本申請是2013年6月13日提交的發(fā)明名稱為“在蛋白純化過程中滅活病毒的方法”的第201380034780.5號中國專利申請的分案申請。
相關(guān)申請
本申請要求2012年6月29日提交的美國臨時(shí)專利申請no.61/666,145的優(yōu)先權(quán)，該申請的完整內(nèi)容整體援引加入本文。
本發(fā)明提供用于在蛋白純化過程中滅活病毒的在線(in-line)方法。
背景技術(shù)：
大規(guī)模和經(jīng)濟(jì)純化治療性蛋白，特別是單克隆抗體對于生物技術(shù)工業(yè)是日益重要的問題。通常，蛋白通過細(xì)胞培養(yǎng)，利用改造為產(chǎn)生所關(guān)注的蛋白如單克隆抗體的哺乳動物或細(xì)菌細(xì)胞系產(chǎn)生。然而，一旦產(chǎn)生，必須分離蛋白與各種雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、內(nèi)毒素、病毒、dna等。
在典型的純化過程中，一旦在細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)所關(guān)注的蛋白，則將細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)料進(jìn)行澄清步驟以除去細(xì)胞碎片。然后將包含所關(guān)注蛋白的澄清細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)料進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)色譜步驟，其可以包括親和色譜步驟或陽離子交換色譜步驟。為了確保所關(guān)注蛋白的安全性，特別是在治療性候選物的情況下，必須在純化過程中滅活可能存在于包含所關(guān)注蛋白的樣品中的任何病毒。通常，病毒滅活在色譜步驟之后進(jìn)行(例如，親和色譜之后或陽離子交換色譜之后)。通常，在大規(guī)模方法中，在色譜步驟之后，在大罐或存儲罐中收集包含所關(guān)注蛋白的洗脫混合物，然后進(jìn)行病毒滅活步驟/過程，進(jìn)行延長的時(shí)間段同時(shí)混合，這可以持續(xù)數(shù)小時(shí)至一天或者更長，以實(shí)現(xiàn)可能存在于洗脫混合物中的任何病毒的完全滅活。
本領(lǐng)域中已知一些病毒滅活技術(shù)，包括溫度、ph、輻射和暴露于某些化學(xué)物質(zhì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供在蛋白純化過程中滅活病毒的方法，所述方法相對于目前工業(yè)上在蛋白純化期間使用的方法具有若干優(yōu)勢。特別地，本文所述的方法在蛋白純化過程中無需使用大罐或存儲罐來進(jìn)行病毒滅活步驟，減少病毒滅活所需的整體時(shí)間以及在蛋白純化過程中運(yùn)行病毒滅活操作所需的整體物理空間，這又減少整個(gè)純化過程的整體占用空間(footprint)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于在純化過程中滅活樣品中的一種或多種病毒的方法，其中所述方法包括在所述樣品從第一單元操作流向第二單元操作時(shí)，連續(xù)地將所述樣品與一種或多種病毒滅活劑混合。
在一些實(shí)施方案中，所述第一單元操作包括結(jié)合和洗脫色譜，并且所述第二單元操作包括流過(flow-through)純化過程。示例性結(jié)合和洗脫色譜單元操作包括但不限于a蛋白親和色譜。
在一些實(shí)施方案中，所述流過純化過程包括兩種或更多種選自以下的基質(zhì)：活性炭、陰離子交換色譜介質(zhì)、陽離子交換色譜介質(zhì)和病毒過濾介質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，所述樣品包含a蛋白洗脫物，所述洗脫物包含靶分子。示例性的靶分子包括例如抗體。
在一些實(shí)施方案中，利用一個(gè)或多個(gè)在線靜態(tài)混合器將所述樣品與一種或多種病毒滅活劑混合。在其他實(shí)施方案中，利用一個(gè)或多個(gè)緩沖罐將所述樣品與一種或多種病毒滅活劑混合。當(dāng)時(shí)使用靜態(tài)混合器時(shí)，樣品流在層流范圍。
在一些實(shí)施方案中，一種或多種病毒滅活劑選自酸、鹽、溶劑和去污劑。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在a蛋白洗脫物中滅活一種或多種病毒的方法，其中所述方法包括利用在線靜態(tài)混合器將所述洗脫物與一種或多種病毒滅活劑混合，其中在小于10分鐘或小于5分鐘或小于2分鐘或小于1分鐘內(nèi)完成完全的病毒滅活。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在a蛋白洗脫物中滅活一種或多種病毒的方法，其中所述方法包括利用緩沖罐將所述洗脫物與一種或多種病毒滅活劑混合，其中在小于1小時(shí)或小于30分鐘內(nèi)完成完全的病毒滅活。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于滅活一種或多種病毒的方法，所述方法包括(a)將包含靶蛋白(如抗體)的樣品進(jìn)行a蛋白親和色譜過程，從而獲得洗脫物；和(b)將所述洗脫物連續(xù)轉(zhuǎn)移至在線靜態(tài)混合器以將所述洗脫物與一種或多種病毒滅活劑混合等于或小于10分鐘的時(shí)間段，從而滅活一種或多種病毒。
在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行本文所述的病毒滅活方法的a蛋白洗脫物在以分批模式進(jìn)行的a蛋白親和色譜過程后獲得。在其他實(shí)施方案中，a蛋白親和色譜過程以連續(xù)模式進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)模式包括連續(xù)多柱色譜過程。
在一些實(shí)施方案中，一種或多種病毒滅活劑酸用于進(jìn)行溶液改變。
在一些實(shí)施方案中，在病毒滅活后，將洗脫物連續(xù)轉(zhuǎn)移至流過純化過程步驟，從而來自靜態(tài)混合器的產(chǎn)出直接流入流過純化步驟，其可以包括使用兩種或更多種選自以下的基質(zhì)：活性炭、陰離子交換介質(zhì)、陽離子交換介質(zhì)和病毒過濾介質(zhì)。
在其他實(shí)施方案中，在病毒滅活后，在進(jìn)行下一單元操作或過程步驟之前，例如流過純化過程步驟或陽離子結(jié)合和洗脫色譜步驟，將洗脫物在混合或存儲罐中存儲延長的時(shí)間段(例如，12-24小時(shí)或過夜)。
在本文所述的一些實(shí)施方案中，本文所述的病毒滅活方法是更大的蛋白純化過程的一部分，所述純化過程可以包括若干步驟，包括但不限于例如在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)表達(dá)蛋白的細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行澄清，其可以使用沉淀、離心和/或深層過濾中的一種或多種；將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至結(jié)合和洗脫色譜捕獲步驟(例如a蛋白親和色譜)；將a蛋白洗脫物進(jìn)行本文所述的病毒滅活方法；將病毒滅活的產(chǎn)物進(jìn)行流過純化過程，其使用兩種或更多種選自以下的介質(zhì)：活性炭、陰離子交換色譜介質(zhì)、陽離子交換色譜介質(zhì)和病毒過濾介質(zhì)；以及利用滲濾/濃縮和無菌過濾在流過過程中配制來自流過純化步驟的蛋白。這些過程的額外細(xì)節(jié)可以參見例如同時(shí)提交的共同待決申請no.p12/107，其整體內(nèi)容援引加入本文。
在一些實(shí)施方案中，如上文所述，流體樣品連續(xù)地從一個(gè)步驟至下一個(gè)步驟流過整個(gè)過程。
附圖說明
圖1是使用兩個(gè)在線靜態(tài)混合器的病毒滅活的實(shí)驗(yàn)設(shè)定的流程示意圖。所示的設(shè)定包括(a)用于樣品進(jìn)料的蠕動泵，(b)用于遞送酸和堿的兩個(gè)注射泵，(c)兩個(gè)在線ph探針，以及(d)兩個(gè)靜態(tài)混合器。基于要實(shí)現(xiàn)期望ph所需的酸/堿的量以分批模式預(yù)定流速。通過在每個(gè)靜態(tài)混合器之后和在ph探針之前具有合適直徑和長度的管來改變病毒滅活的停留時(shí)間。
具體實(shí)施方式
生物制藥要求滅活或除去病毒(來自源自動物的成分，包括哺乳動物細(xì)胞)以保證藥物安全并滿足食品和藥品監(jiān)督管理局(fda)所列的標(biāo)準(zhǔn)。典型的過程包括一些病毒清理步驟，其累積地提供必需的保護(hù)。
工業(yè)中使用的一些方法包括將包含靶蛋白的溶液滴定至低ph，以便引起任何包裝的病毒和病毒組分的破壞。一般來說，包含靶蛋白的樣品必須在這些條件下保持延長的時(shí)間，因?yàn)椴《緶缁钚枰獣r(shí)間，而且更重要的是確保均勻混合以有效病毒滅活。因此，在大規(guī)模方法的情況下，包含靶蛋白的樣品必須在低ph下溫育延長的時(shí)間，以便常用混合促進(jìn)有效的病毒滅活。參見例如，shuklaetal.,j.chromatographyb.,848(2007)28-39，其描述利用將蛋白樣品在低ph下溫育合適的時(shí)間來進(jìn)行病毒滅活。
建立ph條件作為足以引起滅活的低ph值與避免靶蛋白變性的足夠高的值之間的平衡。此外，必須將樣品暴露一定量的時(shí)間以引起病毒活性值的足夠減少，通常2-6lrv(參見例如，miesegaesetal.,“analysisofviralclearanceunitoperationsformonoclonalantibodies,”biotechnologyandbioengineering,vol.106,pg238-246(2010))。
據(jù)認(rèn)為對于病毒滅活重要的3個(gè)參數(shù)是ph值、暴露時(shí)間和溫度，假設(shè)存在均勻混合。在大規(guī)模方法的情況下，由于大體積以及額外的參數(shù)，例如混合速率和質(zhì)量轉(zhuǎn)移，混合提出了挑戰(zhàn)，也變得重要。
在包含fc區(qū)的蛋白(例如，單克隆抗體)的情況下，通常在從結(jié)合和洗脫色譜加工步驟(例如，a蛋白親和色譜或陽離子交換色譜)洗脫之后進(jìn)行病毒滅活，因?yàn)橄疵摶旌衔锏膒h更接近病毒滅活的可取ph。例如，在現(xiàn)在工業(yè)中使用的方法中，a蛋白色譜洗脫混合物通常具有3.5-4.0范圍中的ph，而陽離子交換結(jié)合和洗脫色譜洗脫混合物通常具有約5.0的ph。
在現(xiàn)在工業(yè)中使用的大多數(shù)方法中，將包含靶蛋白的洗脫混合物調(diào)整至病毒滅活期望的ph并維持一段時(shí)間，已顯示ph和時(shí)間的組合導(dǎo)致病毒滅活。較長的時(shí)間對于病毒滅活更有效，特別是在大規(guī)模方法的情況下，但是，還已知較長時(shí)間引起蛋白破壞。延長暴露于低ph可以導(dǎo)致沉淀和形成聚集體，這是不期望的，并且常需要使用深層濾器和/或無菌濾器以去除這類沉淀和聚集體。
除了低ph誘導(dǎo)的產(chǎn)物質(zhì)量問題，在匯集罐(pooltank)中攪拌也可以引起聚集。適當(dāng)混合是必要的，以便使蛋白混合物(pool)均質(zhì)化，并且當(dāng)需要用酸/堿或緩沖液處理蛋白溶液以調(diào)整ph和/或電導(dǎo)率時(shí)在制備期間特別重要(參見例如，vázquez-reyetal.,“aggregatesinmonoclonalantibodymanufacturingprocesses,”biotechnologyandbioengineering,vol108,issue7,pages1494–1508(2011))。
一些研究已證實(shí)由于單獨(dú)攪拌的剪切可能不引起蛋白聚集，但是可能通過在氣-液界面的存在下攪拌而促進(jìn)(參見，例如，mahleretal.,“proteinaggregation:pathways,inductionfactorsandanalysis,”j.pharm.sci.98(9):2909–2934(2009),harrisonetal.,“stabilityofasingle-chainfvantibodyfragmentwhenexposedtoahighshearenvironmentcombinedwithair–liquidinterfaces,”biotechnol.bioeng.59:517–519(1998))。例如，上述研究已證實(shí)在未完全裝滿的容器中攪拌蛋白時(shí)單鏈fv抗體片段喪失活性的結(jié)果。此外，這些研究證實(shí)在發(fā)酵液中消泡劑的存在下，在發(fā)酵液中蛋白活性未喪失。但是，添加消泡劑可能不是理想的解決方案，特別是因?yàn)樗鼤榧兓椒ㄔ黾宇~外的純化步驟和加工時(shí)間。
本發(fā)明提供新的和改良的在蛋白純化過程中滅活病毒(在本文中也稱作“vi”)的方法，其減少病毒滅活的總時(shí)間、成本以及與蛋白純化過程相關(guān)的總物理空間。
本文所述的方法能夠以連續(xù)方式完成病毒滅活，相對于最常規(guī)的方法，這顯著減少與病毒滅活相關(guān)的時(shí)間，轉(zhuǎn)而減少總純化過程的時(shí)間。
在本文所述的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法采用一個(gè)或多個(gè)在線靜態(tài)混合器來完成病毒滅活。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法采用一個(gè)或多個(gè)緩沖罐來完成病毒滅活。本文所述的方法促使整個(gè)純化過程以連續(xù)方式運(yùn)行，即包含靶蛋白的樣品可以連續(xù)地從一個(gè)加工步驟(或單元操作)流至下一個(gè)加工步驟(或單元操作)，不需要在加工步驟之后停止樣品的流動。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用靜態(tài)混合器可以使來自上游結(jié)合和洗脫色譜加工步驟(例如，a蛋白親和色譜或陽離子交換色譜)的洗脫混合物進(jìn)行在線病毒滅活，并且樣品連續(xù)地流入下一加工步驟(例如，流過純化加工步驟)。因此，不像常規(guī)方法，在移至純化過程中的下一加工步驟之前，洗脫混合物不必與病毒滅活劑在匯集罐或容器中混合或溫育延長的時(shí)間。
值得注意的是，已描述靜態(tài)混合器用于在其暴露于輻射時(shí)混合樣品以滅活病原體(參見例如，美國公開第20040131497號和pct公開第wo2002092806號)，或者利用靜態(tài)混合器混合血液樣品與病毒滅活劑(參見例如，pct公開第wo2004058046號)；但是，看來本領(lǐng)域沒有在蛋白純化過程期間，在樣品從一個(gè)單元操作流至另一個(gè)單元操作時(shí)使用靜態(tài)混合器完成病毒滅活的教導(dǎo)或提示。
本文所述的方法提供優(yōu)于現(xiàn)在工業(yè)中使用的常規(guī)方法的幾個(gè)優(yōu)勢，一些在下文中描述。
本文所述的病毒滅活方法能夠在比最常規(guī)的方法更少的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更有效的包含靶蛋白的樣品與合適的病毒滅活劑(例如，低ph)的混合。
由于較短的加工時(shí)間，最小化任何潛在的對靶蛋白質(zhì)量的不利影響。例如，已證實(shí)延長暴露于低ph條件可以導(dǎo)致影響靶蛋白的質(zhì)量，例如通過引起蛋白聚集以及其他有害變化(參見例如，wangetal.“antibodystructure,instabilityandformulation,”j.pharm.sci.vol.96,pg.1-26(2007))。通過具有較短的暴露于可能對產(chǎn)物質(zhì)量有害的條件的時(shí)間，可以最小化或避免對產(chǎn)物質(zhì)量的任何損傷。
本發(fā)明至少部分基于令人驚訝和出人意料的觀察，甚至當(dāng)樣品的流動在層流范圍中(例如，緩慢流速)時(shí)，仍可以完成有效混合以及有效病毒滅活。具體地，在本文所述的一些方法的情況下，因?yàn)槭褂迷诰€靜態(tài)混合器，可以控制樣品的流速，從而將流速置于層流范圍中。這允許與較高流速相比更可預(yù)測的滅活，這有助于紊流并導(dǎo)致較窄的最佳操作窗口。這個(gè)結(jié)果是出人意料的，因?yàn)橐话銇碚f，需要較高的流速以完成有效混合。
在層流范圍中操作的過程可以更好地控制，因?yàn)榛旌喜灰蕾囉谖闪鞯拇嬖?。例如，如果上游流動條件要求流速減少，則在線混合過程可能落在紊流區(qū)域(regime)外并喪失一些混合效率。但是，如果效率受整個(gè)流動范圍中存在的層流影響，則效率不會受到影響。
本文所述的方法還提供更多對過程參數(shù)的控制。換句話說，因?yàn)楸疚乃龅姆椒ㄌ峁└鄬h條件的控制，所以它們提供更多對整個(gè)過程的控制，并且一般使得能夠進(jìn)行更穩(wěn)健的過程。
除了上述一些優(yōu)勢，本文所述的方法還導(dǎo)致過程的較小物理空間，例如，通過不需要使用匯集罐用于病毒滅活。一般來說，對更靈活的制備方法有不斷增長的需求，所述方法通過減少過程的總物理空間(即，占地面積)來提高效率。本文所述的方法通過用比匯集罐小得多的在線靜態(tài)混合器或緩沖罐代替通常用于病毒滅活的大匯集罐，能夠減少純化方法的總空間。
本文所述的方法使得消除純化方法中的整個(gè)單元操作。例如，如上文所述，一般來說，在大匯集罐中進(jìn)行病毒滅活。在大多數(shù)常規(guī)方法中，將來自上游結(jié)合和洗脫色譜步驟的洗脫物收集在常常沒有任何混合能力的匯集罐中。因此，必須將樣品(即，洗脫混合物)轉(zhuǎn)移至具有混合能力的適當(dāng)匯集罐。然后將ph調(diào)整至期望的值，隨后在期望的ph值下溫育1-2小時(shí)或更長。混合之后，必須將ph再次調(diào)整至適合下一加工步驟的ph，其通常是比用于病毒滅活更高的ph。在使樣品進(jìn)行隨后的步驟之前，一個(gè)(無菌)或兩個(gè)(深層和無菌)過濾步驟還可以用來從病毒滅活樣品去除任何混濁。通常，這些步驟中的每一個(gè)可以進(jìn)行一天，并且構(gòu)成整個(gè)分離單元操作。
在一些實(shí)施方案中，較短的暴露導(dǎo)致較少或沒有混濁，因此不需要隨后的過濾步驟。本文所述的方法通過消除包括使用匯集罐用于病毒滅活的整個(gè)單元操作，顯著簡化常規(guī)純化方法。
本文所述的方法提供更容易的可擴(kuò)展性。擴(kuò)大分批匯集罐系統(tǒng)包括增加穩(wěn)定時(shí)間以及基于深層混合系統(tǒng)(例如，葉輪)的混合效率。例如，如果匯集罐體積增加10倍，則混合效率必須增加10倍以保持相同的混合時(shí)間。同樣，混合時(shí)間應(yīng)當(dāng)最小化以保護(hù)蛋白，同時(shí)應(yīng)當(dāng)最大化以完成一定的lrv滅活。在許多情況下，因?yàn)槿~輪大小和可用電機(jī)rpm的限制，混合器不可以放大至相等的混合效率。本發(fā)明顯著增加混合效率并提供基于稱為reynolds數(shù)(re)的無量綱數(shù)的可擴(kuò)展性，其取決于包括在線靜態(tài)混合器的管道或連接管的面積、流速、液體密度和粘度。reynolds數(shù)定義為密度x靜態(tài)混合器直徑x流速比粘度的比例。可以通過增加靜態(tài)混合器的混合元件的數(shù)量來提高混合效率。更好的可擴(kuò)展性和更多的預(yù)測性能將過程參數(shù)減少至僅ph和時(shí)間，并且消除對混合成功效率的依賴性。
如本文所述，在線靜態(tài)混合允許在非常短的時(shí)間內(nèi)改變?nèi)芤?，從而消除許多穩(wěn)定時(shí)間。這允許壓縮整個(gè)過程，并且導(dǎo)致為了放大和設(shè)計(jì)目的合理的工作體積。通過t-閥或歧管系統(tǒng)將病毒滅活流體引入主流可以改變樣品流體的特性。一旦流體處于新的期望條件中，可以通過增加管的長度或直徑或這兩者來增加在靜態(tài)混合器之后的管中的停留時(shí)間，保證需要的在滅活ph下的停留時(shí)間。在需要的停留時(shí)間結(jié)束時(shí)，可以進(jìn)行第二修改以使流體回到對于蛋白和下一加工步驟期望的條件。
如本文更詳細(xì)描述的，本文所述的病毒滅活方法促進(jìn)以連續(xù)方式運(yùn)行的純化方法。
為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。額外的定義在整個(gè)詳細(xì)說明書中示出。
i.定義
如本文所用，術(shù)語“靜態(tài)混合器”指用于混合兩種流體材料的裝置，所述流體材料通常為液體(例如，包含靶蛋白的樣品或者來自結(jié)合和洗脫色譜加工步驟的洗脫物)。所述裝置通常包括圓柱形(管)外罩中包含的混合器元件(也稱作非移動元件)?？傁到y(tǒng)設(shè)計(jì)并入將兩個(gè)液流遞送入靜態(tài)混合器的方法。當(dāng)流通過混合器時(shí)，靜態(tài)混合器的非移動元件連續(xù)混合材料。完全混合取決于許多變量，包括流體的特性、管的內(nèi)徑、混合器元件的數(shù)量和它們的設(shè)計(jì)。在本文所述的各種實(shí)施方案，在線使用靜態(tài)混合器。
術(shù)語“在線”或“在線操作”指移動液體樣品通過管或一些其他導(dǎo)管而不在容器中儲存的過程。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在管中的“在線操作”中使用靜態(tài)混合器，通過所述管，包含靶蛋白的液體樣品從一個(gè)加工步驟移動至另一個(gè)加工步驟。
術(shù)語“病毒滅活”或“vi”指以這樣的方式處理包含一種或多種病毒的樣品：所述一種或多種病毒不再能復(fù)制或被失活。病毒滅活可以通過物理方式完成，例如加熱、紫外線、超聲振動，或者利用化學(xué)方式，例如ph改變或添加化學(xué)物質(zhì)。病毒滅活通常是在大多數(shù)蛋白純化方法中使用的加工步驟，特別是在純化治療性蛋白的情況下。在本文所述的方法中，利用一個(gè)或多個(gè)在線靜態(tài)混合器或緩沖罐進(jìn)行vi。應(yīng)當(dāng)理解，利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定和本文所述的那些測定不能檢測樣品中的一種或多種病毒是在用一種或多種病毒滅活劑處理樣品之后，所述一種或多種病毒完全滅活的指示。
術(shù)語“病毒滅活劑(virusinactivatingagent)”或“病毒滅活劑(virusinactivatingagent)”指能夠使得一種或多種病毒失活或不能復(fù)制的任何物理或化學(xué)方式。在本文所述的方法中使用時(shí)，病毒滅活劑可以包括溶液條件改變(例如，ph、電導(dǎo)率、溫度等)或者添加溶劑/去污劑、鹽、聚合物、小分子、藥物分子或任何其他合適的實(shí)體等，其與樣品中的一種或多種病毒相互作用，或者物理方式(例如，暴露于uv、震動等)，從而暴露于病毒滅活劑使得一種或多種病毒失活或不能復(fù)制。在一具體實(shí)施方案中，病毒滅活劑為ph改變，其中利用在線靜態(tài)混合器或緩沖罐將病毒滅活劑與包含靶分子的樣品(例如，來自a蛋白結(jié)合和洗脫色譜步驟的洗脫物)混合。
術(shù)語“病毒去除”指處理包含病毒的溶液，從而從所述溶液去除病毒。病毒去除可以通過篩分(例如利用具有適當(dāng)孔徑的納米濾膜)或通過吸附(例如利用具有與病毒相反電荷的介質(zhì)的色譜裝置)來進(jìn)行。
術(shù)語“紊流”指流體的移動，其中流體中的潛流表現(xiàn)紊亂，以不規(guī)則模式移動，但整體流動是在一個(gè)方向。紊流在高速移動的非粘性流體中常見。
術(shù)語“層流”指平滑、有序的流體移動，其中沒有紊流，并且任何給定潛流或多或少與任何其他附近的潛流平行移動。層流在粘性流體中常見，特別是低速移動的那些粘性流體。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，采用層流。
如本文所用，術(shù)語“匯集罐”指任何容器、器皿、貯液器、罐或袋，其在加工步驟之間使用，并且具有的大小/體積使得能夠收集來自加工步驟的整個(gè)體積的產(chǎn)出。匯集罐可以用于盛放或儲存或操作來自加工步驟的整個(gè)體積的產(chǎn)出的溶液條件。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，本文所述的方法避免需要使用一個(gè)或多個(gè)匯集罐。
在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法可以使用一個(gè)或多個(gè)緩沖罐。
如本文所用，術(shù)語“緩沖罐”指在加工步驟之間使用的任何容器或器皿或袋；其中來自加工步驟的產(chǎn)出流過緩沖罐至純化方法中的下一加工步驟。因此，緩沖罐不同于匯集罐，其并不意圖盛放或收集來自加工步驟的整個(gè)體積的產(chǎn)出；而是取而代之使得來自一個(gè)加工步驟的產(chǎn)出能夠連續(xù)流至下一步。在一些實(shí)施方案中，在本文所述方法的兩個(gè)加工步驟之間使用的緩沖罐的體積不超過來自加工步驟的產(chǎn)出的整個(gè)體積的25％。在另一實(shí)施方案中，緩沖罐的體積不超過來自加工步驟的產(chǎn)出的整個(gè)體積的10％。在一些其他實(shí)施方案中，緩沖罐的體積少于生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)物的整個(gè)體積的35％、或者少于30％、或者少于25％、或者少于20％、或者少于15％、或者少于10％，所述生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)物構(gòu)成純化靶分子的起始材料。在一些實(shí)施方案中，如本文所述，病毒滅活通過緩沖罐來完成，其中緩沖罐用于混合合適的病毒滅活劑與包含靶蛋白的樣品(例如，來自a蛋白結(jié)合和洗脫色譜步驟的洗脫物)。
術(shù)語“連接的方法”指用于純化靶分子的方法，其中所述方法包括兩個(gè)或更多個(gè)加工步驟(或單元操作)，互相直接流體連通，從而流體材料在過程中連續(xù)流過加工步驟(或單元操作)，并且在方法的普通操作期間同時(shí)與兩個(gè)或更多個(gè)單元操作接觸。應(yīng)當(dāng)理解，有時(shí)方法中的至少一個(gè)加工步驟(或單元操作)可以通過屏障如處于關(guān)閉位置的閥暫時(shí)從其他加工步驟(或單元操作)分離。這種單獨(dú)單元操作的暫時(shí)分離可以是必需的，例如在加工啟動或關(guān)閉期間或者在去除/置換單獨(dú)單元操作期間。
術(shù)語“a蛋白”和“proa”在本文中可交換使用，并且涵蓋從其天然來源回收的a蛋白，合成制備的a蛋白(例如，通過肽合成或通過重組技術(shù))，以及保留結(jié)合具有ch2/ch3區(qū)如fc區(qū)的蛋白的能力的變體。a蛋白可以商購自repligen,pharmacia和fermatech。一般將a蛋白固定在固相支持材料上。術(shù)語“proa”還指親和色譜樹脂或柱，其包含共價(jià)連接a蛋白的色譜固體支持基質(zhì)。在一具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的a蛋白是堿穩(wěn)定形式的a蛋白。在一具體實(shí)施方案中，a蛋白包括一個(gè)或多個(gè)a蛋白結(jié)構(gòu)域或者其功能變體或片段，如2009年12月18日提交的美國專利申請第us12/653,888號和2012年6月6日提交的第13/489,999號所述，兩者援引加入本文，其涉及野生型多聚體形式的b、z或c結(jié)構(gòu)域或者a蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的多聚體變體(例如，b、z或c結(jié)構(gòu)域五聚體)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有n-端的3或4個(gè)氨基酸截短，其中結(jié)構(gòu)域可以額外地包括突變以減少或消除fab結(jié)合。
用于本發(fā)明的方法的a蛋白的功能衍生物、片段或變體的特征在于對小鼠igg2a或人iggl的fc區(qū)至少k＝10-8m的結(jié)合常數(shù)，并且優(yōu)選k＝10-9m。在本發(fā)明的上下文中，獲得這樣的結(jié)合常數(shù)值的相互作用稱為“高親和結(jié)合”。優(yōu)選地，這樣的a蛋白的功能衍生物或變體包含至少一部分野生型a蛋白的功能igg結(jié)合結(jié)構(gòu)域，選自具有保留的igg結(jié)合功能性的天然結(jié)構(gòu)域e、d、a、b、c或其工程化突變體。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，將a蛋白固定在固體支持物上。
在本文中可交換使用的術(shù)語“固體支持物”、“固相”、“基質(zhì)”和“色譜基質(zhì)”一般指任何種類的固體吸附劑、樹脂或其他固相(例如，膜、無紡布、整體柱等)，其在分離過程中作為吸附劑以分離靶分子(例如，包含fc區(qū)的蛋白如免疫球蛋白)與混合物中存在的其他分子。通常，作為在移動相的影響下，混合物中不同分子遷移通過基質(zhì)的速率差異的結(jié)果，靶分子與其他分子分離?？梢詫⒂蓸渲w粒組成的基質(zhì)放入柱或柱筒中。用于形成基質(zhì)的材料的實(shí)例包括多糖(例如瓊脂糖和纖維素)；以及其他機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)如二氧化硅(例如可控多孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷顆粒以及任何上述材料的衍生物。通?；|(zhì)攜帶一種或多種類型的配體。但是存在其中基質(zhì)單獨(dú)為色譜介質(zhì)的實(shí)例(例如，活性炭、羥基磷灰石、二氧化硅等)。
“配體”是連接至色譜基質(zhì)并決定基質(zhì)的結(jié)合特性的官能團(tuán)。“配體”的實(shí)例包括但不限于離子交換基團(tuán)、疏水相互作用基團(tuán)、親水相互作用基團(tuán)、嗜硫相互作用基團(tuán)、金屬親和基團(tuán)、親和基團(tuán)、生物親和基團(tuán)以及混合模式基團(tuán)(上述基團(tuán)的組合)。在本文中可以使用的一些配體包括但不限于強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)，如磺丙基、磺酸；強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，如三甲基氯化銨；弱陽離子交換基團(tuán)，如羧酸；弱陰離子交換基團(tuán)，如n5n二乙基氨基或deae；疏水相互作用基團(tuán)，如苯基、丁基、丙基、己基；以及親和基團(tuán)，如a蛋白、g蛋白和l蛋白。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，配體為a蛋白或者其變體或片段。
如本文所用，術(shù)語“色譜”指任何種類的技術(shù)，其分離所關(guān)注的產(chǎn)物(例如，治療性蛋白或抗體)與生物制藥制品中的污染物和/或蛋白聚集體。
術(shù)語“親和色譜”指蛋白分離技術(shù)，其中使靶蛋白(例如，所關(guān)注的包含fc區(qū)的蛋白或抗體)特異性地結(jié)合至配體(例如，a蛋白)，通常將所述配體固定在固體支持物上(在本文中，固定在固體支持物上的配體稱作“色譜基質(zhì)”)。靶蛋白一般在色譜步驟期間保留其對配體的特異性結(jié)合親和性，而混合物中的其他溶質(zhì)和/或蛋白不明顯地或特異性地結(jié)合至配體。靶蛋白結(jié)合至固定的配體允許包括污染蛋白或蛋白雜質(zhì)(例如，hcp)在內(nèi)的雜質(zhì)通過色譜基質(zhì)，而靶蛋白仍特異性地結(jié)合至固體支持材料上固定的配體；但是，通常觀察到一些污染蛋白非特異性地結(jié)合到基質(zhì)上。通常用合適的洗滌緩沖液將色譜介質(zhì)洗滌一次或多次，以便在從基質(zhì)洗脫結(jié)合的蛋白之前去除非特異性結(jié)合的蛋白(例如，hcp)和其他雜質(zhì)。隨后利用合適的洗脫緩沖液從基質(zhì)洗脫所關(guān)注的特異性結(jié)合的蛋白，所述洗脫緩沖液促進(jìn)所關(guān)注的蛋白從基質(zhì)分離。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，從這樣的方法消除一個(gè)或多個(gè)中間洗滌步驟，不降低洗脫的靶蛋白的純度。換句話說，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，允許所關(guān)注的蛋白結(jié)合至包含a蛋白的色譜基質(zhì)，隨后將其洗脫，不需要一個(gè)或多個(gè)中間洗滌步驟；但是在a蛋白洗脫混合物中所關(guān)注的蛋白的純度不受影響。在其他實(shí)施方案中，與正常使用一定數(shù)量的洗滌步驟以達(dá)到a蛋白洗脫混合物中一定水平的所關(guān)注的蛋白的純度的方法相比，減少中間洗滌步驟的數(shù)量。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，雖然消除或減少中間洗滌步驟的數(shù)量，但是a蛋白洗脫混合物中宿主細(xì)胞蛋白的水平降低。
在本文中可交換使用時(shí)，術(shù)語“離子交換”和“離子交換色譜”指這樣的色譜方法，其中混合物中所關(guān)注的溶質(zhì)或分析物與連接(例如通過共價(jià)連接)至固相離子交換材料的帶電荷的化合物相互作用，從而所關(guān)注的溶質(zhì)或分析物非特異性地與帶電荷的化合物相互作用，與混合物中的溶質(zhì)雜質(zhì)或污染物相比多或少?；旌衔镏械奈廴救苜|(zhì)比所關(guān)注的溶質(zhì)更快或更慢從離子交換材料的柱洗脫，或者相對于所關(guān)注的溶質(zhì)結(jié)合至樹脂或從樹脂排除?！半x子交換色譜”包括陽離子交換、陰離子交換和混合模式離子交換色譜。例如，陽離子交換色譜可以結(jié)合靶分子(例如，包含fc區(qū)的靶蛋白)，然后洗脫(陽離子交換結(jié)合和洗脫色譜或“ciex”)，或者可以主要結(jié)合雜質(zhì)，而靶分子“流過”柱(陽離子交換流過色譜或“ft-ciex”)。在陰離子交換色譜的情況下，固相材料可以結(jié)合靶分子(例如，包含fc區(qū)的靶蛋白)，然后洗脫，或者可以主要結(jié)合雜質(zhì)，而靶分子“流過”柱。
術(shù)語“離子交換基質(zhì)”指帶負(fù)電荷(即，陽離子交換樹脂)或帶正電荷(即，陰離子交換樹脂)的色譜基質(zhì)。電荷可以通過例如共價(jià)連接將一種或多種帶電荷的配體連接至基質(zhì)來提供?？蛇x地或額外地，電荷可以是基質(zhì)的固有特性(例如，在二氧化硅的情況下，其具有總體負(fù)電荷)。
“陽離子交換基質(zhì)”指帶負(fù)電荷的色譜基質(zhì)，并且其具有游離的陽離子用于與基質(zhì)接觸的水溶液中的陽離子交換。連接至固相以形成陽離子交換基質(zhì)的帶負(fù)電荷的配體可以是例如羧酸鹽或磺酸鹽?？缮藤彽年栯x子交換樹脂包括羧基-甲基-纖維素、固定在瓊脂糖上的磺丙基(sp)(例如，來自gehealthcare的sp-sepharosefastflowtm或sp-sepharosehighperformancetm)以及固定在瓊脂糖上的磺?；?例如來自gehealthcare的s-sepharosefastflowtm)。額外的實(shí)例包括
“混合模式離子交換基質(zhì)”或“混合模式基質(zhì)”指用陽離子和/或陰離子和疏水部分共價(jià)修飾的色譜基質(zhì)?？缮藤彽幕旌夏Ｊ诫x子交換樹脂是bakerbondabxtm(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)，其包含弱陽離子交換基團(tuán)、低濃度的陰離子交換基團(tuán)以及連接至硅膠固相支持基質(zhì)的疏水配體?；旌夏Ｊ疥栯x子交換材料通常具有陽離子交換和疏水部分。合適的混合模式陽離子交換材料為
在本文中術(shù)語“陰離子交換基質(zhì)”指帶正電荷的色譜基質(zhì)，例如具有連接至它的一種或多種帶正電荷的配體，如季氨基?？缮藤彽年庪x子交換樹脂包括deae纖維素、qaesephadextm和fastqsepharosetm(gehealthcare)。額外的實(shí)例包括
在本文中可交換使用的術(shù)語“流過方法”、“流過模式”和“流過色譜”指產(chǎn)物分離技術(shù)，其中生物制藥制品中包含的至少一種所關(guān)注的產(chǎn)物與一種或多種雜質(zhì)預(yù)期流過材料，所述材料通常結(jié)合一種或多種雜質(zhì)，其中所關(guān)注的產(chǎn)物通常流過。
在本文中可交換使用的術(shù)語“結(jié)合和洗脫方法”、“結(jié)合和洗脫模式”以及“結(jié)合和洗脫色譜”指產(chǎn)物分離技術(shù)，其中使生物制藥制品中包含的至少一種所關(guān)注的產(chǎn)物連同一種或多種雜質(zhì)與固體支持物在促進(jìn)所關(guān)注的產(chǎn)物結(jié)合至固體支持物的條件下接觸。隨后從固體支持物洗脫所關(guān)注的產(chǎn)物。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，使具有連接至固體支持物的a蛋白的固體支持物與包含所關(guān)注的產(chǎn)物以及一種或多種雜質(zhì)的樣品在合適的條件下接觸，所述條件促進(jìn)所關(guān)注的產(chǎn)物結(jié)合至固體支持物上的a蛋白，其中預(yù)期所述一種或多種雜質(zhì)不特異性地結(jié)合至固體支持物。隨后從包含a蛋白的固體支持物洗脫產(chǎn)物，嘗試分離所關(guān)注的產(chǎn)物與一種或多種雜質(zhì)。在本文所述的方法中，洗脫之后，如本文所述，利用一個(gè)或多個(gè)靜態(tài)混合器和緩沖罐使a蛋白洗脫混合物進(jìn)行病毒滅活，其中病毒滅活可以在幾分鐘至約一小時(shí)內(nèi)完成，相比之下常規(guī)方法中病毒滅活常需要幾小時(shí)。
在本文中可交換使用的術(shù)語“污染物”、“雜質(zhì)”和“碎片”指任何外源或不期望的分子，包括生物大分子如dna、rna，一種或多種宿主細(xì)胞蛋白，內(nèi)毒素，脂質(zhì)，聚集體以及一種或多種添加劑，其可以存在于包含所關(guān)注的產(chǎn)物的樣品中，所關(guān)注的產(chǎn)物分離自一種或多種外源或不期望的分子。此外，這樣的污染物可以包括用于分離方法之前進(jìn)行的步驟的任何試劑。
在本文中可交換使用的術(shù)語“中國倉鼠卵巢細(xì)胞蛋白”和“chop”指源自中國倉鼠卵巢(“cho”)細(xì)胞培養(yǎng)物的宿主細(xì)胞蛋白(“hcp”)的混合物。hcp或chop一般作為雜質(zhì)存在于包含所關(guān)注的蛋白如cho細(xì)胞中表達(dá)的抗體或包含fc的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基或裂解物中(例如，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(“hccf”))。包含所關(guān)注的蛋白的混合物中存在的chop的量提供所關(guān)注的蛋白的純度的量度。hcp或chop包括但不限于宿主細(xì)胞如cho宿主細(xì)胞表達(dá)的所關(guān)注的蛋白。通常，蛋白混合物中chop的量以相對于混合物中所關(guān)注的蛋白的量的百萬分比表示。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)宿主細(xì)胞為另一細(xì)胞類型時(shí)，例如除cho之外的哺乳動物細(xì)胞、大腸桿菌(e.coli)、酵母、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞，hcp指在宿主細(xì)胞的裂解物中發(fā)現(xiàn)的除靶蛋白之外的蛋白。
術(shù)語“百萬分?jǐn)?shù)”或“ppm”在本文中可交換地用來指通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白的純度的度量。單位ppm指以納克/毫克計(jì)的hcp或chop的量每以毫克/毫升計(jì)的所關(guān)注的蛋白(即，chopppm＝(chopng/ml)/(所關(guān)注的蛋白mg/ml)，其中蛋白在溶液中)。
如本文所用，術(shù)語“澄清(clarify)”、“澄清(clarification)”和“澄清步驟”指用于去除懸浮的顆粒和或膠體的加工步驟，從而減少包含靶分子的溶液的濁度，如測量的以ntu(比濁法濁度單位)計(jì)的。澄清可以通過各種方式實(shí)現(xiàn)，包括離心或過濾。離心可以以分批或連續(xù)模式進(jìn)行，而過濾可以以正常流動(例如深層過濾)或切向流模式進(jìn)行。在現(xiàn)在工業(yè)中使用的方法中，離心之后通常是深層濾器，深層濾器旨在去除離心尚未去除的不溶性雜質(zhì)。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。雜質(zhì)的沉淀可以通過各種方式進(jìn)行，例如通過絮凝、ph調(diào)節(jié)(酸沉淀)、溫度變化、由于刺激響應(yīng)性聚合物或小分子導(dǎo)致的相改變或者這些方法的任何組合。在本文所述的一些實(shí)施方案中，澄清包括離心、過濾、深層過濾和沉淀中的兩種或更多種的任何組合。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法和系統(tǒng)避免需要離心。
在本文中可交換使用的術(shù)語“純化”、“分離(separating)”或“分離(isolating)”指增加來自包含所關(guān)注的蛋白以及一種或多種雜質(zhì)的組合物或樣品的所關(guān)注的多肽或蛋白或者靶蛋白的純度。通常，通過從組合物去除(完全或部分)至少一種雜質(zhì)來增加所關(guān)注的蛋白的純度?！凹兓襟E”可以是導(dǎo)致“均質(zhì)”組合物或樣品的總純化方法的一部分，其在本文中用來指在包含所關(guān)注的蛋白的組合物中包含少于100ppmhcp的組合物或樣品，或者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于10ppm、少于5ppm或少于3ppm的hcp。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所關(guān)注的產(chǎn)物為免疫球蛋白。
術(shù)語“免疫球蛋白”、“ig”或“抗體”(在本文中可交換使用)指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的基本4-多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，例如通過鏈間二硫鍵穩(wěn)定所述鏈，其具有特異性結(jié)合抗原的能力。術(shù)語“單鏈免疫球蛋白”或“單鏈抗體”(在本文中可交換使用)指具有由一條重鏈和一條輕鏈組成的基本2-多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，例如通過鏈間肽接頭穩(wěn)定所述鏈，其具有特異性結(jié)合抗原的能力。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”指包含例如通過β-折疊和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的肽環(huán)(例如，包含3-4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的球狀區(qū)域。基于在“恒定”結(jié)構(gòu)域的情況下在各種類別成員的結(jié)構(gòu)域內(nèi)相對缺少序列變化，或者在“可變”結(jié)構(gòu)域的情況下在各種類別成員的結(jié)構(gòu)域內(nèi)的顯著變化，結(jié)構(gòu)域在本文中進(jìn)一步稱為“恒定”或“可變”的。抗體或多肽“結(jié)構(gòu)域”在本領(lǐng)域中?？山粨Q地稱為抗體或多肽“區(qū)”?？贵w輕鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域可交換地稱為“輕鏈恒定區(qū)”、“輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“cl”區(qū)或“cl”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域可交換地稱為“重鏈恒定區(qū)”、“重鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“ch”區(qū)或“ch”結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域可交換地稱為“輕鏈可變區(qū)”、“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“vl”區(qū)或“vl”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域可交換地稱為“重鏈可變區(qū)”、“重鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“vh”區(qū)或“vh”結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白或抗體可以是單克隆或多克隆的，并且可以以單體或聚合物形式存在，例如以五聚體形式存在的igm抗體和/或以單體、二聚體或多聚體形式存在的iga抗體。術(shù)語“片段”指包含比完整或完全抗體或抗體鏈少的氨基酸殘基的部分(part)或部分(portion)抗體或抗體鏈?？梢酝ㄟ^化學(xué)或酶促處理完整或完全抗體或抗體鏈來獲得片段。還可以通過重組方式獲得片段。示例性片段包括fab、fab’、f(ab’)2、fc和/或fv片段。
術(shù)語“抗原結(jié)合片段”指結(jié)合抗原或與完整抗體(即，與它們來源的完整抗體)競爭抗原結(jié)合(即，特異性結(jié)合)的免疫球蛋白或抗體的多肽部分。結(jié)合片段可以通過重組dna技術(shù)或者通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割來制備。結(jié)合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fv、單鏈和單鏈抗體。
根據(jù)本文所述方法純化的所關(guān)注的蛋白是包含ch2/ch3區(qū)并因此適合通過a蛋白色譜純化的蛋白。在本文中使用的術(shù)語“ch2/ch3區(qū)”指與a蛋白相互作用的免疫球蛋白分子的fc區(qū)中的那些氨基酸殘基。ch2/ch3區(qū)或包含fc區(qū)的蛋白的實(shí)例包括抗體、免疫粘附素以及包含與ch2/ch3區(qū)或fc區(qū)融合或綴合的所關(guān)注的蛋白的融合蛋白。
在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于純化抗體片段，其為包含fc區(qū)的片段。
術(shù)語“fc區(qū)”和“包含fc區(qū)的蛋白”表示所述蛋白包含免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(如先前定義的ch和cl區(qū))。包含“fc區(qū)”的蛋白可以具有免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能?！癴c區(qū)”如ch2/ch3區(qū)可以選擇性地結(jié)合至親和配體如a蛋白或其功能變體。在一些實(shí)施方案中，包含fc區(qū)的蛋白特異性地結(jié)合a蛋白或者其功能衍生物、變體或片段。在其他實(shí)施方案中，包含fc區(qū)的蛋白特異性地結(jié)合g蛋白或l蛋白，或者它們的功能衍生物、變體或片段。
一般來說，免疫球蛋白或抗體針對所關(guān)注的“抗原”。優(yōu)選地，抗原是生物學(xué)上重要的多肽，并且向患有疾病或病癥的哺乳動物給藥抗體可以在該哺乳動物中導(dǎo)致治療益處。
如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”指獲得自一群基本上均質(zhì)的抗體的抗體，即該群包含的各個(gè)抗體除了少量可能天然存在的突變之外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”表示抗體的特征為獲得自基本上同質(zhì)的抗體群體，并且不應(yīng)當(dāng)理解為要求通過任何特定方法制備抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由kohleretal.,nature256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組dna方法制備(參見例如，美國專利第4,816,567號)?！皢慰寺】贵w”還可以分離自噬菌體抗體文庫，使用clacksonetal.,nature352:624-628(1991)和marksetal.,j.mol.biol.222:581-597(1991)所述的技術(shù)。
單克隆抗體還可以包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定物種的抗體或者屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或者同源，而鏈的剩余部分與來源于另一物種的抗體或者屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或者同源；以及這類抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利第4,816,567號；和morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothiaandleskj.mol.biol.196:901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癴r殘基”是除如本文所定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。
非人(例如，小鼠)抗體的“人源化”形式為嵌合抗體，其包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)殘基被具有期望的特異性、親和性和能力(capacity)的非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基代替。在某些情況下，人免疫球蛋白的fv構(gòu)架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精制抗體的性能。一般來說，人源化抗體包含基本上所有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)，并且所有或基本上所有fr區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些fr區(qū)。人源化抗體可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見jonesetal.,nature321:522-525(1986)；riechmannetal.,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。
“緩沖液”是通過其酸-堿綴合組分的作用抗ph變化的溶液?？梢岳绺鶕?jù)期望的緩沖液ph采用的各種緩沖液描述于buffers.aguideforthepreparationanduseofbuffersinbiologicalsystems,gueffroy,d.,ed.calbiochemcorporation(1975)。緩沖液的非限制性實(shí)例包括mes、mops、mopso、tris、hepes、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和銨鹽，以及這些緩沖液的組合。
如本文所用，術(shù)語“溶液”、“組合物”或“樣品”指所關(guān)注的分子或靶蛋白(例如，包含fc區(qū)的蛋白如抗體)以及一種或多種雜質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行本文所述的病毒滅活方法之前，使樣品進(jìn)行澄清步驟和a蛋白親和色譜步驟。在一些實(shí)施方案中，樣品包含細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料，例如來自cho細(xì)胞培養(yǎng)物的進(jìn)料，在病毒滅活之前使其進(jìn)行澄清和a蛋白色譜步驟。
如本文所用，術(shù)語“非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)”指用來產(chǎn)生治療性蛋白的所有宿主細(xì)胞或生物體，其中所述宿主細(xì)胞或生物體是非人來源的。非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例為大腸桿菌和畢赤酵母(pichiapastoris)。
如本文所用，術(shù)語“洗脫物”或“洗脫混合物”指包含例如結(jié)合和洗脫色譜之后通過洗脫獲得的所關(guān)注的分子的溶液(例如，利用a蛋白親和色譜基質(zhì))?？梢允瓜疵撐镞M(jìn)行一個(gè)或多個(gè)額外的純化步驟。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，獲得洗脫混合物，其包含靶蛋白，例如包含fc區(qū)的蛋白，其中如本文所述，使洗脫混合物進(jìn)行病毒滅活。
術(shù)語“電導(dǎo)率”指水溶液在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)流動。因此，隨著水溶液中存在的離子量的增加，溶液會具有較高的電導(dǎo)率。測量電導(dǎo)率的單位為毫西門子(milliseimens)每厘米(ms/cm或ms)，并且可以利用可商購的電導(dǎo)率計(jì)(例如，由orion銷售)進(jìn)行測量。溶液的電導(dǎo)率可以通過改變其中離子的濃度來改變。例如，可以改變?nèi)芤褐芯彌_劑的濃度和/或鹽(例如nacl或kcl)的濃度以獲得期望的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，修改各種緩沖液的鹽濃度以獲得期望的電導(dǎo)率。
多肽的“pi”或“等電點(diǎn)”指多肽的正電荷平衡其負(fù)電荷的ph。pi可以計(jì)算自多肽連接的糖的氨基酸殘基或唾液酸殘基的凈電荷，或者可以通過等電聚焦來確定。
在本文中可交換使用的術(shù)語“加工步驟”或“單元操作”指在純化過程中使用一種或多種方法或裝置以實(shí)現(xiàn)某種結(jié)果。可以用于純化過程的加工步驟或單元操作的實(shí)例包括但不限于澄清、結(jié)合和洗脫色譜、病毒滅活、流過純化以及配制。應(yīng)當(dāng)理解每個(gè)加工步驟或單元操作可以采用一個(gè)以上的步驟或方法或裝置以實(shí)現(xiàn)該加工步驟或單元操作的預(yù)期結(jié)果。
如本文所用，術(shù)語“連續(xù)方法”指純化靶分子的方法，其包括兩個(gè)或更多個(gè)加工步驟(或單元操作)，從而來自一個(gè)加工步驟的產(chǎn)出直接流入方法中的下一加工步驟，沒有中斷，并且其中兩個(gè)或更多個(gè)加工步驟可以在它們的至少一部分持續(xù)時(shí)間中同時(shí)進(jìn)行。換句話說，在連續(xù)方法的情況下，不必在下一加工步驟開始之前完成加工步驟，但是一部分樣品通常移動通過加工步驟。
在一些實(shí)施方案中，連接不同的加工步驟以連續(xù)方式進(jìn)行操作。在一些實(shí)施方案中，如本文所述，病毒滅活方法構(gòu)成連續(xù)純化方法中的加工步驟，其中樣品連續(xù)地從a蛋白親和色譜步驟流至病毒滅活步驟至所述方法中的下一步，其通常為流過純化加工步驟。
在一些實(shí)施方案中，病毒滅活加工步驟連續(xù)進(jìn)行，即來自先前的結(jié)合和洗脫色譜步驟(即，a蛋白親和色譜)的洗脫物連續(xù)地流入病毒滅活步驟，所述病毒滅活步驟采用一個(gè)或多個(gè)靜態(tài)混合器和/或緩沖罐，之后可以將病毒滅活的洗脫物收集在儲存容器中直至進(jìn)行下一加工步驟。
ii.示例性病毒滅活劑
病毒滅活使得病毒失活或者不能復(fù)制或感染，這非常重要，特別是在靶分子旨在用于治療用途的情況下。因此，通常在蛋白純化過程期間使用病毒滅活，特別是在蛋白旨在用于治療用途時(shí)。
許多病毒包含可以通過化學(xué)改變滅活的脂質(zhì)或蛋白包衣。不是簡單地使病毒失活，一些病毒滅活方法能夠使病毒完全變性。一些更廣泛使用的病毒滅活方法包括例如使用以下一種或多種：溶劑/去污劑滅活(例如用tritonx100)；巴氏滅菌(加熱)；酸性ph滅活；以及紫外線(uv)滅活。還可以組合這些方法中的兩種或更多種；例如，在升高的溫度下進(jìn)行酸性ph滅活。
用于生物技術(shù)產(chǎn)物的幾種病毒滅活劑是本領(lǐng)域已知的。參見例如，gailsofer,“virusinactivationinthe1990s—andintothe21stcentury,part4,culturemedia,biotechnologyproducts,andvaccines,”biopharminternational,january2003,pp.50-57)，其中一些在下文中描述。
已證實(shí)低ph滅活異嗜性小鼠白血病病毒(xmulv)。在一研究中，據(jù)發(fā)現(xiàn)ph3.5-4.0在18-26℃下有效，并且對于ph3.7直至ph4.1，在滅活動力學(xué)中觀察到非常少的差異。但是，在2-8℃下，與ph3.7的約30分鐘相比，ph4.1滅活較慢且需要長達(dá)1小時(shí)。此外，對純化的不同靶分子觀察到可變性。例如，一種靶分子使用的滅活時(shí)間為60分鐘，而對于另一種其為120分鐘，此外，在一種靶分子的情況下，病毒xmulv甚至在120分鐘之后仍未完全滅活。蛋白濃度也影響滅活動力學(xué)。在僅緩沖液中，xmulv在120分鐘內(nèi)滅活；添加蛋白阻止用相同的ph、溫度和暴露時(shí)間完全滅活?？磥頊缁钊芤旱碾x子強(qiáng)度減輕增加蛋白濃度的影響。
在另一研究中，在sp2/0或ns0小鼠細(xì)胞系中產(chǎn)生的8種不同單克隆抗體(ms)的情況下，研究低ph用于xmulv和偽狂犬病毒(prv)病毒的滅活。所用的ph值范圍為3.14-3.62，導(dǎo)致約5至6以上的lrv(即在樣品中不可以測量到病毒)。這些數(shù)據(jù)用來支持一般的病毒滅活方法。大部分但并不全是mab的13種產(chǎn)物的不同研究說明ph3.6-4.0在5-60分鐘內(nèi)滅活幾種不同病毒的能力。
已發(fā)現(xiàn)辛酸鹽在mab制備過程中滅活脂質(zhì)包裹的病毒。將包含假單胞菌(pseudomonas)外毒素a-單克隆抗體綴合物和假單胞菌單克隆igm的收獲細(xì)胞培養(yǎng)液各自摻入假單胞菌。單純皰疹病毒-1(hsv-1)和水泡性口炎病毒(vsv)在20℃下于少于60分鐘內(nèi)完全滅活。但是，在5℃下，120分鐘之后顯示vsv僅部分滅活。辛酸鹽的非離子化形式在廣泛ph范圍中維持，并且非離子化形式在0.001-0.07重量％的濃度下在病毒滅活中有效。vsv和痘苗病毒在ph6.3下滅活比hsv-1慢。
去污劑也已用作病毒滅活劑。tritonx-100(0.5％,4℃)在4小時(shí)內(nèi)完全滅活呼吸道合胞病毒(rsv)和弗里德小鼠白血病病毒(frmulv)，不影響許多mab的結(jié)合能力。log10減少值對于frmulv為>3.8，而對于rsv為>5.4。其他數(shù)據(jù)已證實(shí)mulv不被0.1-1％tween滅活。
溶劑/去污劑(s/d)常用于血漿蛋白的病毒滅活。s/d還用于制備重組蛋白和mab期間有包膜病毒的滅活。例如，在制備b-結(jié)構(gòu)域缺失的重組因子viii期間，s/d用于病毒滅活。雖然可能沒有病毒與用于制備的cho細(xì)胞系相關(guān)，但是可以在陽離子交換步驟之后添加s/d。以0.3％tnbp和1％tritonx-100的濃度為目標(biāo)至少30分鐘。已證實(shí)s/d處理完全且快速地滅活測試的全部有包膜病毒，包括副流感-3病毒(pi-3)、xmulv、傳染性牛鼻氣管炎病毒(ibr)和惡性卡他熱病毒(mcf)。(參見，soferetal.,id.)
已建議將β-丙內(nèi)酯用于裸dna疫苗的病毒滅活。據(jù)發(fā)現(xiàn)對于在4℃下16-小時(shí)處理，β-丙內(nèi)酯的初始濃度應(yīng)當(dāng)不超過0.25％以防止喪失基因表達(dá)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，病毒滅活采用將包含靶蛋白的樣品暴露于酸性或低ph。因此，在本文所述的一些實(shí)施方案中，病毒滅活利用靜態(tài)混合器將來自結(jié)合和洗脫色譜步驟的產(chǎn)出或洗脫物(其為病毒滅活的上游)在線暴露于酸性ph。用于病毒滅活的ph通常低于5.0，或者為3.0-4.0。在一些實(shí)施方案中，ph為3.6或更低。當(dāng)使用在線靜態(tài)混合器罐時(shí)，用于病毒滅活的持續(xù)時(shí)間為10分鐘或更少，或者5分鐘或更少，或者2分鐘或更少，或者1分鐘或更少。在其他實(shí)施方案中，在結(jié)合和洗脫色譜步驟與流過加工步驟之間使用緩沖罐。當(dāng)使用緩沖罐時(shí)，病毒滅活的持續(xù)時(shí)間通常為1小時(shí)或更少，或者30分鐘或更少。在使用在線靜態(tài)混合器或緩沖罐的情況下，病毒滅活使得所述方法能夠連續(xù)運(yùn)行，而不必在匯集罐中收集樣品用于病毒滅活。
iii.示例性病毒和確定病毒滅活
可以通過兩種主要機(jī)制“清除”病毒：去除(例如通過過濾或色譜)或滅活(例如低ph、去污劑或輻照)。生物制藥病毒清除的監(jiān)管建議可以在fda和emea發(fā)布的幾個(gè)文件中找到。
利用單獨(dú)單元操作的縮小版本評價(jià)方法的病毒清除能力。向代表性加工進(jìn)料的樣品“摻入”已知量的病毒以模擬病毒污染，并且測量通過操作去除或滅活的病毒的量。建議用于摻入的病毒的應(yīng)當(dāng)“盡可能高以確定制備步驟充分滅活/去除病毒的能力”。但是，病毒摻入體積不必很大而顯著改變制備材料的組成；一般認(rèn)為10％摻入體積是最大可接受的摻入。
一般利用定量感染性病毒顆粒的測定從純化過程中單獨(dú)單元操作之前和之后采集的樣品測量病毒。以獲得的log10減少(log減少值或lrv)的報(bào)道的清除。當(dāng)單元操作實(shí)現(xiàn)在加工材料中未檢測到病毒這種程度的清除時(shí)，利用根據(jù)起始進(jìn)料中的病毒滴度和采樣的最終材料的量的計(jì)算確定最小lrv。結(jié)果，通過使用允許高水平的摻入挑戰(zhàn)的高滴度病毒儲液以及增加測定靈敏度的大體積病毒測定，可以提高高度有效的清除步驟可以聲稱的lrv。相反地，當(dāng)進(jìn)料材料為細(xì)胞毒性或干擾檢測細(xì)胞的病毒感染時(shí)，可以降低可證實(shí)的lrv，因?yàn)檫@可能需要樣品稀釋，這降低測定靈敏度。
本領(lǐng)域已知幾種方法測定病毒感染性。組織培養(yǎng)感染劑量50％測定是計(jì)數(shù)樣品中感染性病毒顆粒的數(shù)量的一種這樣的方法。tcid50是在50％接種的培養(yǎng)物中會產(chǎn)生細(xì)胞病理效應(yīng)的病原體(病毒)的量。tcid50值與樣品中感染性病毒粒子的數(shù)量成比例，但不相同。利用這種方法確定的滴度通常報(bào)道為tcid50/ml。
當(dāng)通過測定根本未檢測到病毒時(shí)，利用最低檢測限(lod)計(jì)算確定樣品的最大可能滴度。這個(gè)計(jì)算考慮測定的靈敏度，并且報(bào)道在測定未檢測到任何病毒時(shí)樣品中可以有的最多病毒。這些計(jì)算的結(jié)果是報(bào)道為“≤x”的滴度，表示樣品中的實(shí)際滴度為x或更低(95％置信度)。這種lod計(jì)算僅取決于測試的樣品的量以及測定之前對樣品進(jìn)行的任何預(yù)稀釋。當(dāng)?shù)味葓?bào)道為“≤x”時(shí)，相應(yīng)的log減少值(lrv)報(bào)道為“≥y”，表示所得的lrv為y或更高。
設(shè)計(jì)病毒清除驗(yàn)證研究以評價(jià)mab純化方法去除或滅活許多不同種類的病毒的能力。fda推薦使用涵蓋大和小顆粒、dna和rna基因組的幾種模式病毒，以及化學(xué)敏感和抗脂質(zhì)包膜和非包膜的毒株?；驹硎亲C實(shí)強(qiáng)勁清除適當(dāng)多樣化組的病毒提供未檢測的、未知的病毒污染物也會減少至最低水平的保證。符合這些準(zhǔn)則的4種病毒在表1中示出，其總結(jié)了適合mab方法病毒清除驗(yàn)證的模式病毒組的特性(改編自ichq5a)。
表i
一般來說，病毒污染物分為兩大類：已知原始材料中存在的內(nèi)源性病毒，以及可以滲入所述方法的外源物質(zhì)。
本文所述的方法可以用于滅活這兩類病毒。
iv.靜態(tài)混合器
雖然靜態(tài)混合器為了在線混合用于其他工業(yè)，但是它們尚未廣泛用于制藥工業(yè)，以為方法一般以分批模式操作。此外，雖然已描述在線緩沖液混合和稀釋技術(shù)用于蛋白純化方法(例如在technikrom,biorad和gehealthcare提供的商業(yè)系統(tǒng)中)，但是其尚未用于病毒滅活，特別是因?yàn)閷τ诖笠?guī)模方法，病毒滅活一般在匯集罐中進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，許多靜態(tài)混合裝置可以用于本發(fā)明，只要混合器破壞液體流動以使得能夠完全混合。
靜態(tài)混合器可以在一個(gè)管的空間內(nèi)組合兩個(gè)功能：分流和紊流。分流功能通過一系列的偏移亞元件完成，通過所述偏移亞元件，離開一個(gè)元件的流體撞擊偏移90度的下一元件的葉片前緣。紊流是由引起流體旋轉(zhuǎn)的螺旋狀亞元件引起的。紊流是由流體不能隨流動元件層流移動誘導(dǎo)的，并且通過增加的流速擴(kuò)大。這種流體混合功能性的測量以reynolds數(shù)，re給出。在低流速且因此在低re下，靜態(tài)混合器在層流范圍中操作。這種混合功能允許新鮮未反應(yīng)的活化流體如酸性緩沖液更有效地與病毒相互作用，并且通過舊的已用的活化流體消除病毒的堵塞。在分批混合器的情況下，所述方法依賴于清除舊的活化流體并用新的活化流體代替它的效率。
可獲得各種材料的靜態(tài)混合裝置或靜態(tài)混合器(例如，不銹鋼、teflontm、銅)。在選擇本文所述方法中使用的靜態(tài)混合器的材料中，選擇不與流過靜態(tài)混合器的樣品的組分反應(yīng)或引起其中的反應(yīng)的材料是可取的。材料耐用且易于滅菌(例如，通過高壓滅菌或氯處理)也是可取的，特別是如果將樣品給藥至人或其他動物。靜態(tài)混合器可以是不透明或透明的。
在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，靜態(tài)混合器是在靜態(tài)混合器的入口、中間和出口包括ph和質(zhì)量流量控制傳感器的系統(tǒng)的一部分。連續(xù)調(diào)整樣品(例如，來自上游結(jié)合和洗脫色譜步驟的洗脫物)的相對流速、酸和堿以確保期望的ph值?；谝郧爱a(chǎn)生的數(shù)據(jù)范圍使用控制軟件，從而反饋算法可以是基于模型的，因此比傳統(tǒng)系統(tǒng)更有效。例如，入口傳感器集群、ph和流速可以用來確定適當(dāng)?shù)乃崽砑舆M(jìn)料速度(fa)。可以使用額外的控制算法，預(yù)測期望的最終ph值在ph2.0，如果未正確達(dá)到值，則改變泵fa以使流體至正確的值。為了很多原因，這可以發(fā)生，例如，在來自色譜步驟的進(jìn)料內(nèi)有額外的緩沖能力，或者滴定值可以不是線性的。
v.在線靜態(tài)混合器進(jìn)行病毒滅活的方法
如上文所述，在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在線靜態(tài)混合器用來完成有效的病毒滅活。
為了使得能夠進(jìn)行連續(xù)方法的低ph連續(xù)病毒滅活，如本文所述，利用三通閥將來自純化方法中先前的結(jié)合和洗脫色譜步驟的洗脫物與酸(通常1-3m乙酸)在線混合并通過靜態(tài)混合器。選擇靜態(tài)混合器尺寸以使得能夠有效混合酸和產(chǎn)物流。為了給穩(wěn)健的病毒滅活提供足夠的停留時(shí)間(通常1-5min)，足夠體積的管可以在靜態(tài)混合器之后。然后利用三通閥將病毒滅活的流與堿(通常ph11的1-2mtris-堿)混合并通過靜態(tài)混合器以使得能夠混合，將ph增加至連續(xù)方法中下一純化步驟的期望ph，其通常從ph5增加至8。
可以選擇靜態(tài)混合器直徑和元件的數(shù)量以使得能夠根據(jù)總流流速(即進(jìn)料+酸/堿流速)、密度和粘度有效混合。選擇流速以與靜態(tài)混合器(數(shù)量和直徑)選擇結(jié)合來確保足夠的停留時(shí)間。通過保持恒定的reynolds數(shù)，re來進(jìn)行放大。值得注意的是，在本發(fā)明的方法中，維持足夠低的流速，從而re保持在層流范圍中。
vi.利用緩沖罐進(jìn)行病毒滅活的方法
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用緩沖罐完成病毒滅活。
本發(fā)明的病毒滅活方法可以用作任何病毒純化方法的一部分，例如以分批模式進(jìn)行的純化方法或者以連續(xù)模式進(jìn)行的純化方法。
在本文所述的一些實(shí)施方案中，病毒滅活方法是連續(xù)純化方法的一部分，所述連續(xù)純化方法采用幾個(gè)加工步驟(或單元操作)，其存在于病毒滅活方法的上游以及下游。
在一些實(shí)施方案中，通常在蛋白純化方法中于病毒滅活步驟之前進(jìn)行的結(jié)合和洗脫色譜步驟以分批模式進(jìn)行。典型的分批結(jié)合和洗脫色譜操作采用大柱與多次運(yùn)行，通常1-10次，以便加工一批澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料。因此，在一些實(shí)施方案中，一旦已運(yùn)行分批方法，可以收集洗脫混合物并將其泵入緩沖罐以進(jìn)行病毒滅活。在分批結(jié)合和洗脫色譜方法的情況下，多個(gè)緩沖罐可以用于病毒滅活。因?yàn)榫彌_罐的較小體積，完成更有效的混合和病毒滅活。
在一些其他實(shí)施方案中，結(jié)合和洗脫色譜加工步驟以連續(xù)模式進(jìn)行。在一具體實(shí)施方案中，連續(xù)方法為多個(gè)連續(xù)色譜方法，也稱作cmc。
在cmc操作的情況下，通常使用多個(gè)小柱；每個(gè)運(yùn)行幾個(gè)(通常10-50個(gè))循環(huán)以加工一批細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料。因?yàn)樾〉闹笮『痛罅康难h(huán)，cmc方法具有需要病毒滅活的多個(gè)小洗脫物。代替在匯集罐中收集小洗脫物用于病毒滅活，在一些實(shí)施方案中，使用緩沖罐來代替。
如本文所述，緩沖罐的使用更有效地提供更好的溶液同質(zhì)性，因?yàn)橄鄬τ诔Ｒ?guī)方法中使用的匯集罐，其體積更小且混合能力更好。然后將溶液盛放足夠的時(shí)間用于穩(wěn)健的病毒滅活，通常1–30分鐘或1小時(shí)以內(nèi)，即顯著短于使用較大的匯集罐時(shí)需要的時(shí)間。盛放步驟之后，在緩沖罐中將ph和電導(dǎo)率調(diào)整至下一單元操作設(shè)置的期望值。然后將病毒滅活的溶液泵至進(jìn)料下一單元操作。一旦變空，在cmc方法的情況下，用于病毒滅活的緩沖罐可以用來收集隨后的洗脫物?？紤]到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和緩沖罐大小，在cmc方法的情況下，可能僅需要一個(gè)緩沖罐以完成病毒滅活。相似地處理來自多柱方法的單獨(dú)洗脫物用于病毒滅活。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為限制性的。本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請的內(nèi)容以及圖均援引加入本文。
實(shí)施例
實(shí)施例1試管中x-mulv低ph病毒滅活的時(shí)間依賴性
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，通過在低ph下短時(shí)溫育來滅活摻入包含mab的溶液中的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該實(shí)驗(yàn)的目的是了解在包含高濃度的蛋白(抗體)的溶液中完全滅活逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的ph和暴露時(shí)間。在3.1-3.5的ph下確定滅活x-mulv所需的最小時(shí)間。實(shí)驗(yàn)在試管中進(jìn)行。利用靜態(tài)混合器測試的滅活最大實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5分鐘。
所用的樣品為20mg/ml多克隆igg(seracare)，其處于50mm乙酸鈉緩沖液中，ph為5.3。用于避免細(xì)胞毒性從緩沖液的預(yù)稀釋為1/50。為了滿足lrv>4的目標(biāo)，將滴度為7.0tcid50/ml的x-mulv儲備液用于摻入進(jìn)料至6.0logtcid50/ml(～10％摻入)。對于1/50的預(yù)稀釋以及酸化和中和樣品過程中材料～1/5的稀釋(總共1/250)，這導(dǎo)致觀察到>4.44的lrv(假定實(shí)現(xiàn)目標(biāo)摻入水平)。所用的測定介質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)x-mulv滴定介質(zhì)：mccoys+1％fbs、1x青霉素/鏈霉素、1xl-谷氨酰胺、1xneaa。結(jié)果總結(jié)于下文的表ii。
表ii
x-mulvlog減少值(lrv)
結(jié)果清楚地表明，在ph2.85和3.36下，x-mulv于1分鐘內(nèi)被快速滅活至不可檢測的點(diǎn)。在ph7下未觀察到滅活。這些緩沖液中的高蛋白濃度(20mg/mlseracare多克隆igg)不妨礙實(shí)現(xiàn)快速滅活(參見，例如kurtbrorsonetal.“bracketedgenericinactivationofrodentretrovirusesbylowphtreatmentformonoclonalantibodiesandrecombinantproteins,”biotech.bioeng.vol.82,no.3(2003))。
實(shí)施例2對于多克隆和單克隆抗體的試管中x-mulv低ph病毒滅活的時(shí)間依賴性
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，按照實(shí)施例1所述的相同操作，以更好地理解在何種ph下沒有病毒滅活，或者滅活的最小ph。
使用在cho細(xì)胞中產(chǎn)生的多克隆igg(seracare)和兩種單克隆抗體(mab05和mab04)。結(jié)果總結(jié)于下文的表iii，其中具有“≥”的結(jié)果表示在樣品中沒有檢測到病毒。
表iii
表iii中的結(jié)果表明，在ph3.3下，半分鐘足以滅活病毒。將ph升高至3.6將所需的時(shí)間延長至1.1分鐘。ph3.6以上的ph要求10分鐘，而4和以上的ph甚至在1小時(shí)的暴露下也沒有觀察到病毒滅活。
實(shí)施例3通過靜態(tài)混合器的x-mulv低ph病毒滅活的時(shí)間依賴性
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了在高蛋白(mab)進(jìn)料溶液中利用靜態(tài)混合器進(jìn)行的完全逆轉(zhuǎn)錄病毒滅活所需的ph和暴露時(shí)間。
基于實(shí)施例1中的結(jié)果，研究了利用在線靜態(tài)混合器滅活逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能性。當(dāng)溶液通過以將ph降低至3.4而計(jì)算的速率注入酸而流過通道時(shí)，溶液的ph降低。在通道的下游末端，將ph調(diào)回至中性，以用于方法的下一步驟。這個(gè)實(shí)驗(yàn)確定了利用在線技術(shù)滅活x-mulv所需的暴露時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)定如圖1所示。
所用的樣品為ph5.0的20mm乙酸緩沖液中的9.9g/l多克隆igg(seracare)。將摻入病毒的進(jìn)料通過圖1所示的實(shí)驗(yàn)設(shè)定以用于在線ph滅活。設(shè)定由以下組成：(a)蠕動泵用于轉(zhuǎn)移樣品進(jìn)料；(b)兩個(gè)注射泵用于遞送酸和堿；(c)兩個(gè)在線ph探針；和(d)兩個(gè)靜態(tài)混合器。流速基于實(shí)現(xiàn)所關(guān)注的ph所需的酸/堿的量以批量模式預(yù)定。病毒滅活的停留時(shí)間通過在靜態(tài)混合器之后和ph探針之前的具有合適直徑和長度的管改變。結(jié)果總結(jié)于下文的表iv。
表iv
#3部分，連續(xù)模式，每個(gè)90秒進(jìn)行收集以確保4.5min時(shí)間內(nèi)的一致病毒滅活
如表iv所總結(jié)的，在ph3.3下，對于所有時(shí)間點(diǎn)觀察到完全滅活。對于ph3.6，≥1.1min的時(shí)間獲得完全滅活。此外，于停留時(shí)間2.3和2.8min收集的部分在數(shù)據(jù)收集的4.5min的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出完全的病毒滅活，從而表明在線低ph病毒滅活隨時(shí)間是一致的。
實(shí)施例4通過靜態(tài)混合器的x-mulv低ph病毒滅活的時(shí)間依賴性
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了在高蛋白(mab)進(jìn)料溶液中利用靜態(tài)混合器進(jìn)行的完全逆轉(zhuǎn)錄病毒滅活所需的ph和暴露時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)定如圖1所示。
所用的樣品為ph5.3的50mm乙酸鈉緩沖液中的20mg/ml多克隆igg(seracare)。用于避免細(xì)胞毒性從緩沖液的預(yù)稀釋為1/50。為了滿足lrv>4的目標(biāo)，將滴度6.9tcid50/ml的x-mulv儲備液用于摻入進(jìn)料至5.6logtcid50/ml(～10％摻入)。所用的測定介質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)x-mulv滴定介質(zhì)：mccoys+1％fbs、1x青霉素/鏈霉素、1xl-谷氨酰胺、1xneaa。
對于酸化和中和，使用3m乙酸和2mtris緩沖液。還僅利用管(無靜態(tài)混合器)產(chǎn)生對照樣品以直接檢查靜態(tài)混合器的效果。結(jié)果總結(jié)于下文的表v。
表v
如表v所總結(jié)的，對于陽性對照和暴露于ph7的兩個(gè)樣品沒有觀察到病毒滅活，兩個(gè)樣品維持于試管中或者以最大的暴露時(shí)間3min通過靜態(tài)混合器。通過靜態(tài)混合器取的樣品在大于1分鐘的時(shí)間下表現(xiàn)出完全的病毒滅活。靜態(tài)混合器對于病毒滅活是關(guān)鍵的，因?yàn)樵跊]有靜態(tài)混合器的情況下觀察到非常少的滅活。在目標(biāo)ph3.4下，需要至少2分鐘來實(shí)現(xiàn)>4lrv的x-mulv。靜態(tài)混合器自身在中性ph下并不導(dǎo)致任何滅活。
實(shí)施例5在試管中利用辛酸和去污劑的x-mulv病毒滅活的時(shí)間依賴性
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在試管中進(jìn)行病毒滅活以確定使用各種添加劑(例如辛酸和去污劑，如tritonx、tween)及其組合時(shí)的病毒滅活的最小時(shí)間和ph要求。
緩沖液中的純mab以及澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物中的mab用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)。雖然前述添加劑已知為影響病毒滅活，但是這個(gè)實(shí)施例證實(shí)，通過使用靜態(tài)混合器，可以在更短的時(shí)間內(nèi)獲得病毒滅活。這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表vi。
表vi
如表vi所示，在純mab的情況下，除了tween，對于所有使用的添加劑，1分鐘看起來足以完全滅活病毒。在澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物的情況下，僅0.5％的tritonx在1分鐘后實(shí)現(xiàn)了完全的病毒滅活，而辛酸鹽在兩個(gè)ph和鹽度下要求最少5分鐘。
實(shí)施例6利用靜態(tài)混合器，在ph3.6下，鹽和mab濃度對x-mulv病毒滅活的效果
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了mab和鹽濃度對病毒滅活所需的最小時(shí)間和ph的效果。利用20mm乙酸，ph3.2將mab制備為21.8g/l，然后利用10mnaoh滴定至ph5.0。該溶液的電導(dǎo)率為1.4ms/cm。較低的濃度通過用20mm乙酸，ph3.2稀釋，然后利用10mnaoh滴定至ph5來制備。這些溶液的電導(dǎo)率為1.4ms/cm。高鹽溶液通過添加nacl調(diào)節(jié)至250mm的最終克分子濃度。對于病毒滅活，利用在線靜態(tài)混合器設(shè)定，將所有溶液調(diào)至ph3.6。結(jié)果總結(jié)于表vii。
表vii
如表vii所總結(jié)的，最相關(guān)的溶液是具有高濃度的mab和低鹽濃度的溶液，其模擬a蛋白洗脫混合物。對于這樣的樣品，在3.6的ph下，發(fā)現(xiàn)40秒足以完全滅活病毒。
實(shí)施例7ph對利用靜態(tài)混合器的x-mulv病毒滅活的效果
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了ph對利用靜態(tài)混合器的病毒滅活的效果。利用20mm乙酸，ph3.2將igg制備為9g/l，然后利用10mnaoh滴定至ph5.0。然后，利用在線靜態(tài)混合器設(shè)定，將所有溶液調(diào)節(jié)至用于病毒滅活的期望ph。結(jié)果總結(jié)于下文的表viii。
表viii
如表vii所示，在ph3.6下，需要約1分鐘來完全滅活病毒，而在更低的ph下，甚至更短的時(shí)間是足夠的。
實(shí)施例8溫度對利用低ph的x-mulv病毒滅活的效果
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了溫度對病毒滅活的效果。通常，在線病毒滅活特別得益于將溶液暴露于較高的溫度，因此確定溫度對病毒滅活的效果是重要的。
這個(gè)研究中所用的進(jìn)料是20mm乙酸鈉，ph5.0中的9.9g/lseracare多克隆igg。將3等份的25ml各自轉(zhuǎn)移至3個(gè)分別的50ml離心管。向25ml的這個(gè)進(jìn)料中添加1.4ml的3m乙酸，ph2.5，以將ph降至ph3.7。將離心管之一保留在22℃的室溫下。然后將其他兩個(gè)離心管置于設(shè)定為10℃和35℃的水浴中。在平衡時(shí)測量管中液體的溫度和ph(參見，下文表ix)。然后，將10％病毒摻入添加至每個(gè)管中。在指定的時(shí)間點(diǎn)收集5ml樣品，并添加0.4ml的2mtris-堿，ph11.0，以將ph升高至ph7.0。
表ix
表ix中總結(jié)的結(jié)果表明，高溫對于病毒滅活是優(yōu)選的。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，即使具有更高的測量ph，較高的溫度在1分鐘的時(shí)間點(diǎn)實(shí)現(xiàn)完全滅活。
實(shí)施例9使用靜態(tài)混合器來加速ph穩(wěn)定
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了使用靜態(tài)混合器來加速ph穩(wěn)定。通常，期望最小化ph達(dá)到其期望值所需的時(shí)間。
在這個(gè)實(shí)施例中，以各種流速以及管長度和直徑來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有的選擇使得僅實(shí)現(xiàn)層流，即reynolds數(shù)低于100。起始和目標(biāo)的期望ph值分別為5.0±0.1和3.3±0.1。
達(dá)到期望的目標(biāo)ph值所需的時(shí)間記錄為時(shí)間或處理的溶液體積的函數(shù)。體積表示為管的死體積，并且以10ml/min的流速收集數(shù)據(jù)。結(jié)果總結(jié)于下文的表x。
表x
表x中所示的結(jié)果表明，當(dāng)使用更多的靜態(tài)混合器元件時(shí)，ph穩(wěn)定進(jìn)行得更快，同時(shí)仍然保留良好地進(jìn)入層流。
實(shí)施例10a蛋白洗脫物的在線病毒滅活
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，將mab的澄清細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行a蛋白色譜。a蛋白洗脫物收集為10個(gè)分離的部分，跨越約3個(gè)柱體積。每個(gè)部分分別調(diào)節(jié)至兩個(gè)ph值，3.3和3.6。如本文所述，確定將ph降低至期望值所需的酸的量以及隨后將ph升高至期望值所需的堿的量。這些量對于每個(gè)部分是不同的，因?yàn)椴煌康膍ab導(dǎo)致每個(gè)樣品不同的緩沖容量。
然后建立酸和堿的量的模型作為洗脫物體積的函數(shù)。進(jìn)行第二實(shí)驗(yàn)，其中基于建立的模型，將a蛋白洗脫物連續(xù)調(diào)節(jié)至期望的ph。病毒滅活后測量病毒濃度以證實(shí)實(shí)現(xiàn)了病毒滅活。
實(shí)施例11在線病毒滅活對mab質(zhì)量的效果
在這個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中，研究了較短的暴露時(shí)間對于mab產(chǎn)品質(zhì)量的有益效果。利用a蛋白色譜純化兩種單克隆抗體，將樣品收集于試管中，并且立即在各種ph(即ph3、3.3、3.6和4)和時(shí)間(即1、2、5、15和90分鐘)下溫育。
然后，將樣品中和，并通過同大小排阻色譜(sec)和sds凝膠測試聚集體的存在，以及通過弱陽離子交換色譜(wcx-10)測試電荷變體的改變。所得蛋白的性質(zhì)還通過液相色譜/質(zhì)譜(lc/ms)進(jìn)行分析。
根據(jù)本說明書內(nèi)引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)最全面地理解本說明書，所述參考文獻(xiàn)援引加入本文。本說明書內(nèi)的實(shí)施方案提供本發(fā)明中的實(shí)施方案的說明，并且不應(yīng)當(dāng)理解為限制其范圍。技術(shù)人員容易地認(rèn)識到本發(fā)明涵蓋許多其他實(shí)施方案。所有出版物和發(fā)明均整體援引加入本文。如果援引加入的材料與本說明書矛盾或不一致，則本說明書會取代任何這樣的材料。本文中任何參考文獻(xiàn)的引用不是承認(rèn)這類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
除非另有說明，本說明書(包括權(quán)利要求書)中使用的所有表示成分、細(xì)胞培養(yǎng)、處理?xiàng)l件等的量的數(shù)字應(yīng)當(dāng)理解為在所有條件下受到術(shù)語“約”的修飾。因此，除非另有相反的說明，數(shù)值參數(shù)為近似值，并且可以根據(jù)通過本發(fā)明試圖獲得的期望特性而變化。除非另有說明，一系列元素之前的術(shù)語“至少”應(yīng)當(dāng)理解為指該系列中的每個(gè)元素。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到或者能夠利用不超過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同物。所附權(quán)利要求書意圖涵蓋這類等同物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚，可以進(jìn)行本發(fā)明的許多修改和變化而不背離其精神和范圍。本文所述的具體實(shí)施方案僅通過實(shí)例的方式提供，并不意味著以任何方式限制。本發(fā)明的真正范圍和精神通過所附權(quán)利要求書示出，說明書和實(shí)施例僅認(rèn)為是示例性的。