專利名稱：：用于免疫診斷1型糖尿病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及自身免疫性1型糖尿病的診斷領(lǐng)域。更具體而言涉及使用源于多種自身抗原的組合物診斷自身免疫性1型糖尿病的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種因胰島素分泌絕對或相對不足而引起的以高血糖癥為主要特征的代謝性疾病，受多種遺傳和環(huán)境因素影響，這些因素可導(dǎo)致機體不能對碳水化合物、脂肪和蛋白有效利用。糖尿病危害巨大，主要是其嚴重的并發(fā)癥和高死亡率。隨著糖尿病得病時間的延長，體內(nèi)代謝紊亂如得不到很好的控制，可導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、血管、心臟等組織、器官的慢性并發(fā)癥，以致最終發(fā)生失明、下肢壞疽、尿毒癥、腦中風(fēng)或心肌梗死，甚至危及生命。糖尿病人死亡率較非糖尿病人高11倍。全球每年死于此病的人數(shù)約為400萬，占全球總死亡人數(shù)的9%。目前，我國是糖尿病患者最多的三個國家(印度、中國、美國)之一，糖尿病患者數(shù)量已經(jīng)超過4000萬人。此外，尚有數(shù)千萬的糖調(diào)節(jié)功能受損者，此類人群成為糖尿病的龐大“后備軍團”。按照1997年美國糖尿病協(xié)會及1999年WHO關(guān)于糖尿病(diabetesmellitus,DM)分類及診斷建議標(biāo)準(zhǔn)，DM分為1型糖尿病(TlDM)、2型糖尿病(T2DM)、特殊類型糖尿病和妊娠糖尿病。TlDM包括自身免疫性(Ia)和特發(fā)性(Ib)兩大類。自身免疫性糖尿病主要由于胰島β細胞自身免疫性破壞，導(dǎo)致胰島素分泌的絕對不足引起，其特性表現(xiàn)為外周血中出現(xiàn)針對胰島β細胞相關(guān)分子的自身抗體。1型糖尿病的發(fā)病率每年以2.5%的速率增長，預(yù)測2010年的發(fā)病率將比1998年高出40%(AtkinsonMA等，TheLancet,358221-229(2001))。1型糖尿病的早期預(yù)防可分為三期一期是有1型糖尿病發(fā)病傾向高危人群，此時免疫學(xué)指標(biāo)尚未出現(xiàn)。二期是免疫破壞期，此時血清內(nèi)已有抗胰島細胞自身抗體出現(xiàn)，是1型糖尿病預(yù)防的關(guān)鍵時期。三期是1型糖尿病發(fā)病早期，此時已出現(xiàn)糖尿病癥狀。因此如何在免疫破壞期篩檢免疫學(xué)指標(biāo)，對于在非糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)1型糖尿病高危人群具有重大的意義。在1型糖尿病的免疫破壞期，患者體內(nèi)會產(chǎn)生多種針對胰島細胞自身抗原的自身抗體。自20世紀(jì)70年代以來，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種胰島自身抗體。例如在70年代，首次發(fā)現(xiàn)了胰島細胞抗體(ICA)和胰島細胞表面抗體(ICSA)。80-90年代，又相繼發(fā)現(xiàn)了胰島素抗體(IAA)、羧肽酶H抗體、熱休克蛋白抗體(HSP)、谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A、IA-2i3A、ICA69)等。進入21世紀(jì)，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白90自身抗體(hsp90)、胰島特異的葡萄糖-6-磷酸酶抗體(IGRP)、鋅轉(zhuǎn)運子ZnTS抗體(ZnTS)等。目前，1型糖尿病診斷中最為常用的診斷指標(biāo)包括ICA、IAA、GADA和IA-2A。胰島細胞抗體(ICA)是胰島β細胞的胞漿抗體，屬免疫球蛋白，對胰島細胞的胞漿成分產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)，為特異性抗體。ICA是一種混合抗體，為抗胰島β細胞所有抗體的總稱。有文獻報道ICA是與全部胰島細胞(如α、β、Υ、δ禾ΠPP細胞)反應(yīng)的多克隆自身抗體總稱。ICA識別的脂類和蛋白質(zhì)自身抗原可能包括唾液酸糖綴合物、GAD、IA-2等。大量研究表明，有70%1型糖尿病患者血清中存在ICA，且存在的時間很短，僅出現(xiàn)在胰島炎發(fā)生前無高血糖階段及1型糖尿病的初期，具有隨著發(fā)病年齡的延長而降低的特性。新發(fā)糖尿病，ICA陽性率為70-90%，ICA隨著診斷后逐漸降低，診斷出糖尿病10年后，ICA陽性率為5-10%。JensenR等(DiabetMed,241221-1228(2007))的研究發(fā)現(xiàn)ICA陽性的1型糖尿病患者初診后的6年中，ICA陽性率以每年24%的比率下降，而且平均ICA水平也逐年下降。ICA常常通過運用人、猴或嚙齒類胰腺切片進行間接免疫熒光檢測。該方法發(fā)明于1974年，目前仍然在使用。但由于該方法是檢測混合抗體且方法繁瑣，受到一定限制，將來應(yīng)該有可能被更特異的檢測指標(biāo)和更簡單的檢測方法所取代。胰島素是第一個報道的胰島自身抗原和β細胞特異自身抗原。但檢測胰島素自身抗體(IAA)應(yīng)在施用外源胰島素(動物胰島素或人胰島素)之前，因為使用外源胰島素治療5-7天后就會產(chǎn)生胰島素抗體(BarkerJM等，Diabetologia，50=1603-1606(2007))免疫沉淀試驗證明胰島素自身抗體不能區(qū)別自發(fā)自身抗體和免疫應(yīng)答抗體(外源胰島素治療產(chǎn)生的抗體)。此外，在一些其它自身免疫性疾病(包括自身免疫性甲狀腺疾病)中也存在IAA。1型糖尿病初期，IAA在兒童中最早出現(xiàn)存在，而在成人中則降低。在小于5歲的兒童中，90%的孩子存在IAA；5-10歲的的兒童中，70%存在IAA；而10-15歲的的兒童中，則只有50%存在IAA;在成人中，研究結(jié)果一般都以低于40%(AchenbachP等，JClinInvest,114(4):589_597(2004))，在池蓮祥等(中國實驗診斷學(xué)，9:406_408(2005))研究結(jié)果中僅為6.67%，而且IAA檢測易受到胰島素治療誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素抗體的影響，因此單獨診斷價值不高。人體內(nèi)有多種形式的胰島素可能會與免疫系統(tǒng)相互作用，免疫原性最強的分子可能是胰島素原和前胰島素原。IAA表位定位于胰島素的B鏈。目前，免疫診斷用胰島素診斷IAA多用放射性免疫熒光測定法(RIA)，個別實驗室采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法進行測定。谷氨酸脫羧酶(GAD)是催化谷氨酸脫羧生成Y-氨基丁酸的酶，由分泌Y_氨基丁酸的神經(jīng)細胞和非神經(jīng)組織如胰腺的胰島β細胞合成的酶。哺乳類動物中GAD有兩種異形體，即GAD65和GAD67，分子量分別為65kD和67kD。兩種蛋白質(zhì)由不同的基因編碼，具有64%的氨基酸同一性。GAD除了在腦內(nèi)表達外，在胰島細胞的表達量也可觀。人類成熟胰島中GAD65表達量大于GAD67，二者在β細胞內(nèi)含量豐富，且在α細胞內(nèi)也可檢測到。GAD67和GAD65盡管有高度同源性，但是大多數(shù)TlDM病人中的自身抗體反應(yīng)局限于GAD65特異性表位，只有11%18%的病人具有與GAD67共同的表位，沒有僅對GAD67反應(yīng)的抗體。因此，GAD67不是TlDM中的獨立抗原。GAD65抗體可能是具有共同特性的一組抗體，而不是單一抗體。絕大多數(shù)抗體識別GAD65構(gòu)象表位，不與變性蛋白質(zhì)反應(yīng)，所以構(gòu)象上的完整性對于GADA檢測試劑盒非常關(guān)鍵。已確定的GAD65表位包括氨基端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域，并證明后二者占主導(dǎo)地位。GADA是繼IAA抗體之后出現(xiàn)的自身抗體，12歲以后發(fā)病的兒童主要存在GADA，而且，GADA可能是成人隱匿性1型糖尿病的主要免疫標(biāo)記物(PalmerJP等，Diabetes,54Suppl2:S62-67(2005))。GADA在1型糖尿病發(fā)病前期和發(fā)病時的陽性率一般很高為60%_80%，而在2型糖尿病中僅為3.2%。初診1型糖尿病患者體內(nèi)GADA陽性比率會以每年9%的比率下降，但抗體水平維持不變，因此GADA是檢測非常有用的自身抗體。GADA檢測多采用使用重組人GAD65的放射性配體結(jié)合試驗(RBA)或RIA方法，少數(shù)采用ELISA方法。但最近VillalbaA等(Autoimmunity，41143-153(2008))發(fā)現(xiàn)共聚焦間接免疫熒光(confocalIIF)比RBA等方法具有更高的敏感性。胰島細胞瘤相關(guān)蛋白-2(IA-2)是受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)超家族中的一員，全長979個氨基酸，分子量為106kD。IA-2結(jié)構(gòu)上分4部分信號肽(l-25aa)、胞外結(jié)構(gòu)域(26-576aa)、單一跨膜結(jié)構(gòu)域(577_600aa)及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(601_979aa)，其中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的羧基末端含有PTP樣區(qū)(683-979aa)。IA-2表達于正常人腦、垂體、胰腺和腦瘤組織，主要在腦和胰島組織中表達。IA-2和ΙΑ-2β(phogrin)在PTP樣區(qū)域具有88%的氨基酸序列同源性，近膜區(qū)(601-682aa)為<50%的同源性，而在胞外區(qū)僅有大約10%的同源性。糖尿病患者自身抗體結(jié)合至IA-2和ΙΑ-2β的細胞內(nèi)部分，并且兩者之間具有相當(dāng)?shù)慕徊娣磻?yīng)性。研究表明，缺乏ΙΑ-2抗體時，也檢測不到抗ΙΑ-2β的抗體，IA-2近膜區(qū)可以覆蓋ΙΑ-2β中未發(fā)現(xiàn)的全部表位，因此表明ΙΑ-2可能是糖尿病相關(guān)自身抗原體液免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)。在ΙΑ-2抗體中，反應(yīng)性平均分布于在近膜區(qū)(601-682aa)和PTP樣區(qū)域(683-979aa)內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的表位。近膜區(qū)和PTP樣區(qū)域內(nèi)的IA-2特異殘基在早期抗原抗體識別中是重要的(BonifacioE等，JImmunol，161:2648_2654(1998))。IA-2A存在于55-75%新發(fā)1型糖尿病患者，而正常對照人群陽性率僅為1%。IA-2A陽性率一般維持不變，且抗體水平在初診后的6年中僅輕微下降。經(jīng)典的IA-2A檢測方法是用兔網(wǎng)織紅細胞真核表達系統(tǒng)制備的35S標(biāo)記的IA_2建立的放射免疫沉淀法。近年來，又獲得了原核表達的具有免疫學(xué)活性的重組蛋白，大大提高了蛋白的產(chǎn)量，并建立了相對簡單的RIA及ELISA等方法。最近還有研究者利用哺乳動物細胞表達的融合熒光素酶的IA-2建立了熒光素酶免疫沉淀法，其特異性和敏感性與RIA相似。鋅轉(zhuǎn)運子ZnT8(zinetransporterZnT8)為膜蛋白，具有6個跨膜區(qū)，全長為369個氨基酸。與GAD65和ΙΑ-2不同，ZnTS是胰島β細胞高度特異的，ZnTS自身抗體有可能是一個重要的1型糖尿病標(biāo)記物(ChimientiF等，Diabetes，53:2330_2337(2004))。ZnT8A在年輕個體中較低，在診斷發(fā)病3年后的新發(fā)患者中急劇增加，在晚青春期新發(fā)患者中達到峰值(80%)，隨后在診斷發(fā)病23-30年后的群體中逐漸降低(58%)。在正常對照人群陽性率小于2%，2型糖尿病患者中陽性率小于3%。表位區(qū)域鑒定試驗表明全長ZnTS的l-369aa構(gòu)建體敏感性和特異性分別為25%和98%；l-74aa的N-末端構(gòu)建體敏感性和特異性分別為8%和98%；268-369aa的C-末端構(gòu)建體敏感性和特異性分別為50%和98%；N-末端和C-末端融合后的N/C構(gòu)建體與C-末端構(gòu)建體和N/C構(gòu)建體互補使用后，敏感性可以達到63%(ffenzlauJM等，ProcNatlAcadSciUSA,10417040-17045(2007))目前，ZnTSA檢測主要局限于實驗室，并未在臨床上使用。ZnTSA的真正價值在于它有可能成為第四種檢測指標(biāo)，與GADA、IAA和IA-2A組合使用，進一步提高1型糖尿病的早期檢出率。胰島特異的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(islet-specificglucose-6-phosphatasecatalyticsubunit-relatedproteinautoantibodies,IGRP)是表達于胰島β細胞中的胰島特異蛋白質(zhì)，較少表達于α細胞，與肝臟葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基具有大約50%的同一性，該酶催化葡萄糖異生途徑的最終步驟。Jarchum等研究者(ClinImmunol,127=359-365(2008))利用IFN-γELISP0T測定法測試了來自新發(fā)兒童1型糖尿病患者的外周血單核細胞對4條IGRP肽的反應(yīng)，結(jié)果顯示65%的患者對至少1條肽反應(yīng)，而健康對照對任何肽均不反應(yīng)。這些結(jié)果表明，IGRP是⑶8(+)T細胞抗原，⑶8(+)T細胞在1型糖尿病的形成中具有重要的作用。此外，MukherjeeR等學(xué)者(JImmunol,1745306-5315(2005))還鑒定出2個⑶4(+)T細胞表位，能夠在NOD小鼠中調(diào)節(jié)和預(yù)防糖尿病的形成。由于胰島特異表達，IGRP有可能成為研制1型糖尿病診斷試劑的非常優(yōu)秀的候選自身抗原，其診斷意義還有待進一步研究。在1型糖尿病發(fā)病前、發(fā)病早期或發(fā)病后會產(chǎn)生許多自身抗體，直到目前為止，與1型糖尿病相關(guān)的自身抗體仍然不斷被大家所發(fā)現(xiàn)。通過大量的研究，人們已經(jīng)清楚地認識至IJ，要確切地診斷1型糖尿病，僅單一一種自身抗體指標(biāo)的預(yù)測能力是非常有限的，幾乎所有對1型糖尿病診斷的研究都是在多個免疫指標(biāo)的基礎(chǔ)上進行的。在以上所列舉的自身抗體免疫指標(biāo)中，臨床目前最為常用的是ICA、IAA、GADA和IA-2A，但其中任何一種的檢出率都無法達到100%，文獻報道的不同方法的檢出率均在大約40-90%之間。目前組合測量IAA、GADA和IA-2A可以使自身免疫性糖尿病的診斷率提高到94%。WenzlauJM等(ProcNatlAcadSciUSA,10417040-17045(2007))將ZnT8A加入到檢測指標(biāo)中后，糖尿病自身抗體陽性個體的數(shù)量增加至98%，并且將兩種或多種自身抗體陽性個體的數(shù)量從72%增加至82%。另一方面，目前的糖尿病分型診斷方法存在很多不足。首先，運用人、猴或嚙齒類胰腺切片進行間接免疫熒光檢測ICA的方法是檢測混合抗體且非常繁瑣，受到很大限制，必將被更特異的檢測指標(biāo)和更簡單的檢測方法所取代。其次，胰島素雖然是胰島細胞特異的，但很多患者需要施用外源胰島素輔助治療，而施用外源胰島素治療5-7天后就會產(chǎn)生胰島素抗體。因此，遲發(fā)型1型糖尿病患者不宜采用此指標(biāo)進行檢測。再次，GAD65和ΙΑ-2都是主要由神經(jīng)組織和胰島表達的蛋白，非胰島細胞高度特異，在臨床上部分其它自身免疫性疾病患者，如甲狀腺相關(guān)疾病、風(fēng)濕類疾病等，也可以檢測到這些自身免疫反應(yīng)標(biāo)記物。因此，自身免疫性1型糖尿病診斷試劑在特異性和敏感性方面有待于進一步改進。本課題組研究人員通過廣泛調(diào)研，發(fā)現(xiàn)IGRP和ZnTS是胰島β細胞高度特異的抗原，并且通過本發(fā)明的工作發(fā)現(xiàn)IGRP和ZnTS的某些肽段具有良好的抗原性，即特異性和敏感性都非常高，并且對常用抗原檢測具有一定的互補作用。因此，本發(fā)明在聯(lián)合應(yīng)用IGRP和ZnTS抗原的基礎(chǔ)上，再輔以常用抗原GAD65和ΙΑ-2，在顯著提高特異性的基礎(chǔ)上又進一步提高了敏感性，有望成為1型糖尿病初步篩查的有效診斷試劑，對于1型糖尿病患者的早期診斷和治療具有重要意義。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含IGRP和ZnTS抗原。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含IGRP和ZnTS抗原與選自GAD65和ΙΑ-2的一種或兩種抗原的組合。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含IGRP和ZnTS抗原，其中IGRP抗原為SEQIDNO=I所示氨基酸序列的多肽或其功能變體，ZnTS抗原為SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽或其功能變體。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含IGRP和ZnTS抗原與選自GAD65和ΙΑ-2的一種或兩種抗原的組合，其中IGRP抗原為SEQIDNO1所示氨基酸序列的多肽或其功能變體，ZnTS抗原為SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽或其功能變體，GAD65抗原為SEQIDNO:3所示氨基酸序列的多肽或其功能變體，IA-2抗原為SEQIDN0:4所示氨基酸序列的多肽或其功能變體。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其中組合物中IGRP和ZnTS抗原單獨存在。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其中組合物中IGRP和ZnTS抗原以融合蛋白質(zhì)的形式存在。本發(fā)明涉及用于免疫診斷1型糖尿病的組合物，其中組合物中IGRP和ZnTS抗原以融合蛋白質(zhì)的形式存在，IGRP-ZnTS融合抗原為SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽或其功能變體。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，組合物中IGRP_ZnT8融合抗原與GAD65和IA-2抗原之一組合存在。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方案中，組合物中IGRP-ZnT8融合抗原與GAD65和IA-2二種抗原組合存在。附圖簡述圖1.人IGRP抗原肽段的氨基酸序列。圖2.人ZnTS抗原肽段的氨基酸序列。圖3.人GAD65抗原肽段的氨基酸序列。圖4.人IA-2抗原肽段的氨基酸序列。圖5.人IGRP和ZnT8抗原肽段的融合抗原IGRP_ZnT8的氨基酸序列。發(fā)明詳述在1型糖尿病發(fā)病前、發(fā)病早期或發(fā)病后會產(chǎn)生許多自身抗體，直到目前為止，與1型糖尿病相關(guān)的自身抗體仍然不斷被大家所發(fā)現(xiàn)。通過大量的研究，人們已經(jīng)清楚地認識至IJ，要確切地診斷1型糖尿病，僅單一一種自身抗體指標(biāo)的預(yù)測能力是非常有限的，幾乎所有對1型糖尿病診斷的研究都是在多個免疫指標(biāo)的基礎(chǔ)上進行的。本課題組研究人員通過廣泛調(diào)研，發(fā)現(xiàn)IGRP和ZnTS是胰島β細胞高度特異的抗原，并且通過本發(fā)明的工作發(fā)現(xiàn)IGRP和ZnTS的某些肽段具有非常好的抗原性。本發(fā)明在聯(lián)合應(yīng)用胰島β細胞高度特異抗原IGRP和ZnTS的基礎(chǔ)上，再輔以常用抗原GAD65和/或ΙΑ-2，能夠一次性檢測出IGRPA、ZnT8A、GADA和ΙΑ-2Α四種自身免疫抗體，顯著提高了自身免疫性1型糖尿病檢測的特異性和敏感性。本發(fā)明通過常規(guī)的分子生物學(xué)方法釣取自身抗原肽段的編碼基因，將其連接入表達載體并表達出該抗原肽段。通過使用不同的特異抗原組合對于同一組血清樣品進行反應(yīng)性檢測，可以找到在血清反應(yīng)性方面具有更高特異性和敏感性，并且具有互補性的抗原組合。這種特異抗原的組合使得自身免疫性1型糖尿病的血清學(xué)檢測的特異性和靈敏度進一步顯著提高。應(yīng)當(dāng)指出的是，對所選擇抗原肽段進行適當(dāng)?shù)男揎椚匀痪哂袡z測效果。例如對其中個別氨基酸進行保守替換、增加或缺失，個別氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸，通過此類修飾得到的多肽在本文中稱作功能變體。保守氨基酸替換的實例例如Ala、Val.Leu和Ile間的替換；Ser和Thr間的替換；酸性殘基Asp和Glu間的替換；Asn和Gln間的替換；和堿性殘基Lys和Arg間的替換；或者芳香族殘基Phe和Tyr間的替換。對于不同抗原肽段融合的抗原，本領(lǐng)域眾所周知其構(gòu)建原則和方法。具體而言，為了不影響待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之間添加一個接頭。關(guān)于接頭的選擇具體可參見(AraiR等，ProteinEnginering,14(5):529_532(2001))?？乖鞍踪|(zhì)的克隆、表達以及純化可通過多種方法進行。具體方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002，第1217-1270頁。適宜的原核表達載體如本研究室構(gòu)建的原核表達載體pBVILl、pEGX系列原核表達載體(AmershamPharmacia公司)、pET系列原核表達載體(Novagen公司)、pTrxFus系列原核表達載體(Invitrogen公司)等。特別優(yōu)選本研究室構(gòu)建的原核表達載體PBVILl載體。檢測方法可以有多種，例如間接酶聯(lián)免疫測定技術(shù)、雙抗原夾心酶免疫測定技術(shù)、金標(biāo)快速檢測技術(shù)、免疫滲濾檢測技術(shù)、蛋白芯片檢測技術(shù)等。優(yōu)選間接酶聯(lián)免疫測定(間接ELISA)方法。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了用于自身免疫性1型糖尿病檢測的組合物，在增加胰島β細胞高度特異抗原IGRP和ZnTS的基礎(chǔ)上，再輔以常用抗原GAD65和/或ΙΑ-2，能夠一次性檢測出IGRPA、ZnT8A、GADA和IA-2A四種自身免疫抗體，顯著降低了檢測成本，并且顯著提高了自身免疫性1型糖尿病檢測的特異性和敏感性。以下結(jié)合具體實施例詳細說明本發(fā)明，但不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例實施例1:IGRP、ZnT8、GAD65和ΙΑ_2四種抗原的制備1.四種抗原肽段基因的克隆根據(jù)抗原肽段的核苷酸序列設(shè)計并合成了上下游引物，所使用的限制性內(nèi)切酶分別為XhoI和XbaI。用于擴增IGRP抗原的引物序列如下IGRP-F:5’-GCCTCGAGGATTTCCTTCACAGGAATGGAGTGCTCATAATTCAGCATTTGCA-3’IGRP-R5’-GCTCTAGAAAAAGTGTAGTAAGCTCGGTAGTCCTTCTGCAAATGCTGAATTA-3’用于擴增ZnTS抗原的引物序列如下ZnT8-F5'-GCCTCGAGAAGGACTTCTCCATCCT-3，ZnT8-R5'-GCTCTAGATTACTAGTCACAGGGGTCTTCACA-3，用于擴增GAD65抗原的引物序列如下GAD65-F5'-GCCTCGAGTGGATGCATGTGGATGCA-3’GAD65-R5'-GCTCTAGATTAAACGTGGCGTCCGCACTGT-3’用于擴增IA-2抗原的引物序列如下IA-2-F5'-GCCTCGAGGCCCAAGCCAACATGGACATCT-3，IA-2-R5'-GCTCTAGATCACTGGGGCAGGGCCTTGAGGAT-3，以人胰島素瘤組織cDNA文庫為模板，分別擴增了ZnT8、GAD65和IA-2抗原的基因片段。IGRP為兩條引物互為模板進行擴增。PCR擴增條件如下預(yù)變性95°C2分鐘，變性940C30秒；復(fù)性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(隨基因長度不同而不同)，擴增32個循環(huán)，再72°C延伸7分鐘。PCR擴增所得的片段通過電泳鑒定，表明均得到相應(yīng)大小的基因片段。2.表達載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切并連接入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pBVILl載體，測序由利嘉富誠生物技術(shù)有限公司完成。3.四種抗原在大腸桿菌DH5α中的表達與純化用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，熱誘導(dǎo)表達，收集菌體，將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/LpH8.OTE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C，1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.OTE配制)溶解，力卩1%β-巰基乙醇。再于200C1，2000rpm離心10分鐘，去沉淀取上清。將上述溶解的包涵體溶液過Q-S印haroseFF陰離子交換柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/LTE含6mol/L脲，0.1%β-巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05mol/LNaCl洗脫峰。再過S印hardexG_50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。純化的抗原進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明獲得了純度較高的特異抗原。實施例2IGRP-ZnT8融合抗原的制備1.引物設(shè)計根據(jù)兩個抗原肽段基因及接頭的序列設(shè)計了上下游引物，使用的限制性內(nèi)切酶分別為XbaI和XhoI，所有引物均由上海英俊生物技術(shù)公司合成，其序列如下IGRP-FL:5’-GCCTCGAGGATTTCCTTCACAGGAATGGAGTGCTCATAATTCAGCATTTGCA-3’IGRP-RL:5，-TCCACCACCACTAGAACCTCCACCAAAAGTGTAGTA-3，ZnT8-FL5’-GGTGGAGGTTCTAGTGGTGGTGGAAAGGACTTCTCC-3’ZnT8-RL5'-GCTCTAGATTACTAGTCACAGGGGTCTTCACA-3’2.載體構(gòu)建以實施例1中構(gòu)建的抗原基因質(zhì)粒為模板，分別擴增了具有接頭基因序列的IGRP和ZnTS抗原的基因片段。然后以具有互補接頭的基因片段互為模板進行擴增，將IGRP和ZnTS抗原基因片段連接到一起，構(gòu)建融合抗原基因。PCR擴增條件如下預(yù)變性95°C2分鐘，變性94°C30秒；復(fù)性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(隨基因長度不同而不同)，擴增32個循環(huán)，再72°C延伸7分鐘。通過電泳鑒定，表明均得到相應(yīng)大小的基因片段。將融合抗原基因片段用限制性內(nèi)切酶酶切并連接入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的PBVILl載體，測序由利嘉富誠生物技術(shù)有限公司完成。3.抗原制備見實施例1。實施例3間接ELISA方法評價4種單獨抗原的抗原性分別以所選擇的IGRP、ZnT8、GAD65和ΙΑ-2抗原為抗原，應(yīng)用間接ELISA方法初步檢測了50例健康獻血員血清樣本，以其OD值的平均值+2SD為cutoff值，計算出IGRP、ZnT8、GAD65禾口IA-2的cutoff值分別為0.19,0.18,0.17和0.19。然后，再用這四種抗原分別檢測了20例自身免疫性1型糖尿病人血清和20例健康獻血員血清的1型糖尿病自身免疫抗體，表1中顯示了所檢測樣品的OD值與cutoff值的比值(S/co=樣品OD值/cutoff值)，比值大于1判定為陽性，比值大于2判定為強陽性，比值小于1判定為陰性。在初步檢測中IGRP、ZnT8、GAD65和IA_2四種抗原的敏感性和特異性分別如下IGRP為80%和95%、ZnT8為65%禾口100%,GAD65為50%禾口85%,IA-2為80%禾口90%。表1間接ELISA方法檢測4種抗原對自身免疫性1型糖尿病人和健康獻血員血液樣本的反應(yīng)性(S/co)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>N-40.5740.3210.4840.426N-51.5260.7211.2001.342N-60.2950.2420.2790.258N-70.4320.2950.3530.332N-80.2740.2630.2950.268N-90.2470.6371.0580.953N-IO0.3210.3210.3160.289N-Il0.4370.4950.5050.479N-120.5530.4950.4420.347N-130.2840.3160.3000.311N-140.3050.2950.2890.305N-150.3110.3160.3000.474N-160.4210.3680.3630.468N-170.2530.5260.4630.500N-180.2530.2950.3210.279N-190.3370.3890.3320.332N-200.3420.3680.3530.553檢出率80%65%50%80%特異性_95%_100%_85%_90%我們注意到在這四種抗原中沒有任何一種能夠檢出全部自身免疫性1型糖尿病患者，但IGRP和ZnT8抗原在檢測中具有更高的特異性，并且可以彌補GAD65和ΙΑ-2聯(lián)合檢測的不足，具有一定的互補性?？乖g的這種互補性對于自身免疫性1型糖尿病患者的臨床診斷是非常重要的。用不同抗原檢測同一病人血清，其反應(yīng)性有所不同，并且各抗原之間存在一定的互補性。這可能是由于不同自身免疫性1型糖尿病患者在不同時期體內(nèi)的抗體譜不同。因此，聯(lián)合應(yīng)用多種抗原進行檢測有可能在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高檢出率。實施例4間接ELISA方法評價IGRP和ΖηΤ8抗原混合組與IGRP_ZnT8融合抗原組在檢出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果如實施例3所述，由于胰島β細胞特異表達的IGRP和ZnTS抗原具有比其它抗原具有更高的特異性和相當(dāng)或更高的敏感性，為了以后方便地將兩種抗原一起使用，或者與其它抗原組合使用，因此設(shè)計實驗驗證IGRP和ZnTS抗原混合組與IGRP-ZnTS融合抗原組在檢出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果。實驗結(jié)果如表2所示。表2間接ELISA方法檢測IGRP和ΖηΤ8抗原混合組與IGRP_ZnT8融合抗原組對自身免疫性1型糖尿病人和獻血員血液樣本的反應(yīng)性(S/co)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表2可見，胰島β細胞特異表達的IGRP和ΖηΤ8抗原混合組與IGRP_ZnT8融合抗原組在檢出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果沒有差異，具有相同的檢出率和特異性。因此，在研制用于自身免疫性1型糖尿病診斷的試劑盒時，IGRP和ZnTS抗原可以混合使用，也可以以融合抗原形式使用。但是為了簡便操作步驟，優(yōu)選以融合抗原形式使用。實施例5間接ELISA方法評價IGRP-ZnTS融合抗原與其它常用抗原組合使用在檢出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果如實施例3和4所述，由于IGRP-ZnTS融合抗原具有相比其它常用抗原更高的特異性和相當(dāng)或更高的檢出率，因此設(shè)計實驗驗證其與2種常用抗原，即GAD65和IA-2，一種或兩種相組合在檢出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果。實驗結(jié)果如表3所示。表3間接ELISA方法檢測IGRP-ZnTS融合抗原與其它常用抗原組合對自身免疫性1型糖尿病患者和獻血員血液樣本的反應(yīng)性(S/co)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>T1DM156.2846.0685.8797.021T1DM163.7894.5534.4374.542T1DM170.8470.8791.0630.963T1DM181.6051.7632.0891.847T1DM190.8261.1261.0681.100T1DM201.8322.1002.5422.084N-I0.3580.3790.4320.374N-20.5740.5370.7110.626N-31.6481.3580.3532.047N-40.6050.6000.7790.758N-51.6001.7631.3792.126N-60.3000.2840.3370.332N-70.4260.4320.6110.479N-80.3050.3000.3840.363N-90.5000.5110.6161.721N-IO0.3420.3580.4000.384N-Il0.4470.3160.4050.295N-120.3210.2420.7260.274N-130.3000.3470.3370.916N-140.3000.2420.3050.616N-150.4580.2530.3210.458N-160.5580.2630.3420.774N-170.5890.2580.2950.321N-180.3160.2790.3210.468N-190.5160.2470.3000.363N-200.2680.2530.4160.637檢出率_80%_95%_100%_95%特異性90%_90%_95%_85%由表3可見，胰島β細胞特異表達的IGRP_ZnT8融合抗原與常用抗原GAD65和IA-2—種或兩種相組合在檢出自身免疫性1型糖尿病患者方面效果更好，檢出率和特異性均明顯提高。另外，IGRP-ZnT8融合抗原與常用抗原GAD65和IA-2—種或兩種相組合在檢出自身免疫性1型糖尿病患者效果方面明顯優(yōu)于常用抗原GAD65和IA-2—種或兩種的組合，且4種抗原組合檢測效果最優(yōu)，檢出率達到100%，特異性達到95%。這表明胰島β細胞特異表達的IGRP-ZnTS融合抗原確實與其它常用抗原在檢出自身免疫性1型糖尿病患者方面存在互補性。聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高檢出率，并且具有更高的特異性。SEQUENCELISTING<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所上海海泰金芯生物分子檢測技術(shù)有限公司<120>用于免疫診斷1型糖尿病的組合物<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>1MetAspPheLeuHisArgAsnGlyValLeulielieGlnHisLeuGln151015LysAspTyrArgAlaTyrTyrThrPhe2025<210>2<211>102<212>PRT<213>人<400>2LysAspPheSerlieLeuLeuMetGluGlyValProLysSerLeuAsn151015TyrSerGlyValLysGluLeulieLeuAlaValAspGlyValLeuSer202530ValHisSerLeuHislieTrpSerLeuThrMetAsnGlnVallieLeu354045SerAlaHisValAlaThrAlaAlaSerArgAspSerGlnValValArg505560ArgGlulieAlaLysAlaLeuSerLysSerPheThrMetHisSerLeu65707580ThrlieGlnMetGluSerProValAspGlnAspProAspCysLeuPhe859095CysGluAspProCysAsp100<210>3<211>91<212>PRT<213>人<400>3TrpMetHisValAspAlaAlaTrpGlyGlyGlyLeuLeuMetSerArg151015LysHisLysTrpLysLeuSerGlyValGluArgAlaAsnSerValThr202530TrpAsnProHisLysMetMetGlyValProLeuGlnCysSerAlaLeu354045LeuValArgGluGluGlyLeuMetGlnAsnCysAsnGlnMetHisAla0140]5055600141]SerTyrLeuPheGinGinAspLysHisTyrAspLeuSerTyrAspThr0142]657075800143]GlyAspLysAlaLeuGinCysGlyArgHisVal0144]85900145]<210>40146]<211>2970147]<212>PRT0148]<213>人0149]<400>40150]AlaGinAlaAsnMetAsplieSerThrGlyHisMetlieLeuAlaTyr0151]1510150152]MetGluAspHisLeuArgAsnArgAspArgLeuAlaLysGluTrpGin0153]2025300154]AlaLeuCysAlaTyrGinAlaGluProAsnThrCysAlaThrAlaGin0155]3540450156]GlyGluGlyAsnlieLysLysAsnArgHisProAspPheLeuProTyr0157]5055600158]AspHisAlaArglieLysLeuLysValGluSerSerProSerArgSer0159]657075800160]AspTyrlieAsnAlaSerProIlelleGluHisAspProArgMetPro0161]8590950162]AlaTyrlieAlaThrGinGlyProLeuSerHisThrlieAlaAspPhe0163]1001051100164]TrpGinMetValTrpGluSerGlyCysThrVallieValMetLeuThr0165]1151201250166]ProLeuValGluAspGlyValLysGinCysAspArgTyrTrpProAsp0167]1301351400168]GluGlyAlaSerLeuTyrHisValTyrGluValAsnLeuValSerGlu0169]1451501551600170]HislieTrpCysGluAspPheLeuValArgSerPheTyrLeuLysAsn0171]1651701750172]ValGinThrGinGluThrArgThrLeuThrGinPheHisPheLeuSer0173]1801851900174]TrpProAlaGluGlyThrProAlaSerThrArgProLeuLeuAspPhe0175]1952002050176]ArgArgLysValAsnLysCysTyrArgGlyArgSerCysProlielie0177]2102152200178]ValHisCysSerAspGlyAlaGlyArgThrGlyThrTyrlieLeulie160179]2252302352400180]AspMetValLeuAsnArgMetAlaLysGlyValLysGlulieAsplie0181]2452502550182]AlaAlaThrLeuGluHisValArgAspGinArgProGlyLeuValArg0183]2602652700184]SerLysAspGinPheGluPheAlaLeuThrAlaValAlaGluGluVal0185]2752802850186]AsnAlalieLeuLysAlaLeuProGin0187]2902950188]<210>50189]<211>1350190]<212>PRT0191]<213>人0192]<400>50193]MetAspPheLeuHisArgAsnGlyValLeulielieGinHisLeuGin0194]1510150195]LysAspTyrArgAlaTyrTyrThrPheGlyGlyGlySerSerGlyGly0196]2025300197]GlyLysAspPheSerlieLeuLeuMetGluGlyValProLysSerLeu0198]3540450199]AsnTyrSerGlyValLysGluLeulieLeuAlaValAspGlyValLeu0200]5055600201]SerValHisSerLeuHislieTrpSerLeuThrMetAsnGinVallie0202]657075800203]LeuSerAlaHisValAlaThrAlaAlaSerArgAspSerGinValVal0204]8590950205]ArgArgGlulieAlaLysAlaLeuSerLysSerPheThrMetHisSer0206]1001051100207]LeuThrlieGinMetGluSerProValAspGinAspProAspCysLeu0208]1151201250209]PheCysGluAspProCysAsp0210]13013權(quán)利要求用于血清學(xué)免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含IGRP抗原和ZnT8抗原。2.權(quán)利要求1所述的的組合物，其還包含選自GAD65和IA-2中的一種或兩種抗原。3.權(quán)利要求1或2所述的的組合物，其中IGRP抗原為SEQIDNO=I所示多肽或其功能變體。4.權(quán)利要求1或2所述的的組合物，其中ZnTS抗原為SEQIDNO:2所示多肽或其功能變體。5.權(quán)利要求1或2所述的的組合物，其中GAD65抗原為SEQIDNO3所示多肽或其功能變體。6.權(quán)利要求1或2所述的的組合物，其中IA-2抗原為SEQIDNO:4所示多肽或其功能變體。7.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中IGRP和ZnTS抗原以融合抗原的形式存在。8.權(quán)利要求7所述的組合物，其中IGRP和ZnT8抗原的融合抗原為SEQIDNO5所示多肽或其功能變體。9.權(quán)利要求7所述的的組合物，其中GAD65抗原為SEQIDNO:3所示多肽或其功能變體。10.權(quán)利要求7所述的的組合物，其中ΙΑ-2抗原為SEQIDNO:4所示多肽或其功能變體。全文摘要本發(fā)明涉及用于血清學(xué)免疫診斷1型糖尿病的組合物，其包含胰島β細胞特異的IGRP和ZnT8抗原，或其與選自常用抗原GAD65和IA-2的一種或兩種的組合。文檔編號G01N33/66GK101825637SQ20091011999公開日2010年9月8日申請日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者馮曉燕,宋曉國,張賀秋,方平,朱翠俠,王國華,葛海鵬,陳坤申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;上海海泰金芯生物分子檢測技術(shù)有限公司