μllipofectaminetm2000脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合opti-mem-脂質(zhì)體與opti-mem-mirnas，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復合物：然后將上述混合物加到細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，培養(yǎng)6h后更換完全培養(yǎng)基。其中，非特異性的mimicsnegativecontrol(mimicsnc)和inhibitornegativecontrol(inhibitornc)序列作為對照。培養(yǎng)24-48h后抽提細胞總rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna，實時定量pcr檢測瞬時轉(zhuǎn)染后mir-1283表達的改變。2實驗結(jié)果采用陽離子脂質(zhì)體法進行瞬時轉(zhuǎn)染，分別將mir-1283mimics或mir-1283inhibitor及相應對照序列negativecontrol(nc)轉(zhuǎn)染心肌細胞株hcm。轉(zhuǎn)染48h后，抽提細胞總rna。以u6為內(nèi)對照，實時定量pcr檢測mir-1283的表達。結(jié)果顯示：與對照組相比，hcm轉(zhuǎn)染mir-1283mimics后，mir-1283的表達增高了約3.8倍；轉(zhuǎn)染mir-1283inhibitor后，表達下降了近59％。以上結(jié)果表明，通過瞬時轉(zhuǎn)染mir-1283mimics和mir-1283inhibitor可有效上調(diào)或下調(diào)mir-1283的表達，結(jié)果可靠可進行后續(xù)實驗。實施例6轉(zhuǎn)染mir-1283對人心肌細胞hdac4、phc2、thoc5、il17ra基因表達的影響將瞬時轉(zhuǎn)染mir-1283mimics或mir-1283inhibitor及相應對照序列negativecontrol(nc)后的hcm細胞接種到96孔板中，轉(zhuǎn)染48h后，抽提細胞總rna。以gapdh為內(nèi)對照，實時定量pcr檢測hdac4、phc2、thoc5、il17ra的表達。結(jié)果顯示：與對照組相比，hcm轉(zhuǎn)染mir-1283mimics后，hdac4、phc2、thoc5、il17ra的表達量分別降低約19％、16％、13％和15％，轉(zhuǎn)染mir-1283inhibitor后，hdac4、phc2、thoc5、il17ra的表達量分別上升約17％、13％、10％和11％，初步證明mir-1283和hdac4、phc2、thoc5、il17ra的靶向關(guān)系。雖然已參考各種優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進行各種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進行許多改動來使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導而不背離其基本范圍。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>心肌梗死生物標志物mir-1283<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>rna<213>人工序列<400>1ucuacaaaggaaagcgcuuucu22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2tctacaaaggaaagcgctttct22<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3ttcaccgaccaatgatat18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4ttacaccacaagataacac19<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ctgttgatgtgaagaagg18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6attgctgctaggaagatt18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7gtgaggtgttcagcatta18<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8ggaaggtgatgaagatgac19<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9gctattaggtattgctctc19<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<400>10atccatattgttgccatt18當前第1頁12