本發(fā)明屬于納米材料研究領域，具體涉及一種陽離子型的兩親性自組裝短肽及其作為酶響應性藥物載體用于癌細胞靶向給藥的應用。

背景技術：

癌癥是危害人類生命健康的重大疾病之一，嚴重威脅著人類健康。化學藥物療法是腫瘤治療的重要手段，然而目前的抗腫瘤藥物存在靶向性差、毒副作用大等缺點，易破壞人體免疫力，損傷正常機體，使病人產(chǎn)生惡心、嘔吐、脫發(fā)、身體虛弱等癥狀。因此，通過合適的載體選擇將藥物富集于腫瘤組織而避免損傷其它正常組織，從而實現(xiàn)對腫瘤組織的靶向性給藥是當今抗癌藥物研發(fā)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。

多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)，是介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的一類化合物。多肽由天然氨基酸殘基組成，具有非常好的可降解性、生物相容性，且多肽分子可以通過非共價相互作用（如疏水作用、氫鍵、范德華力等）組裝為納米纖維、納米膠束、納米囊泡、納米帶、納米管等各種結(jié)構。近年來，人工設計、合成自組裝多肽的研究成為材料學和生物醫(yī)藥等領域的研究熱點。其中，多肽分子自組裝結(jié)構作為藥物載體有著廣泛的應用前景，通過在其中引入響應性基團或者片段，有望制備出智能型靶向給藥體系。

對于酶響應型材料的設計，多肽具有特殊的優(yōu)勢，通過設計，將含有酶切位點的多肽序列引入到分子中，所得到的材料便具有酶響應活性，從而實現(xiàn)腫瘤的診斷或治療。基質(zhì)金屬蛋白酶（mmps）在多種腫瘤細胞中過量表達，它們能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵性作用，是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中主要的蛋白水解酶。如果能夠?qū)⒖杀籱mps酶解的多肽片段引入自組裝多肽分子，有望制備出對mmps具有響應性的多肽自組裝體系，并用于腫瘤靶向給藥和治療。

現(xiàn)有技術中雖然存在大量多肽自組裝的文獻報道，但是由于多肽自組裝的不可預期性，任何多肽分子細微結(jié)構的變化，都會導致自組裝的失敗，因此如何得到一種能夠自組裝，又具有靶向作用的多肽藥物載體仍然是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有化療藥物難以實現(xiàn)靶向性給藥和具有較高副作用的缺陷，提供一種能夠包結(jié)疏水性癌癥化療藥物分子的多肽自組裝納米藥物載體，該藥物載體具有基質(zhì)金屬蛋白酶的特異響應性、藥物負載量高、癌細胞靶向性給藥效果好且殺傷能力強，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術方案：

本發(fā)明一方面涉及一種多肽，其特征在于其分子結(jié)構為下式所示，或者為下式的類似物：

nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2（nap為萘基）。

本發(fā)明另一方面還涉及上述多肽形成的納米纖維，優(yōu)選的，所述的納米纖維的直徑介于6-8nm之間。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的納米纖維是在磷酸緩沖溶液（pbs）中自組裝形成。

本發(fā)明另一方面還涉及上述納米纖維的酶解納米纖維，所述的酶解是在基質(zhì)金屬蛋白酶存在下發(fā)生的，優(yōu)選的，所述的基質(zhì)金屬蛋白酶為mmp7。

本發(fā)明另一方面還涉及一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括上述多肽以及藥物分子。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的藥物分子為疏水性藥物分子。

對于所述的疏水性藥物分子而言，包括但不限于疏水性抗腫瘤藥物，優(yōu)選的，所述的疏水性藥物分子選自阿霉素和/或紫杉醇。

本發(fā)明還涉及上述藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中的應用。

本發(fā)明另一方面還涉及上述多肽的制備，所述的制備方法為固相合成法。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明多肽分子具有良好的自組裝能力，其自組裝行為呈現(xiàn)出對基質(zhì)金屬蛋白酶的響應性，自組裝體結(jié)構在酶作用下發(fā)生顯著改變。

（2）本發(fā)明多肽分子其自組裝體結(jié)構可以包埋較高量的疏水性藥物，并實現(xiàn)其在酶作用下的控制釋放。

（3）本發(fā)明多肽分子的自組裝結(jié)構作為藥物載體可以實現(xiàn)對癌細胞的靶向性識別和藥物控制釋放，在特定濃度范圍（換算為阿霉素濃度在50?100ng/μl范圍）可實現(xiàn)對癌細胞的選擇性殺傷而對人體細胞不具有毒性，有利于降低化療藥物的副作用。

附圖說明

圖1（a）不同濃度溶液中多肽分子自組裝結(jié)構的負染法透射電鏡形貌：（a）0.25mm，（b）0.5mm和（c）2.0mm多肽溶液的自組裝結(jié)構的；

圖2負染法透射電鏡表征（a）0.5mm多肽分子溶液自身的聚集體結(jié)構和（b）基質(zhì)金屬蛋白酶存在下0.5mm多肽分子溶液中的組裝體結(jié)構；

圖3（a）0.25mm多肽分子溶液自身和（b）基質(zhì)金屬蛋白酶存在下0.25mm多肽分子溶液的質(zhì)譜表征；

圖4負染法透射電鏡表征（a）包埋阿霉素后多肽的自組裝結(jié)構和（b）包埋紫杉醇后多肽的自組裝結(jié)構；

圖5不同類型細胞在不同藥物載體濃度（換算為阿霉素濃度）下的存活率表征。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：多肽和納米纖維的制備

所述多肽的分子結(jié)構如下所示

其分子合成方法如下：

（1）稱取mbha樹脂0.7861g；配制濃度為0.2mol/l的下列物質(zhì)的dmf溶液：a）fmoc-phe-oh體積21ml，質(zhì)量1.63g；b）fmoc-lys(boc)-oh體積21ml，質(zhì)量1.97g；c）fmoc-pro-oh體積11ml，質(zhì)量0.74g；d）fmoc-leu-oh體積21ml，質(zhì)量1.48g；e）fmoc-gly-oh體積11ml，質(zhì)量0.65g；f）fmoc-ala-oh體積11ml，質(zhì)量0.68g；g）fmoc-arg(pbf)-oh體積15ml，質(zhì)量1.95g；h）nap-ch2cooh體積11ml，質(zhì)量0.41g。充分攪拌溶解，氨基酸均以2倍量計算，保證充分反應。

（2）配制下述合成試劑：①活化劑：0.45mol/l，取hbtu8.54g和hobt3.04g溶于50mldmf中；②活化堿：2mol/l，取8.7ml的二異丙基乙胺(diea)和16.3ml的dmf混合；③脫保護劑：體積比20%哌啶及0.1mol/l的hobt溶于dmf中，取哌啶60ml，4.05hobt溶于240mldmf中；④裂解劑：tfa∶tis∶water=95∶2.5∶2.5（體積比），配制15ml溶液。

（3）利用cem公司的liberty微波多肽合成儀應用fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的連接有樹脂的多肽粗產(chǎn)品。

（4）反應完成后將反應液轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶內(nèi)，在35℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去dcm、tfa等殘余液體。用滴管將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的液體逐滴加入7-8倍殘液體積的冰乙醚內(nèi)，靜置產(chǎn)生沉淀后，用高速冷凍離心機在9000rpm、4℃條件下離心10min，反復乙醚沉淀，離心5-6次。除去上層清液，保留沉淀，通風櫥內(nèi)待乙醚揮發(fā)完之后，向沉淀中加超純水，超聲搖勻，放入冰箱中預凍1h，再使用凍干機-60℃冷凍干燥24h左右，即得到純化的產(chǎn)品，密封-20℃保存。

配制多肽分子nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2的磷酸緩沖液（ph7.0，離子強度10mm）溶液，其濃度為0.25mm，0.5mm和2.0mm，室溫放置3天，原子力顯微鏡結(jié)果（圖1）顯示，0.25mm濃度以上多肽分子自組裝為長的納米纖維狀結(jié)構，直徑不隨濃度改變，保持在6.8nm左右。

配制多肽分子nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2的磷酸緩沖液（ph7.0，離子強度10mm）溶液，其濃度為0.25mm，穩(wěn)定后取出500μl溶液向其中加入2ul基質(zhì)金屬蛋白酶（mmp7），37攝氏度水浴恒溫放置3天，透射電鏡結(jié)果顯示0.25mm多肽溶液在沒有加酶條件下依然組裝為直徑7.0nm左右的長纖維（圖2a），而加入mmp7的溶液中，出現(xiàn)許多柔性的細小纖維通過側(cè)向堆積形成的團簇狀結(jié)構，單根纖維的直徑在3.2nm左右。而對上述兩種溶液的質(zhì)譜表征結(jié)果（圖3）顯示，在mmp7存在下，nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2分子（分子量為1557.9）被有效酶解，釋放出含有nap-phe-phe-自組裝基元的片段nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-cooh（其分子量為827.9）。

實施例2：藥物組合物的制備

該方法包括將藥物分子溶液與nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2多肽分子接觸。自組裝結(jié)構對藥物分子的增溶負載：

（1）將1mg鹽酸阿霉素或紫杉醇溶解在1ml二甲基亞砜中，混合30μl三乙胺，室溫條件下避光放置8小時，得到溶液。

（2）取5mgnap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2多肽，加入到500μl上述制備的鹽酸阿霉素二甲亞砜溶液或者紫杉醇二甲基亞砜溶液中，用透析袋（截留分子量1kda）在磷酸緩沖液（ph7.0，離子強度10mm）中透析，每隔3小時換一次緩沖溶液，將未包埋的阿霉素或者紫杉醇清除，24小時候得到包埋有阿霉素或者紫杉醇的納米藥物載體。透射電鏡結(jié)果（圖4）顯示，包載有阿霉素或者紫杉醇的多肽纖維直徑增大，變?yōu)?0?11nm。

（3）將包埋有阿霉素或者紫杉醇的納米藥物載體溶解于2ml二甲基亞砜中，利用紫外分光光度計測訂阿霉素或者紫杉醇濃度（對阿霉素吸收峰定在480nm，對紫杉醇吸收峰定在227nm）進一步通過如下公式計算藥物載體對阿霉素或者紫杉醇的負載效率：藥物載體對阿霉素的負載效率=（阿霉素濃度×溶液體積/阿霉素原始加入量）×100%，測得藥物載體對阿霉素的負載效率為45.2%，對紫杉醇的載藥效率為28.7%。

實施例3：細胞實驗

（1）細胞實驗：首先在無菌的96孔板中接種100ul密度為1×10⁵cells/ml的hela（宮頸癌細胞）、a549（非小細胞肺癌細胞）、nih3t3（小鼠胚胎成纖維細胞）和cos7（猴腎成纖維細胞）細胞，置于37℃培養(yǎng)箱中24h，待其貼壁后將孔板中的培養(yǎng)液吸出，向每個孔中加入100ul新鮮培養(yǎng)液和不同體積的包埋有阿霉素的多肽納米載體溶液，每個濃度設立4個平行absdrug，另外用只加緩沖液tris不加多肽的孔作為對照組abstris，之后將孔板重新置于37℃培養(yǎng)箱中24h，作用完成后，向每個孔中加入20ul濃度為5mg/ml的mtt溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后將孔板中的液體吸出，在每個孔中加入150ul的dmso，并向空白孔中加入等量的dmso作為調(diào)零孔absblank，然后將孔板置于搖床上震蕩10min使之充分混勻，最后用酶標儀測定570nm處的吸光值。細胞存活率的計算公式為：

survivalratio=1-(abstris-absdrug)/(abstris-absblank)。

圖5可以看出，在不同細胞系中加入藥物載體載藥阿霉素體系，在50?100ng/μl阿霉素濃度范圍，正常細胞（nih3t3和cos7）存活率保持在90%以上，也就是說，藥物載體在此濃度范圍對正常細胞基本沒有毒性；而癌細胞（hela和a549）存活率低于40%，也就是說藥物載體在此濃度范圍可以顯著殺傷腫瘤細胞。結(jié)果說明，nap-phe-phe-gly-pro-leu-gly-leu-ala-arg-lys-arg-lys-nh2作為藥物載體可以實現(xiàn)對癌細胞的靶向性藥物輸送和釋放，具有非常好的選擇性殺傷能力。

以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應該說明的是，以上實施例只能用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領域技術人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。