本發(fā)明涉及一種乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯及其應(yīng)用，具體說是一種乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯及其在制備預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病之一，腫瘤患者死亡原因大多為惡性腫瘤晚期轉(zhuǎn)移所致。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞脫離原發(fā)腫瘤，通過各種轉(zhuǎn)移方式，到達繼發(fā)組織或器官得以繼續(xù)增殖生長，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的全過程。腫瘤轉(zhuǎn)移過程十分復(fù)雜，即腫瘤細胞會隨機的從原發(fā)母體瘤灶中脫離出來；隨后分泌出的某些酶將基底膜降解掉之后浸入并在血管的內(nèi)皮細胞中稍作停留；進入人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，并隨著血液到達其他部位的血管壁并且會停留在此處；之后某些腫瘤細胞再透過血管進入到細胞外的基質(zhì)中去，最終在某些組織或者器官處形成能夠轉(zhuǎn)移的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。因此，腫瘤手術(shù)后的“亞健康人”體內(nèi)殘留的循環(huán)腫瘤細胞是將來腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的致命根源。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移的防治面臨著非常嚴峻的挑戰(zhàn)，如何阻斷腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是提高腫瘤治療水平及治愈腫瘤的關(guān)鍵。

目前臨床使用抗腫瘤藥物絕大數(shù)為化療藥物，這些藥物能作用在腫瘤細胞生長繁殖的不同環(huán)節(jié)上，抑制或殺死腫瘤細胞?；熕幬镌跉[瘤細胞的同時，又殺傷正常組織的細胞，尤其是殺傷人體中生長發(fā)育旺盛的血液、淋巴組織細胞等，而這些細胞與組織是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，破壞了人體的免疫系統(tǒng)，癌癥就可能迅速發(fā)展，造成嚴重后果。化療藥物大多缺乏選擇性，體內(nèi)分布廣泛，易引發(fā)毒副作用，導(dǎo)致患者不能耐受，降低藥物療效。因此，近年來人們一直致力于新型抗腫瘤藥物的研究，其中有效抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的藥物是一個新的藥物開發(fā)方向。

救必應(yīng)酸主要存在于中藥救必應(yīng)(ilicisroutundaecortex)中，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗炎、抗病毒、降血糖等。近些年來，救必應(yīng)酸尤以其低毒高效的特點及多樣化的抗癌作用機制日益受到人們重視，顯示出較大的臨床應(yīng)用潛力和良好的應(yīng)用前景。為了進一步提高救必應(yīng)酸的抗腫瘤活性及減少細胞毒性，因此通過對救必應(yīng)酸的結(jié)構(gòu)進行修飾。我們的研究已經(jīng)證明了救必應(yīng)酸具有預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥理活性(專利公開號：cn101856357a)，同時具有降血脂等藥理作用(專利公開號：cn101849950a)；另外，本發(fā)明人研究證明了救必應(yīng)酸氨基酸衍生物具有抗腫瘤的作用(專利公開號：cn102391352b)；救必應(yīng)酸?；苌锞哂锌鼓[瘤的作用(專利公開號：cn102127142b)；本發(fā)明人還研究證明了救必應(yīng)酸與丁二酸酐反應(yīng)生成的衍生物具有防治心血管疾病的作用(專利公開號：cn102140126b)。這些救必應(yīng)酸衍生物相對救必應(yīng)酸母體本身，雖對腫瘤細胞抗癌活性有一定的提高，但未涉及對正常細胞毒性及其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究；本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯跟救必應(yīng)酸對比，其對不同種類腫瘤細胞均具有更顯著的增殖抑制作用，且對正常細胞毒性較低，提示其具有安全、高效和低毒的特點，可望將其應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)防和治療中。鑒于此，以乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯為研究對象，探討其在預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用。

發(fā)明者合成的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯其主要優(yōu)勢在于：乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對腫瘤細胞的抗癌活性明顯優(yōu)于救必應(yīng)酸母體，對正常細胞安全低毒，是一種潛在的高效低毒的抗腫瘤轉(zhuǎn)移候選藥物。因此，發(fā)明者將乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯應(yīng)用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研究，并通過體內(nèi)外實驗探討乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的作用及機制。

在本發(fā)明完成之前，除本發(fā)明人研究外，還沒有文獻報道救必應(yīng)酸的衍生物具有預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，也未發(fā)現(xiàn)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯在制備預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物應(yīng)用的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯在預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。為預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和降低因腫瘤的轉(zhuǎn)移造成的死亡率提供一個新的方向。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

一種具有預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移作用的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯，其結(jié)構(gòu)式如下：

如上所述的一種具有預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移作用的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯由以下方法得到：

1、乙醇提取中藥救必應(yīng)(ilicisroutundaecortex)，經(jīng)純化、分離、堿降解而獲得的救必應(yīng)酸(rotundicacid)。

2、取救必應(yīng)酸2mmol，置圓底燒瓶中，溶于dmf20ml中，加入無水碳酸鉀4mmol，室溫攪拌30分鐘，加入1,2-二溴乙烷4mmol，回流反應(yīng)，tlc檢測反應(yīng)至終點，回收溶劑，乙酸乙酯150ml溶解，用水，飽和食鹽水分別洗滌3次，每次50ml，取乙酸乙酯液，無水硫酸鈉脫水，過濾，回收溶劑，蒸干，干燥，以石油醚-乙酸乙酯＝1:1為展開劑進行硅膠柱分離，合并，回收溶劑，干燥即得乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯(ethane-1,2-bis-rotundicacidester)。

乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯實驗數(shù)據(jù)為：分子量：1003.44，白色粉末，分子式為c62h98o10；¹hnmr(400mhz，dmso)δ:5.21(2h，12-ch)，4.22-4.19(4h，19-oh，3-oh)，3.85(2h，23-oh)，3.63(q，j＝5.4hz，4h，1'-ch2，2'-ch2)，3.47-3.41(2h，3-ch)，3.33(d，j＝10.5hz，2h，23-ch2)，3.07(d，j＝10.5hz，2h，23-ch2)，2.64-2.54(2h，11-ch2)，2.41(2h，18-ch)，1.98-1.79(4h)，1.66-1.45(24h)，1.30(6h，30-ch3)，1.25-1.14(10h)，1.09(6h，27-ch3)，0.96-0.94(2h)，0.87(6h，24-ch3)，0.85(d，j＝6.6hz，6h，29-ch3)，0.64(6h，26-ch3)，0.54(3h，25-ch3)；¹³cnmr(100mhz，dmso)δ：176.70(c-28)，138.16(c-13)，127.54(c-12)，71.72(c-03)，70.67(c-19)，64.86(c-23)，63.75(c-18)，53.41(c-05)，47.75(c-09)，46.78(c-17)，46.67(c-20)，41.91(c-14)，41.46(c-08)，41.19(c-01)，38.14(c-04)，37.24(c-22)，36.32(c-10)，32.33(c-07)，30.87(c-1')，28.12(c-15)，26.65(c-21)，26.40(c-29)，25.88(c-02)，25.18(c-16)，24.12(c-27)，23.26(c-11)，17.68(c-06)，16.58(c-25)，16.24(c-26)，15.53(c-30)，12.63(c-24)。因為結(jié)構(gòu)對稱，所以解析和譜圖顯示的是一半的結(jié)構(gòu)。

上述所述乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯具有預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移作用中，腫瘤包括但不限于肝癌、黑色素瘤。

以上所述的一種具有預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移作用的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯，可用于制備在預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物?？膳c藥學(xué)上可接受的載體共同制成各種劑型：散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、粉針、乳劑、脂質(zhì)體、混懸劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、氣溶膠、粉霧劑、貼劑、栓劑、滴劑或滴丸劑，在治療上也可通過各種給藥方式實現(xiàn)：口服給藥、注射給藥、呼吸道給藥、皮膚給藥、粘膜給藥、腔道給藥等。

本發(fā)明的特點為：對從救必應(yīng)中提取的救必應(yīng)酸為先導(dǎo)化合物進行化學(xué)修飾，得到乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯，經(jīng)藥理實驗證明，具有對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，且活性明顯優(yōu)于母體化合物救必應(yīng)酸。也是首次將乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對腫瘤細胞的抑制作用有較好的選擇性，對正常細胞安全低毒，是一種潛在的高效低毒的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥。

(2)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯能抑制腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)及人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)的粘附。

(3)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯能抑制腫瘤細胞的運動遷移能力。

(4)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯能防治小鼠b16-f10黑色素瘤發(fā)生

肺部轉(zhuǎn)移。

具體實施方式

下面結(jié)合實例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌細胞hepg2的增殖抑制及對正常肝細胞lo2毒性的研究

將處于對數(shù)生長期肝癌細胞hepg2和人正常肝細胞lo2消化后，細胞密度調(diào)整為1×10⁵個/ml，接種于96孔板，每孔100μl，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移去舊的培養(yǎng)基，加入受試藥物(救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯)用培養(yǎng)基將受試藥物存儲液稀釋，設(shè)定不同的濃度，每孔100μl，另設(shè)空白對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。藥物作用24h后，吸棄含藥培養(yǎng)基，于每孔中加入無血清無酚紅培養(yǎng)基100μl，再加入0.5mg/mlmtt的溶液100μl，繼續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)；吸棄96孔板孔內(nèi)上清液，每孔加入100μldsmo，振蕩10min，于570nm波長處在酶標儀上測定各孔光吸收值(od值)，計算細胞成活率(％)＝(用藥組平均od值/空白對照組平均od值)×100％。實驗結(jié)果見表1。

表1救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對hepg2的增殖抑制及對lo2毒性實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌細胞hepg2具有顯著的抑制增殖作用，且具有劑量依懶性，而救必應(yīng)酸效果不明顯；低濃度的(0.25-5μm)乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌細胞hepg2作用24h后的具有一定的增殖抑制作用，其抑制率為10.5％-66.2％；該濃度范圍的lo2細胞的存活率均大于92％，對正常肝細胞lo2毒性較小。在0.25-10μm濃度范圍內(nèi)，乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯的抗癌活性明顯高于救必應(yīng)酸本身，且乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯較救必應(yīng)酸對正常細胞的毒性更低，兼具安全低毒的特點。

實施例2

救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯抑制肝癌細胞hepg2對細胞外基質(zhì)的粘附作用

將保存于-20℃的纖粘蛋白fn(fibronectin)靜置于37℃水浴至完全融解，用無血清培養(yǎng)液，配置成為濃度為10μg/ml的fn工作液。使用100μl/孔fn工作液完全覆蓋于96孔板，室溫放置過夜，輕輕吸去液體。取對數(shù)生長期hepg2細胞，制成單細胞懸液，細胞濃度為5×10⁵/ml，與不同濃度的藥物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μm)混合，接種于fn包被的96孔板中。37℃，5％co2孵育2h后，pbs輕洗3遍，控干后加入mtt的培養(yǎng)液10μl，繼續(xù)孵育4h，棄上清，加入100μldmso，溶解后使用酶聯(lián)檢測儀檢測570nm處的od值。

粘附抑制率(％)＝(1-用藥組平均od值/空白對照組平均od值)×100％。

表2救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯抑制肝癌細胞hepg2對細胞外基質(zhì)的粘附作用

結(jié)果顯示乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯能明顯抑制人肝癌細胞hepg2對fn膠的粘附能力，抑制率為5.9％-56.9％，具有劑量依賴性；而救必應(yīng)酸僅5μm組的抑制效果(16.5％)與對照組比較存在顯著性差異。

實施例3

救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯抑制肝癌細胞hepg2與huvec細胞的粘附實驗

人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離自正常妊辰分娩的臍帶靜脈，進行培養(yǎng)。將處于對數(shù)期的huvec細胞消化后接種于24孔板，待上述24孔板的內(nèi)皮細胞長滿孔板時，用pbs清洗兩三次，然后加入含有內(nèi)皮刺激因子il-1β，濃度為1ng/l的培養(yǎng)基，在37℃，5％co2的條件下孵育4h。4h后取出孔板，用pbs清洗兩三次后，取對數(shù)生長期hepg2細胞，熒光標記后制成4×10⁵/ml^-1單細胞懸液，并加入不同濃度本發(fā)明衍生物的rpm-1640培養(yǎng)液，藥物終濃度分別為：0、0.25、0.2、1.0、2.5、5.0μm，每孔500μl。37℃、5％co2孵育2h后，pbs輕洗3遍，控干后加入無血清培養(yǎng)液500μl。然后在熒光顯微鏡下進行拍照，隨機拍取10個視眼后并記錄每個視眼的細胞數(shù)，計算不同濃度的救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對內(nèi)皮細胞粘附抑制率。

粘附抑制率(％)＝(1-用藥組平均細胞數(shù)/空白對照組平均細胞數(shù))×100％。

表3救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯抑制肝癌細胞hepg2與huvec細胞的粘附實驗

由表3可知，與對照組比較，0.25-5μm的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌hepg2細胞與huvec細胞的粘附的抑制率分別為12.8％，22.9％、37.8％、53.8％、64.8％。而0.25-5μm的救必應(yīng)酸對肝癌細胞hepg2與huvec細胞粘附的抑制作用不明顯；5μm的救必應(yīng)酸對肝癌細胞hepg2與huvec細胞粘附的抑制率僅為15.7％。

實施例4

救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對人肝癌細胞hepg2遷移的影響

選取對數(shù)生長期的hepg2細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度為2×10⁵/ml，以2ml/孔接種于6孔板中，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，細胞單層鋪滿孔板時；pbs輕洗3遍，分別加入救必應(yīng)酸和衍生物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μm)測定距離，培養(yǎng)24h后，測定遷移距離。實驗重復(fù)三次計算細胞遷移抑制率。

細胞遷移抑制率＝[1-(用藥組0h平均距離-用藥組24h平均距離)/(對照組0h平均距離-對照組24h平均距離)]×100％

表4救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對人肝癌細胞hepg2遷移的影響

實驗結(jié)果結(jié)果表明：與對照組相比，5μm的救必應(yīng)酸對肝癌細胞的遷移抑制率為15.6％，對肝癌細胞hepg2的遷移抑制作用不明顯。不同濃度的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌細胞hepg2的遷移抑制作用具有劑量依賴性，隨著濃度的增加，hepg2細胞的遷移率顯著降低；5μm的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對肝癌hepg2細胞作用24h后，細胞的遷移抑制率高達63.8％。

實例5

救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對小鼠黑色素瘤b16-f10細胞人工肺轉(zhuǎn)移瘤形成的抑制作用

取生長期b16-f10細胞，pbs緩沖液調(diào)整細胞濃度至1×10個ml^-1。c57/bl6小鼠尾靜脈注射，每只0.2ml。隨機分為生理鹽水組、實驗組共5組，每組8只。對照組給予生理鹽水，乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯分為低中高三個劑量組，給藥劑量為10mg·kg^-1、20mg·kg^-1、40mg·kg^-1，救必應(yīng)酸(40mg·kg^-1)組。腫瘤接種后次日采用灌胃方式給藥，每只一次給藥0.2ml，每天1次，連續(xù)給藥21d。于給藥結(jié)束后次日脫頸椎處死小鼠，取肺，福爾馬林固定液固定，解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)，按下式計算抑制率。

抑制率＝(1-給藥組平均轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)/生理鹽水組平均轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù))×100

表5救必應(yīng)酸及乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯對小鼠黑色素瘤b16-f10細胞人工肺轉(zhuǎn)移瘤形成的抑制作用

實驗結(jié)果表明，不同劑量的乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯給藥后，與空白對照組比較，可以不同程度的抑制肺轉(zhuǎn)移灶的形成；乙烷-1,2-雙救必應(yīng)酸酯高劑量用藥組對b16-f10細胞的肺轉(zhuǎn)移抑制率高達70.4％；而同劑量組的救必應(yīng)酸用藥組，抑制率僅為23.5％，細胞的肺轉(zhuǎn)移無明顯的抑制作用。