本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，并涉及了基因工程及免疫學(xué)的內(nèi)容，具體地，涉及寨卡病毒抗原及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

寨卡病毒屬黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈rna病毒，直徑20nm，是一種通過(guò)蚊蟲(chóng)進(jìn)行傳播的蟲(chóng)媒病毒，宿主不明確，主要在野生靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和棲息在樹(shù)上的蚊子，如非洲伊蚊(aedesaegypti)中循環(huán)。該病毒最早于1947年偶然通過(guò)黃熱病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)在烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴中發(fā)現(xiàn)，隨后于1952年在烏干達(dá)和坦桑尼亞人群中發(fā)現(xiàn)。該病毒活動(dòng)一直比較隱匿，僅在赤道周?chē)姆侵?、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)有寨卡病毒感染散發(fā)病例。最早一次暴發(fā)流行是2007年發(fā)生在西太平洋密克羅尼亞群島的雅鋪島，更大的一次流行于2013年-2014年發(fā)生在大洋洲的法屬波利尼西亞，感染了約32000人。伊蚊還傳播黃病毒科中的其他種類(lèi)病毒，其中就包括了登革熱病毒，如何做到寨卡和登革兩種疾病的區(qū)別檢測(cè)，降低登革患者血清在寨卡診斷中的交叉對(duì)寨卡病毒抗體檢測(cè)試劑的有效性具有重要意義。

寨卡病毒感染的典型癥狀包括急性起病的低熱、斑丘疹、關(guān)節(jié)疼痛(主要累及手、足小關(guān)節(jié))、結(jié)膜炎，其他癥狀包括肌痛、頭痛、眼眶痛及無(wú)力。另外少見(jiàn)的癥狀包括腹痛、惡心、嘔吐、黏膜潰瘍和皮膚瘙癢。2013年和2015年分別在法屬波利尼西亞和巴西塞卡疫情期間，有報(bào)道稱(chēng)寨卡病毒病可能會(huì)造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā)癥。2015年巴西的寨卡暴發(fā)流行中發(fā)現(xiàn)了很多小頭畸形(microcephaly)的新生兒。寨卡病毒經(jīng)由母親傳染給孩子，寨卡發(fā)燒可能和新生嬰兒的小頭畸形有關(guān)連，其對(duì)成人的感染能影響神經(jīng)系統(tǒng)，而且可能也與格林－巴利綜合征(guillain-barresyndrome)存在聯(lián)系。

寨卡病毒呈球形，直徑約為40-70nm，有包膜。zikv核酸為一條長(zhǎng)度為10,794堿基的單正鏈rna，其編碼基因順序?yàn)?’-c-prm-e-ns1-ns2a-ns2b-ns3-ns4a-ns4b-ns5-3’。rna翻譯為一個(gè)多聚蛋白，然后通過(guò)蛋白酶裂解為結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白(capsid，c)、前體膜蛋白(precursormembrane，prm)、膜蛋白(envelope，e)，以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructuralprotein,ns)。其中ns1是一個(gè)具有多重功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白結(jié)構(gòu)在黃病毒科中高度保守。

寨卡病毒ns1蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)組成：n端β-roll,c端β-ladder，和翼區(qū)(wingdomain)。ns1蛋白通常以二聚體和六聚體的形式存在。二聚體ns1在病毒基因組的復(fù)制過(guò)程中起著重要作用。六聚體ns1能幫助病毒逃避宿主免疫細(xì)胞的識(shí)別。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一為：通過(guò)寨卡病毒和登革病毒ns1蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，對(duì)同源區(qū)進(jìn)行缺失突變，然后對(duì)寨卡病毒ns1突變體序列進(jìn)行表達(dá)及純化，進(jìn)而獲得特異性高的寨卡病毒ns1抗原突變體；

本發(fā)明的目的之一為：提供一種能顯著降低登革交叉的應(yīng)用于寨卡抗體檢測(cè)的有效的寨卡病毒ns1抗原突變體；

本發(fā)明的目的之一為：提供一種能顯著降低登革交叉的應(yīng)用于寨卡抗體檢測(cè)的有效的寨卡ns1抗原突變體的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種寨卡病毒ns1抗原突變體：

具體為，首先從genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載寨卡病毒核苷酸序列(kx377335.1)。利用clustalomega將寨卡病毒ns1抗原及四個(gè)血清型的登革病毒ns1抗原的氨基酸序列進(jìn)行排列比對(duì)(圖1)，查找出高度同源區(qū)序列(dgcwygmeirp)。由于該序列在寨卡病毒和登革病毒中為高度保守，因此計(jì)劃將該區(qū)域進(jìn)行缺失突變，并測(cè)試該突變體蛋白的特異性反應(yīng)。所述缺失突變體的氨基酸序列如seqidno.2所示。所述同源區(qū)序列(dgcwygmeirp)位于c端β-ladder(圖2)。

本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供所述寨卡病毒ns1抗原的篩選方法，具體為：

將所述突變體序列利用swiss-model數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源模建，與突變前野生型對(duì)照進(jìn)行三維構(gòu)象的變化比對(duì)。在確認(rèn)突變前后蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化之后將同源區(qū)序列進(jìn)行缺失突變，構(gòu)建帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pet24_zns1，轉(zhuǎn)染大腸桿菌宿主bl21，利用鎳親和層析將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行透析操作，用sds-page電泳檢測(cè)蛋白純度，獲得相應(yīng)的抗原蛋白。用純化的zikans1包被酶標(biāo)板后進(jìn)行間接法elisa驗(yàn)證，檢測(cè)寨卡與登革抗體陽(yáng)性樣本。由檢測(cè)結(jié)果可知突變體在未降低寨卡陽(yáng)性樣本檢出的同時(shí)顯著降低了登革陽(yáng)性樣本的檢出，符合預(yù)期的目標(biāo)。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供了所述寨卡病毒抗原突變體的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體是將seqidno.4所示的核苷酸序列與pet24商業(yè)化載體進(jìn)行連接所獲得的。

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供含有所述的寨卡病毒抗原突變體的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌細(xì)胞株bl21(pet24-zns1)。

本發(fā)明的第五個(gè)方面提供所述寨卡病毒抗原的純化方法，將經(jīng)過(guò)dna分析和對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)的核苷酸序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增合成(圖3)，并引入ndei和xhoi酶切位點(diǎn)，以商品化質(zhì)粒pet24為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建寨卡病毒表達(dá)載體，所述核苷酸序列如seqidno.4所示，通過(guò)鎳柱親和層析純化，得到寨卡病毒ns1突變蛋白。

含有氨基酸序列如seqidno.2所示寨卡病毒抗原的生物制品屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選地，所述的生物制品為檢測(cè)試劑。

含有氨基酸序列如seqidno.2所示寨卡病毒抗原突變體的檢測(cè)試劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了氨基酸序列如seqidno.2所示寨卡病毒抗原突變體在制備用于檢測(cè)寨卡病毒的檢測(cè)試劑盒中的用途。

可選的，所述試劑盒為elisa試劑盒或膠體金法快檢試劑盒。

本發(fā)明提供了氨基酸序列如seqidno.2所示寨卡病毒抗原突變體在制備寨卡病毒疫苗中的用途。

本發(fā)明提供的上述寨卡病毒抗原突變體免疫原性好，特異性強(qiáng)，可作為寨卡病毒血清學(xué)檢測(cè)方法的有效組份，還能夠用于制備寨卡病毒疫苗。

附圖說(shuō)明

圖1為寨卡病毒ns1和登革病毒ns1的氨基酸序列對(duì)比

圖2為寨卡病毒ns1蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖；該結(jié)構(gòu)為二聚體。缺失刪除掉的氨基酸序列dgcwygmeirp由空間填充模型表示。

圖3為本發(fā)明寨卡病毒ns1的核苷酸片段電泳照片。加樣孔m為核酸marker，分子量從上到下為：3,000bp,2,000bp,1,500bp,1,000bp,800bp,600bp,400bp,300bp,200bp。加樣孔1為zikans1野生型序列擴(kuò)增產(chǎn)物。加樣孔2為zikans1突變型序列擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖4為寨卡病毒ns1野生型及突變體在宿主細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)，4a.野生型蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；4b.突變型蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；

圖5為寨卡病毒ns1野生型及突變體的蛋白質(zhì)純化電泳照片，5a野生型蛋白的純化；5b突變體蛋白的純化。s,supernatant；f,flowthrough；bf,washdownwithbindingbuffer；wf,washdownwithwashingbuffer；e,washdownwithelutionbuffer；m,marker.

圖6為本發(fā)明寨卡病毒抗原蛋白用于elisa檢測(cè)的原始結(jié)果。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1寨卡病毒ns1抗原突變體的獲得和篩選

將從genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的寨卡病毒核苷酸序列kx377335.1進(jìn)行分析，將其中ns1抗原的氨基酸序列(876-1202)及四個(gè)血清型登革ns1抗原的氨基酸序列(unitprotkb:p17763,p12823,q5ub51,q2yhf0)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，通過(guò)clustalomega進(jìn)行序列比對(duì)查找出同源區(qū)(圖1)，進(jìn)行序列(dgcwygmeirp，seqidno.1所示，編碼的核苷酸序列如seqidno.3所示)的突變?nèi)コ?。獲得的ns1抗原突變體的氨基酸序列如seqidno.2所示。對(duì)其進(jìn)行三維分析，如圖2所示。

實(shí)施例2寨卡病毒ns1抗原突變體的制備和純化

分別用限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi對(duì)seqidno.4所示的核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，收集目的片段，與同樣用限制性內(nèi)切酶處理的pet24a載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet24_zns1；轉(zhuǎn)染大腸桿菌bl21,進(jìn)行蛋白表達(dá)，并用sds-page電泳確定表達(dá)情況和產(chǎn)量。

1、將重建完成的質(zhì)粒pet24_zns1轉(zhuǎn)入bl21(de3)大腸桿菌株，涂布平板，挑取單克隆在5mllb培養(yǎng)基(kana+，50μg/ml)的中試管內(nèi)，37℃240rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

2、將過(guò)夜培養(yǎng)的菌株，接種在含有300mllb培養(yǎng)基(kana+，50μg/ml)中，37℃240rpm繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液od600達(dá)到0.6-0.8的時(shí)候，加入iptg誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3個(gè)小時(shí)。

3、4000rpm離心，收取菌體，用10mmtris-hclph8.0，0.5％tritonx-10的緩沖液按照30ml緩沖液每升培養(yǎng)液的比例重懸，并用200w超聲波粉碎儀破碎細(xì)胞。

細(xì)胞裂解液的sds-page蛋白電泳膠顯示(圖4)，寨卡病毒ns1蛋白的表達(dá)產(chǎn)物大部份為可溶性蛋白.細(xì)胞裂解液用15,000g離心后上清采用鎳柱親和層析純化。純化時(shí)基液采用10mmtrisph8.0緩沖液，洗脫液添加終濃度為30mm/l，60mm/l，300mm/l的咪唑梯度洗脫。收取300mm/l的咪唑洗脫液流過(guò)的峰值，sds-page電泳檢測(cè)目的蛋白的純度(圖5)。

將親和層析收集的含有目的蛋白的洗脫液轉(zhuǎn)移至半透膜中，在pbs緩沖液中攪拌透析過(guò)液，第二天換液兩次，并對(duì)透析后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃度測(cè)定。以牛血清白蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)，采用biorad公司蛋白質(zhì)定量試劑(proteinassay)比色測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1)含pet24_zns1的e.colibl21(de3)工程菌可有效表達(dá)目的蛋白；2)經(jīng)過(guò)ni-nta親和層析純化，寨卡病毒ns1蛋白純度可達(dá)到95％-98％。

實(shí)施例3含寨卡病毒ns1抗原突變體的igmelisa方法和試劑盒

寨卡病毒抗原蛋白用0.05m的碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋至1μg/ml，包被酶標(biāo)板(每孔200μ1)置2℃－8℃過(guò)夜。第二天，棄包被液，用300ml洗液洗板一次。加入封閉液(每孔300μ1洗液)，2℃－8℃過(guò)夜。之后，棄封閉液，在相對(duì)濕度小于25％的干房干燥過(guò)夜。檢測(cè)樣本時(shí)分別加入稀釋后的陰性對(duì)照品n1-n8、寨卡陽(yáng)性樣本zika1-zika7、登革陽(yáng)性樣本denv1-denv8，每孔100μl，37℃反應(yīng)120分鐘。棄反應(yīng)液，用pbst緩沖液洗5次(每孔300μl洗液)。棄洗液，每孔加入鼠抗人igm·hrp100μl，37℃反應(yīng)20分鐘。棄反應(yīng)液，用pbst緩沖液洗5次(每孔加入300μl洗液)。棄洗液，每孔加入底物a液、b液各50μl，37℃避光反應(yīng)15分鐘。每孔加入終止液100μl終止反應(yīng)。450nm測(cè)定各孔a值(吸收值)。本實(shí)施例使用的是辣根過(guò)氧化物酶顯色系統(tǒng)，但也可以使用其他顯色系統(tǒng)，如堿性磷酸酶系統(tǒng)或生物素和親和素顯色系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)樣本排布及檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，本專(zhuān)利的寨卡ns1突變體抗原能夠消除和登革樣本的交叉反應(yīng)，同時(shí)該突變體對(duì)寨卡igm檢測(cè)試劑盒的靈敏度并無(wú)顯著影響。

以上結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<120>一種寨卡病毒ns1抗原突變體及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>11

<212>氨基酸

<213>缺失刪除掉的寨卡病毒ns1氨基酸序列

<400>

dgcwygmeirp

<210>2

<211>342

<212>氨基酸

<213>寨卡病毒ns1缺失突變體氨基酸序列

<400>

vgcsvdfskketrcgtgvfiyndveawrdrykyhpdsprrlaaavkqaweegicgissvsrmenimwksvegelnaileengvqltvvvgsvknpmwrgpqrlpvpvnelphgwkawgksyfvraaktnnsfvvdgdtlkecplehrawnsflvedhgfgvfhtsvwlkvredyslecdpavigtavkgreaahsdlgywiesekndtwrlkrahliemktcewpkshtlwtdgveesdliipkslagplshhntregyrtqvkgpwhseeleirfeecpgtkvyveetcgtrgpslrsttasgrvieewccrectmpplsfrakrkepesnlvrsmvtags

<210>3

<211>33

<212>dna

<213>缺失刪除掉的寨卡病毒ns1的核苷酸序列

<400>

gacggctgctggtatggaatggagataaggccc

<210>4

<211>1038

<212>dna

<213>寨卡病毒ns1缺失突變體核苷酸序列

<400>

catatggttggctgctctgttgacttctctaagaaagaaacccgttgtggtactggcgtgttcatctacaacgatgtagaagcctggcgtgaccgttacaagtaccacccggactctccacgtcgtctggctgctgctgttaaacaggcgtgggaagaaggtatttgtggtatctcttctgtttctcgcatggagaatatcatgtggaagagcgttgaaggtgagctgaacgctatcctggaagagaacggcgtacagctgactgttgtagttggctccgtgaagaatccgatgtggcgtggtccgcagcgtctgccggttccagttaacgagctgccgcacggctggaaggcatggggtaagtcctactttgtacgtgcggctaagaccaataactctttcgttgttgacggtgacaccctgaaagaatgtccgctggagcaccgtgcatggaactctttcctggtggaagatcacggtttcggtgtattccacacttctgtgtggctgaaggttcgtgaggattactccctggaatgcgatccggctgtgatcggcaccgcagtgaagggtcgtgaggctgcgcatagcgatctgggttattggatcgagtctgagaagaacgatacttggcgtctgaagcgtgctcatctgatcgagatgaagacctgtgagtggccgaaatctcatactctgtggactgacggtgtggaggaatctgacctgatcatcccaaagtctctggcaggtccgctgtctcatcacaacacccgtgagggttatcgtacccaggttaaaggtccgtggcattccgaggagctggagattcgtttcgaggagtgtccgggtactaaagtatacgtggaggaaacttgcggcactcgtggtccgtctctgcgttctaccactgcgagcggtcgtgttatcgaagagtggtgctgtcgtgagtgcaccatgccaccactgtccttccgtgctaaacgcaaagagccggaaagcaacctggttcgcagcatggtaactgctggttctctcgag