本發(fā)明屬于發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種重組干擾素的基因工程菌的高密度發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

干擾素(interferon，ifn)，是由英國科學(xué)家isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時首先發(fā)現(xiàn)的，是一種細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種作用。其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，類型可分為α、β、γ、ω等幾種。ifn能誘導(dǎo)細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生抗性，它通過干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品。

干擾素是一種很時髦的新藥。據(jù)報道，干擾素越來越神奇了，開始還只是治愈一些流感、肝炎、水痘之類的小毛病，有點小家子氣的味道?，F(xiàn)在對付許多腫瘤、癌癥還有白血病都用上了干擾素，不再是小打小鬧。不但如此，由于它的越來越現(xiàn)代的生產(chǎn)方式，基因工程干擾素也已上市多年了。

但是，要使干擾素成為藥品，進(jìn)入實際應(yīng)用當(dāng)中，必須有足夠的量。那么，如何獲得大量的干擾素呢？人們首先想到，用病毒刺激老鼠，讓它們產(chǎn)生干擾素，再提取出來供人使用，但是這種方法失敗了。原因是干擾素的活動場所很專一，老鼠體內(nèi)產(chǎn)生的干擾素對人不管用。所以最理想的辦法是用人自身產(chǎn)生的干擾素。

人們最初想到的是，通過血液制取干擾素?？上В蓴_素在血液中的含量實在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干擾素，這種生產(chǎn)方式產(chǎn)量低得可憐，自然價格也就十分昂貴。治療一個病人的費用高達(dá)幾萬美元，一般百姓只能望“藥”興嘆，是名副其實的“貴族藥”，干擾素?zé)o法得到普及、推廣。

其實，我們生活的環(huán)境是被微生物包圍著的，時時刻刻都要接觸到許多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少?？茖W(xué)家猜測，人的血液細(xì)胞里本身就存在干擾素。后來研究證明，這種猜測是有道理的，通過精密的血液分析，在人和許多動物的細(xì)胞中都找到了干擾素。

既然蛋白質(zhì)是干擾素的本質(zhì)，那么把制造成這種蛋白質(zhì)的遺傳基因找出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，讓它們代勞進(jìn)行大量生產(chǎn)，也許能行。經(jīng)過科學(xué)家的試驗，干擾素的批量生產(chǎn)便成為可能。1980年，終于實現(xiàn)了干擾素的批量生產(chǎn)，這是美國科學(xué)家的杰作，他們利用dna重組技術(shù)構(gòu)建了生產(chǎn)干擾素的基因工程。

如今，運用基因工程技術(shù)的國家有：美國、日本、法國、比利時、德國、英國以及中國等。通過dna重組、大腸桿菌發(fā)酵等方法，大量獲取各種干擾素。經(jīng)過試驗明，這樣制得的干擾素對乙型肝炎、狂犬病、呼吸道發(fā)炎、腦炎等多種傳染病的病毒都有一定療效。干擾素能減緩癌細(xì)胞的生長，是很有希望的防癌治癌藥物，具有非常誘人的前景。

根據(jù)近幾年來我國禽病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律來看，部分疾病已經(jīng)顯現(xiàn)出其強大的毀滅性，如禽流感、新城疫等疾病的不斷流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。而干擾素在臨床當(dāng)中用于控制疾病起到了其不可替代的作用。

總的來說，目前干擾素在基礎(chǔ)理論和實踐應(yīng)用上仍需要進(jìn)行大量的研究，但相信隨著干擾素進(jìn)入分子生態(tài)學(xué)研究階段，動物干擾素的分子結(jié)構(gòu)、理化特性、生物學(xué)特性、產(chǎn)生和作用機理不斷得到闡明，各種動物干擾素基因得到克隆和表達(dá)，基因工程產(chǎn)品的問世，將給目前嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的疾病，特別是病毒性和腫瘤性疾病的防治帶來新的希望。此外，由于γ干擾素具有較強的免疫調(diào)節(jié)功能，可以開發(fā)用于體質(zhì)弱、免疫功能低下的病畜。目前應(yīng)用干擾素誘生劑和人工干擾素產(chǎn)品治療病毒性疾病取得了一定進(jìn)展，今后一段時間內(nèi)要加快基因工程干擾素產(chǎn)品的商品化研制，制劑類型、途徑、劑量、毒副作用等。相對而言，由中草藥等誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生ifn，因純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研上的應(yīng)用。如在規(guī)模化生產(chǎn)中推廣使用干擾素，必須建立高效生產(chǎn)干擾素體系，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是一條有效的途徑。目前，基于延長干擾素在體內(nèi)的代謝半衰期的長效干擾素研究已經(jīng)獲得了初步成功，干擾素的聚乙二醇化pegylatedinterferon和干擾素與載體脂質(zhì)體liposome-ifn的結(jié)合被認(rèn)為是兩種很好的延長干擾素在體內(nèi)的半衰期、增加其穩(wěn)定性、降低免疫源性的有效手段，這擴(kuò)大了干擾素的應(yīng)用范圍，同時減少了刺激和毒副反應(yīng)的發(fā)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵、補料培養(yǎng)基及補料方法，保證了菌體快速生長代謝所需要的營養(yǎng)條件及外部環(huán)境，大大提高了下罐時的菌體含量及產(chǎn)物產(chǎn)量，菌體含量由現(xiàn)有的25g/l提高到了45g/l。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種重組干擾素基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟：

(1)種子菌活化：將液氮中保存的工作種子菌于37℃水浴解凍，然后kana/菌以1∶1000比例接種于15ml離心管中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速220rpm/min，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間8-9h；

(2)種子菌培養(yǎng)：將活化好的菌種擴(kuò)大轉(zhuǎn)接至500ml三角搖瓶中，繼續(xù)使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速220rpm/min，培養(yǎng)溫度3737℃，培養(yǎng)時間16-17h；

(3)發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按1∶1000接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基是3l，向罐中通入無菌空氣通氣量為9l/min，設(shè)定培養(yǎng)溫度為37℃，機械攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm/min，控制ph為6.8-7.2；

(4)誘導(dǎo)：發(fā)酵2.5-4小時之間，紫外分光光度計測定od600在4-6之間，以1∶500加入iptg10ml；

(5)補料：上罐時補料200ml，誘導(dǎo)后一小時補料500ml，誘導(dǎo)后5小時補料400ml，誘導(dǎo)后21小時補料200ml；

(6)添加消泡劑：不定時查看罐內(nèi)狀態(tài)，有泡沫產(chǎn)生加入幾滴消泡劑，誘導(dǎo)后5小時加入100ml；

(7)查看生長狀態(tài)：自誘導(dǎo)后每隔一小時取樣測定od600，培養(yǎng)24-27小時，待od值開始下降便下罐；

(8)濕菌收集：8500rpm/min，4℃，離心15min，棄上清流沉淀，稱出濕菌重量，正常45---50g/l；

(9)破碎菌體：濕菌中加入破碎液，體積為菌重總數(shù)的六倍，勻質(zhì)完全后超聲機破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min離心30min，棄上清留沉淀；

(10)濕菌中加入洗液，體積為菌重總數(shù)的五倍，勻質(zhì)完全后超聲機破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min離心30min，棄上清留沉淀；

(11)濕菌中加入溶液，體積為菌重總數(shù)的五倍，勻質(zhì)完全后超聲清洗機洗滌，工作20min，靜置隔夜，然后8500rpm/min離心30min，棄沉淀留上清；

(12)超濾復(fù)性濃縮：將最后一次離心留下的上清液使用0.22um孔徑的膜包進(jìn)行超濾復(fù)性收集未通過膜包的上游液體并加入上清液五倍的復(fù)性液，待復(fù)性液復(fù)完，濃縮為1.5l，即為基因工程菌的粗制品；自此完成。

進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的組成為：工業(yè)胰化蛋白胨10g/l，工業(yè)酵母提取物5g/l，nacl10g/l。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：工業(yè)胰化蛋白胨15g/l，工業(yè)酵母提取物10g/l，nacl4g/l，無水葡萄糖4g/l，超純水3l。

進(jìn)一步地，所述補料培養(yǎng)基的組成為：胰化蛋白胨40g/l，磷酸二氫鈉10g/l，酵母提取物20g/l，磷酸氫二鈉200g/l，葡萄糖200g/l，超純水1.5l，naoh4mol/l，消泡劑1ml/l。

進(jìn)一步地，所述破碎液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol。

進(jìn)一步地，所述洗液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol，尿素2mol。

進(jìn)一步地，所述溶液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol，尿素8mol。

進(jìn)一步地，所述復(fù)性液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol。

本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上優(yōu)化了發(fā)酵工藝、補料培養(yǎng)基及補料方法，保證了菌體快速生長代謝所需要的營養(yǎng)條件及外部環(huán)境，大大提高了下罐時的菌體含量及產(chǎn)物產(chǎn)量，菌體含量由現(xiàn)有的25g/l提高到了45g/l，使得生產(chǎn)更加穩(wěn)定，批次之間的時間和可重復(fù)性好，有利于工業(yè)化生產(chǎn)控制。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的步驟示意圖。

圖2：本發(fā)明步驟s3發(fā)酵結(jié)束后的工程菌菌液跑膠結(jié)果圖。

圖3：本發(fā)明步驟s9破碎菌體中菌液加入破碎液破碎離心后廢棄上清的跑膠結(jié)果圖。

圖4：本發(fā)明步驟s10濕菌中加入洗液破碎離心后廢棄上清的跑膠結(jié)果圖。

圖5：本發(fā)明步驟s11濕菌中加入溶液破碎離心后留用上清的跑膠結(jié)果。

圖6：本發(fā)明步驟s12復(fù)性完粗酶體的跑膠結(jié)果圖。

具體實施方式

如圖1所示，一種重組干擾素基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟：

s1：種子菌活化，將液氮中保存的工作種子菌于37℃水浴解凍，然后kana/菌以1∶1000比例接種于15ml離心管中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速220rpm/min，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間8-9h；

s2：種子菌培養(yǎng)：將活化好的菌種擴(kuò)大轉(zhuǎn)接至500ml三角搖瓶中，繼續(xù)使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速220rpm/min，培養(yǎng)溫度3737℃，培養(yǎng)時間16-17h；

s3發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按1∶1000接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基是3l，向罐中通入無菌空氣通氣量為9l/min，設(shè)定培養(yǎng)溫度為37℃，機械攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm/min，控制ph為6.8-7.2，發(fā)酵結(jié)束后的工程菌菌液跑膠結(jié)果如圖2所示。

s4誘導(dǎo)：發(fā)酵2.5-4小時之間，紫外分光光度計測定od600在4-6之間，以1∶500加入iptg10ml；

s5補料：上罐時補料200ml，誘導(dǎo)后一小時補料500ml，誘導(dǎo)后5小時補料400ml，誘導(dǎo)后21小時補料200ml；

s6添加消泡劑：不定時查看罐內(nèi)狀態(tài)，有泡沫產(chǎn)生加入幾滴消泡劑，誘導(dǎo)后5小時加入100ml；

s7查看生長狀態(tài)：自誘導(dǎo)后每隔一小時取樣測定od600，培養(yǎng)24-27小時，待od值開始下降便下罐；

s8濕菌收集：8500rpm/min，4℃，離心15min，棄上清流沉淀，稱出濕菌重量，正常大概45---50g/l；

s9破碎菌體：濕菌中加入破碎液，體積為菌重總數(shù)的六倍，勻質(zhì)完全后超聲機破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min離心30min，棄上清留沉淀，離心后廢棄上清的跑膠結(jié)果如圖3所示。

s10濕菌中加入洗液，體積為菌重總數(shù)的五倍，勻質(zhì)完全后超聲機破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min離心30min，棄上清留沉淀；離心后廢棄上清的跑膠結(jié)果如圖4所示。

s11濕菌中加入溶液，體積為菌重總數(shù)的五倍，勻質(zhì)完全后超聲清洗機洗滌，工作20min，靜置隔夜，然后8500rpm/min離心30min，棄沉淀留上清，菌液加入溶液破碎離心后留用上清的跑膠結(jié)果如圖5所示。

s12超濾復(fù)性濃縮：將最后一次離心留下的上清液使用0.22um孔徑的膜包進(jìn)行超濾復(fù)性收集未通過膜包的上游液體并加入上清液五倍的復(fù)性液，待復(fù)性液復(fù)完，濃縮為1.5l，即為基因工程菌的粗制品；復(fù)性完粗酶體的跑膠結(jié)果如圖6所示，自此完成。

優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基的組成為：工業(yè)胰化蛋白胨10g/l，工業(yè)酵母提取物5g/l，nacl10g/l。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：工業(yè)胰化蛋白胨15g/l，工業(yè)酵母提取物10g/l，nacl4g/l，無水葡萄糖4g/l，超純水3l。

優(yōu)選地，所述補料培養(yǎng)基的組成為：胰化蛋白胨40g/l，磷酸二氫鈉10g/l，酵母提取物20g/l，磷酸氫二鈉200g/l，葡萄糖200g/l，超純水1.5l，naoh4mol/l，消泡劑1ml/l。

優(yōu)選地，所述破碎液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol。

優(yōu)選地，所述洗液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol，尿素2mol。

優(yōu)選地，所述溶液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol，尿素8mol。

優(yōu)選地，所述復(fù)性液的組成為：tris50mmol，甘氨酸0.15mol。

最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此，盡管本說明書參照上述的各個實施例對本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進(jìn)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。