本發(fā)明屬于水產(chǎn)加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種一步酶解制備魚皮抗凍肽的工藝。

背景技術(shù)：

馬鮫魚（Scomberomorus niphonius）屬鱸形目、鲅科、鲅屬，體長而側(cè)扁，鱗甚細(xì)小，外形酷似鮐魚。其廣泛分布于我國黃海、渤海、東海、南海及臺(tái)灣海峽，以黃、渤海產(chǎn)量最高。漁業(yè)資源相當(dāng)豐富，為我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一。且其皮中富含膠原蛋白，為酶解制備抗凍肽提供了良好的原料。

抗凍劑是一類在加入到其他溶液中后，可降低溶液冰點(diǎn)，進(jìn)而提高抗凍效果的物質(zhì)。傳統(tǒng)使用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物，這種抗凍劑雖然具有一定的抗凍效果，但是由于其甜度與熱量較高，不符合“低甜”和“低熱”的消費(fèi)趨勢?？箖鲭氖且活惸軌蛭皆诒П砻?，抑制冰晶的生長和重結(jié)晶的活性肽。它可以降低溶液的冰點(diǎn)，而對(duì)熔點(diǎn)影響甚微，使得冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間產(chǎn)生差值，這稱為熱滯活性。通過熱滯活性，抗凍肽可以保護(hù)生物在低溫下免受凍害。相比商業(yè)抗凍劑，抗凍肽不僅更符合消費(fèi)趨勢，且其抗凍效果優(yōu)于商業(yè)抗凍劑。但當(dāng)下天然抗凍劑的生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜且活性低，耗時(shí)耗資，而本專利的一步酶解技術(shù)制備抗凍肽能夠很好解決生產(chǎn)中的此類問題。目前國內(nèi)外制備抗凍肽的方法，包括傳統(tǒng)的研磨加攪拌的方法，以及近年來的滲透-離心法和先制明膠，再酶解制備抗凍肽的方法。如有的專利利用酸性蛋白酶水解魚皮膠原蛋白制備的抗凍多肽，以魚皮膠原蛋白為原料，通過酸性蛋白酶酶解，再經(jīng)過分離純化得到純化的特異性抗凍多肽；有的專利以鯊魚皮膠原蛋白為原料，通過對(duì)酸性蛋白酶的酶解，分離純化得到特異性抗氧化多肽。一步酶解技術(shù)為直接以魚皮為原料，通過攪碎、勻漿、調(diào)節(jié)體系pH后直接酶解，經(jīng)雙效濃縮和冷凍干燥后獲得具良好抗凍活性的抗凍肽粉末。方法步驟簡單，能很好減少制備抗凍肽步驟，降低抗凍肽的制備成本，且得到的抗凍肽活性和純度較高。

在工藝流程中，酶解可將大分子蛋白分解成小分子多肽，通過控制酶解的條件，能夠得到較為理想的多肽溶液。膜過濾采用膜為過濾的介質(zhì)，在一定壓力下，小分子溶質(zhì)和溶液會(huì)透過膜，而相對(duì)較大的溶質(zhì)分子則會(huì)被截留下來。通過膜過濾，可濾去較多的雜質(zhì)，得到相對(duì)純的抗凍肽溶液。雙效真空濃縮為在真空條件下，采用二效同時(shí)蒸發(fā)，能有效利用二次蒸汽，節(jié)約能耗。其蒸發(fā)速度快，無污染，濃縮效果好，在提高濃縮抗凍肽溶液效率的同時(shí)，又節(jié)約成本。冷凍干燥能夠在低溫、真空的環(huán)境中將冰升華而除去，可很好保持抗凍肽溶液原有的物理和化學(xué)性質(zhì)，而凍干制成的粉末也便于利用。在制備抗凍肽中，相比有的專利采用超聲波處理、使用風(fēng)味蛋白酶酶解后超濾凍干，再和乳糖混合進(jìn)行糖基化反應(yīng)的方法獲得抗凍肽；有的將超聲波處理后的魚皮漿液經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解，再經(jīng)濃縮凍干獲得抗凍肽，本專利采用堿性蛋白酶酶解魚皮，同時(shí)采用雙效濃縮后凍干的方法獲得抗凍肽的方法，能夠在較短時(shí)間內(nèi)制得活性和純度相對(duì)較高的抗凍肽，大大提高了制備高活性抗凍肽的效率。

目前抗凍肽的應(yīng)用相對(duì)較少，其中制備環(huán)節(jié)十分關(guān)鍵，而一步酶解技術(shù)制備抗凍肽，耗時(shí)耗資少，可為抗凍肽的制備提供一種新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種一步酶解制備魚皮抗凍肽的工藝。本發(fā)明的工藝提供了一種低成本、簡便快捷、抗凍肽得率高的魚皮抗凍肽的制備方法，所制得的魚皮抗凍肽添加到魚糜制品中，解決了魚糜制品在凍藏、運(yùn)輸和銷售過程中反復(fù)凍融導(dǎo)致凍裂、析水等關(guān)鍵共性技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種一步酶解制備魚皮抗凍肽的工藝，包括選料、清洗、勻漿、酶解、膜過濾、雙效真空濃縮和凍干步驟；具體步驟如下：

（1）選料：選擇馬鮫魚的魚皮作為抗凍肽提取原料；

（2）清洗：將所取的馬鮫魚皮內(nèi)外用水清洗，控制水溫為4~10℃，去除魚皮內(nèi)側(cè)黏附的多余雜物；

（3）勻漿：將魚皮與水按W/V為1:5混合，置入打漿機(jī)勻漿；

（4）酶解：采用堿性蛋白酶對(duì)步驟（3）得到的魚皮勻漿液進(jìn)行酶解，控制酶與底物比為1:15~1:30，酶解pH 8~9，酶解溫度40~50℃，酶解時(shí)間90~120min，酶解后得到抗凍肽粗溶液；

（5）膜過濾：將步驟（4）得到的抗凍肽粗溶液離心后取上清液，隨后選用截留分子量分別為20kDa、10kDa和5kDa的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行三次超濾，得到抗凍肽溶液；

（6）雙效真空濃縮：將步驟（5）得到的抗凍肽溶液置入雙效真空濃縮器進(jìn)行濃縮，除去溶液內(nèi)過多的水分；

（7）凍干：將步驟（6）濃縮后的抗凍肽溶液放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，得到抗凍肽粉末，在低于30℃的室溫下進(jìn)行保藏。

步驟（5）中三次超濾的條件為：壓力0.10MPa，溫度4℃。

步驟（5）中，經(jīng)三次超濾后所得到的抗凍肽溶液的分子量為1426~1810Da。

步驟（6）中所述雙效真空濃縮器進(jìn)行濃縮的工藝參數(shù)為：一效濃縮真空度0.02~0.06Mpa、抗凍肽溶液溫度72~78℃；二效濃縮真空度0.08Mpa、抗凍肽溶液溫度60℃。

步驟（7）中所述冷凍干燥時(shí)間為20~24h。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為：

（1）本發(fā)明因采用一步酶解技術(shù)，因此涉及的操作步驟少，耗材耗資相對(duì)較低，對(duì)設(shè)備儀器要求也較低；

（2）一步酶解技術(shù)減少了獲得抗凍肽的中間步驟，減少了中間步驟造成的抗凍肽的損失，抗凍肽得率較高，具抗凍活性的抗凍肽分子量區(qū)間為426~1810Da之間；

（3）通過控制酶解過程，獲得了熱滯活性較高的的抗凍肽，其熱滯活性顯著高于豬皮和雞皮。

附圖說明

圖1為抗凍肽與牛血清蛋白（BSA）的升降溫曲線；

圖2為魚皮抗凍肽的DSC熱流曲線圖；

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此實(shí)施。

實(shí)施例1

（1）選料：選擇沿海附近產(chǎn)量較多的馬鮫魚的魚皮作為抗凍肽提取原料；

（2）清洗：將所取的馬鮫魚皮內(nèi)外用水清洗，控制水溫為4℃，去除魚皮內(nèi)側(cè)黏附的多余雜物；

（3）勻漿：將魚皮與水按W/V為1:5混合，置入打漿機(jī)勻漿；

（4）酶解：采用堿性蛋白酶對(duì)魚皮勻漿液酶解，控制酶與底物比為1:15，酶解pH 8，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間90min，酶解后得到抗凍肽粗溶液；

（5）膜過濾：將抗凍肽粗溶液離心后取上清液，在壓力0.10MPa、4℃條件下選用截留分子量分別為20kDa、10kDa和5kDa的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行三次超濾，得分子量為1426Da的抗凍肽溶液；

（6）雙效真空濃縮：膜過濾后的抗凍肽溶液置入雙效真空濃縮器進(jìn)行濃縮，一效濃縮真空度0.02Mpa、抗凍肽溶液溫度78℃；二效濃縮真空度0.08Mpa、抗凍肽溶液溫度60℃，除去溶液內(nèi)過多的水分；

（7）凍干：濃縮后的抗凍肽溶液放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥20h，得到抗凍肽粉末，在低于30℃的室溫下進(jìn)行保藏。

實(shí)施例2

（1）選料：選擇沿海附近產(chǎn)量較多的馬鮫魚的魚皮作為抗凍肽提取原料；

（2）清洗：將所取的馬鮫魚皮內(nèi)外用水清洗，控制水溫為7℃，去除魚皮內(nèi)側(cè)黏附的多余雜物；

（3）勻漿：將魚皮與水按W/V為1:5混合，置入打漿機(jī)勻漿；

（4）酶解：采用堿性蛋白酶對(duì)魚皮勻漿液酶解，控制酶與底物比為1:20，酶解pH 8.5，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間100min，酶解后得到抗凍肽粗溶液；

（5）膜過濾：將抗凍肽粗溶液離心后取上清液，在壓力0.10MPa、4℃條件下選用截留分子量分別為20kDa、10kDa和5kDa的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行三次超濾，得分子量為1650Da的抗凍肽溶液；

（6）雙效真空濃縮：膜過濾后的抗凍肽溶液置入雙效真空濃縮器進(jìn)行濃縮，一效濃縮真空度0.04Mpa、抗凍肽溶液溫度75℃；二效濃縮真空度0.08Mpa、抗凍肽溶液溫度60℃，除去溶液內(nèi)過多的水分；

（7）凍干：濃縮后的抗凍肽溶液放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥22h，得到抗凍肽粉末，在低于30℃的室溫下進(jìn)行保藏。

實(shí)施例3

（1）選料：選擇沿海附近產(chǎn)量較多的馬鮫魚的魚皮作為抗凍肽提取原料；

（2）清洗：將所取的馬鮫魚皮內(nèi)外用水清洗，控制水溫為10℃，去除魚皮內(nèi)側(cè)黏附的多余雜物；

（3）勻漿：將魚皮與水按W/V為1:5混合，置入打漿機(jī)勻漿；

（4）酶解：采用堿性蛋白酶對(duì)魚皮勻漿液酶解，控制酶與底物比為1:30，酶解pH 9，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間120min，酶解后得到抗凍肽粗溶液；

（5）膜過濾：將抗凍肽粗溶液離心后取上清液，在壓力0.10MPa、4℃條件下選用截留分子量分別為20kDa、10kDa和5kDa的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行三次超濾，得分子量為1810Da的抗凍肽溶液；

（6）雙效真空濃縮：膜過濾后的抗凍肽溶液置入雙效真空濃縮器進(jìn)行濃縮，一效濃縮真空度0.06Mpa、抗凍肽溶液溫度72℃；二效濃縮真空度0.08Mpa、抗凍肽溶液溫度60℃，除去溶液內(nèi)過多的水分；

（7）凍干：濃縮后的抗凍肽溶液放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24h，得到抗凍肽粉末，在低于30℃的室溫下進(jìn)行保藏。

性能測試

一、 魚皮抗凍肽熱滯活性分析

采用DSC測定馬鮫魚魚皮抗凍肽的熔融點(diǎn)及結(jié)晶點(diǎn)，以牛血清蛋白（BSA）為空白對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。BSA起始熔化溫度為-1.5℃，并在12.2℃完全熔化；馬鮫魚魚皮抗凍肽-1.4 ℃開始熔化，并在12.4℃完全熔化?？瞻缀蛯?shí)驗(yàn)組的熔點(diǎn)十分接近。BSA在-14.0℃開始結(jié)晶，在-18.3℃時(shí)完全結(jié)晶，其結(jié)晶峰為4.3℃；而魚皮抗凍肽溶液在-18.6℃開始結(jié)晶，在-24.2℃時(shí)完全結(jié)晶，相比BSA魚皮溶液的結(jié)晶峰更寬，為5.6℃。與空白相比，馬鮫魚魚皮抗凍肽不僅有更低的冰點(diǎn)，完全凍結(jié)的時(shí)間也更長。

魚皮抗凍肽熱滯活性的DSC熱流曲線如圖2所示，從圖中可以看出，其保留溫度最佳為-0.1℃，在此保留溫度下其起始結(jié)晶溫度為-1.8℃，由公式1計(jì)算可得熱滯活性為1.7℃。

公式1如下：

二、魚皮抗凍肽氨基酸組成測定

本發(fā)明制得的魚皮抗凍肽的氨基酸組成如表1所示。

表1 魚皮抗凍肽的氨基酸組成

從上表可知，甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸三者含量較其他氨基酸更高，三者之和約占總氨基酸的50%。而馬鮫魚魚皮抗凍肽中甘氨酸含量最豐富，達(dá)29.89%；其次為丙氨酸的 13.47%以及脯氨酸的9.64%。沒有檢測出胱氨酸，缺乏色氨酸。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。