本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，涉及一種兒童i型糖尿病的診斷工具，還涉及血液中rnf38基因在制備兒童i型糖尿病診斷工具中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：i型糖尿病(t1dm)為在遺傳基礎(chǔ)上由環(huán)境因素激發(fā)的、自身免疫介導(dǎo)的以胰腺β細(xì)胞受損為特征的自身免疫性疾病，是一種由于胰島素缺乏或作用不足引起的能量代謝疾病。通常在兒童、少年、青年時(shí)期被診斷，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高的年齡段是10-14歲，青少年以后，發(fā)病率下降。兒童i型糖尿病以往多指小于15歲發(fā)生的糖尿病，由于who(世界衛(wèi)生組織)已經(jīng)兒童定義為0-18歲，因此兒童糖尿病應(yīng)指小于18歲發(fā)生的糖尿病。兒童1型糖尿病的臨床表現(xiàn)為多尿、多飲、多食及消瘦。兒童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病較急，不易早期發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞的功能可出現(xiàn)明顯下降甚至發(fā)展為衰竭，早期并發(fā)癥即可出現(xiàn)，如糖尿病酮癥甚至酸中毒，如處理不及時(shí)或不當(dāng)，可能危及生命。i型糖尿病確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是遺傳、免疫和環(huán)境因素共同作用所致。高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughputsequencing)是指能夠一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條dna分子進(jìn)行序列測(cè)定，每一次序列測(cè)定的讀長(zhǎng)一般較短的測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性變革，隨著2005年羅氏的454測(cè)序儀及2006年solexa測(cè)序儀出現(xiàn)后飛速發(fā)展，2009年左右高通量測(cè)序技術(shù)在國(guó)內(nèi)興起。高通量測(cè)序類(lèi)型分為多種，基因芯片、基因深度測(cè)序(genomere-sequencing)、轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序(transcriptomere-sequencing又稱(chēng)rna-seq)等。細(xì)胞的功能是從基因的表達(dá)開(kāi)始的，轉(zhuǎn)錄組是指某一時(shí)間細(xì)胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的rna總稱(chēng)。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)可獲得基因表達(dá)的rna水平有關(guān)信息，可以揭示基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，為兒童i型糖尿病發(fā)病機(jī)理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也為兒童i型糖尿病的進(jìn)一步治療方案提供嶄新思路。深入研究?jī)和痠型糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，有助于了解兒童i型糖尿病的遺傳分子機(jī)制，為尋找新的藥物提供理論依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)基因在兒童i型糖尿病患者的血液中的含量比正常人低很多，rnf38基因的差異表達(dá)可作為診斷兒童i型糖尿病的一種方法，據(jù)此可以開(kāi)發(fā)診斷兒童i型糖尿病的工具。具體的，本發(fā)明提供了檢測(cè)rnf38基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷兒童i型糖尿病的工具中的應(yīng)用。進(jìn)一步，上面所提到的檢測(cè)產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)rnf38基因的表達(dá)水平以診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品。進(jìn)一步，所述用rt-pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增rnf38基因的引物；所述用實(shí)時(shí)熒光定量pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增rnf38基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括：與rnf38蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括：與rnf38基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與rnf38蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與rnf38基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)熒光定量pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增rnf38基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，檢測(cè)rnf38基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)rnf38基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知rnf38基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于rnf38基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病的工具，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)rnf38基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)rnf38基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的rnf38蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括rnf38基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與兒童i型糖尿病相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括rnf38蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與兒童i型糖尿病相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與兒童i型糖尿病的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高兒童i型糖尿病診斷的準(zhǔn)確率。其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)rnf38基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括rnf38蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)rnf38基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選的，所述試劑包括針對(duì)rnf38基因的引物和/或探針。根據(jù)rnf38基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)rnf38基因表達(dá)水平的引物和探針。所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)rnf38基因表達(dá)水平的試劑。所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè)rnf38基因的轉(zhuǎn)錄水平。與rnf38基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。進(jìn)一步，所述rnf38蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述rnf38蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與rnf38蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)rnf38基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。用于診斷兒童i型糖尿病的rnf38基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源包括但不限于血液、組織液、尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷兒童i型糖尿病的rnf38基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源是血液。在發(fā)明的具體實(shí)施方案中，血液是取自兒童i型糖尿病患者和正常兒童的血液。本發(fā)明的rnf38基因(nc_000009.12(36336398..36487384)的具體序列可在國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)genebank中查詢到。本發(fā)明的“rnf38基因”包括上述rnf38基因及其功能等同物，所述功能等同物是指與rnf38基因序列存在差異但是能夠編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的序列。本發(fā)明的“rnf38蛋白”的具體序列可在ncbi中查詢到。本發(fā)明的“rnf38蛋白”包括上述rnf38蛋白以及rnf38蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括rnf38蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與rnf38的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的“rnf38蛋白”還包括上述rnf38蛋白以及rnf38蛋白的任何功能等同物的修飾蛋白。通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是rnf38蛋白的融合蛋白。對(duì)于與rnf38蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留rnf38蛋白的生物學(xué)活性即可。本發(fā)明的rnf38蛋白也包括蛋白氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留rnf38蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。在本發(fā)明的上下文中，“診斷兒童i型糖尿病”既包括判斷兒童受試者是否已經(jīng)患有兒童i型糖尿病、也包括判斷兒童受試者是否存在患有兒童i型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，還包括預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病患者的預(yù)后，還包括判斷患有兒童i型糖尿病的患者在經(jīng)過(guò)治療后是否已經(jīng)復(fù)發(fā)。附圖說(shuō)明圖1顯示利用免疫印跡檢測(cè)rnf38蛋白在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達(dá)差異。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1篩選兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因1、臨床對(duì)象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對(duì)照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無(wú)糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn)，入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。2、樣本采集與樣本rna提取兒童i型糖尿病和正常兒童在清晨空腹抽取靜脈血，使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進(jìn)行血液總rna的提取?；静襟E：(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；(2)加入氯仿幫助有機(jī)相和水相分層；(3)異丙醇沉淀rna；(4)漂洗rna沉淀；(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、rna濃度的檢測(cè)用雙蒸水將核酸蛋白定量檢測(cè)儀的rna檢測(cè)孔洗滌3遍，晾干，取1‰depc液作陰性對(duì)照，檢測(cè)本底。取rna溶液2μl，用98μl1‰depc液稀釋50倍，記錄相關(guān)的od260、od280值。rna濃度＝od260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。4、rna純度＝od260/od280，rna純度應(yīng)在1.8～2.0之間。當(dāng)rna純度符合要求時(shí)才可繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。5、rna的完整性檢測(cè)取rna樣品3μl，depc水補(bǔ)充至15μl，65℃變性10min，然后置于冰上，加入2μl10×rnaloadingbuffer，將甲醛變性瓊脂糖凝膠放入裝有mops緩沖液的電泳槽中，100v電泳約5min，將rna樣品點(diǎn)入點(diǎn)樣孔中，100v電泳，指示劑擴(kuò)散至凝膠的1/3處時(shí)拍照。凝膠掃描成像系統(tǒng)觀察見(jiàn)28s、18s條帶完整清晰，無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象?？捎糜谶M(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。6、組織rna的高密度人類(lèi)基因表達(dá)譜芯片分析依托博奧生物公司提供的基因芯片分析平臺(tái)的技術(shù)服務(wù)，選擇affx人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片(affxhumangenomeu133plus2.0array，affimetrix公司)，完成了血液樣本rna的基因芯片篩查分析，其工作原理及全部操作流程參照該公司常規(guī)的基因芯片分析方法，主要細(xì)節(jié)如下：(1)取以上人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片共18張，分別與18例血液rna進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)三次；(2)利用luxscan10ka雙通道激光掃描儀，對(duì)雜交后的基因芯片進(jìn)行掃描分析；(3)利用sam軟件，并以正常兒童為對(duì)照，對(duì)兒童i型糖尿病患者的芯片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，其稱(chēng)為聚類(lèi)分析(geneclusteranalysis)；(4)以兩倍異常絕對(duì)值差異作為量化比較的界限，獲得兒童i型糖尿病患者或正常兒童之間差異表達(dá)候選基因。通過(guò)以上雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)兒童i型糖尿病患者與正常兒童比較，有(2倍及以上)差異表達(dá)基因480種，其上調(diào)表達(dá)基因有321種，下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?59種。實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因1、臨床對(duì)象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者120例，其中男64例，女59例，年齡5-16歲(9.99士3.28)歲；正常對(duì)照組78例，其中男38例，女40例皆為健康體檢者，無(wú)糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16(10.51士3.25)歲，與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn)，入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。2、血液總rna提取使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進(jìn)行血液總rna的提取?；静襟E：(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；(2)加入氯仿幫助有機(jī)相和水相分層；(3)異丙醇沉淀rna；(4)漂洗rna沉淀；(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、逆轉(zhuǎn)錄用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。4、實(shí)時(shí)熒光定量pcr熒光定量pcr是在常規(guī)pcr基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的定量，隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行，pcr反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，都會(huì)收集到一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化來(lái)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線ct值均小于32，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。(1)熒光定量pcr反應(yīng)體系以上一步合成的互補(bǔ)dna(cdna)為模板進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μ1(表1)。表1反應(yīng)體系組分體積(μl)sybrpremixextaqll(2x)10pcr上游引物(10μm)2pcr下游引物(10μm)2dna模板2rnasefreedh2o20引物序列：rnf38基因的正向引物序列為5’-tagaagatggagaagtag-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-gataagaaggaagttgtt-3’(seqidno.2)；擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。(2)反應(yīng)條件啟動(dòng)lightcyder1.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，預(yù)熱后將pcr反應(yīng)毛細(xì)管放入pcr儀中，反應(yīng)條件如表2所示。65℃至95℃繪制融解曲線。表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)條件5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果采用美國(guó)abi公司sds2.4軟件進(jìn)行分析，具體采用comparativedelta-deltact法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是只需對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行pcr即可，無(wú)需分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用spss19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值變量以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量中兒童i型糖尿病患者樣本與正常兒童樣本的結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。6、結(jié)果采用2-△△ct相對(duì)定量法，以正常兒童組的mrna相對(duì)表達(dá)水平為1，兒童i型糖尿病組rnf38基因mrna水平為0.35±0.17，顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)施例3免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)基因的表達(dá)產(chǎn)物1、臨床對(duì)象：同實(shí)施例2。2、單核細(xì)胞分離兒童i型糖尿病患者和正常兒童取靜脈血10ml，注入盛肝素的無(wú)菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無(wú)菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水)，以降低紅細(xì)胞的凝聚。吸取8ml淋巴細(xì)胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細(xì)胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細(xì)胞團(tuán)塊混合1min，使殘余紅細(xì)胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后用hbss溶液調(diào)整細(xì)胞至1×106個(gè)/ml備用。3、單核細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取將上述實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞懸液(濃度為1×106個(gè)/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清后加入100μl裂解緩沖液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細(xì)胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、westernblot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白用brandford法定量，取適量與樣品緩沖液混合煮沸5min，冷卻5min；取30pg蛋白上樣到制備好的15％聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳，開(kāi)始設(shè)為80v恒壓，看見(jiàn)marker后增加至120v；將電泳后的膠取出，使用bio.rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于100v轉(zhuǎn)移50min；轉(zhuǎn)膜完畢后，用1xpbs洗一次，浸入封閉液，40c過(guò)夜；倒掉封閉液，加入western洗滌液洗滌5-10min，加入一抗搖床室溫雜交2h；按照適當(dāng)比例用western二抗稀釋液稀釋于封閉緩沖液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ecl試劑顯影、定影檢測(cè)蛋白表達(dá)。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、結(jié)果結(jié)果如圖1所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中rnf38蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>兒童i型糖尿病的診斷工具<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1tagaagatggagaagtag18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2gataagaaggaagttgtt18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tttaactctggtaaagtggatat23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggtggaatcatattggaaca20當(dāng)前第1頁(yè)12