本發(fā)明涉及一種篩選炎性體nlrp3激活劑及抑制劑的熒光細(xì)胞傳感器，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

炎癥是指機(jī)體對于外界刺激而利用系統(tǒng)的活體自制對外界致炎因子產(chǎn)生防御的一種十分重要而又常見的病理過程，起基本病變主要表現(xiàn)為組織的變質(zhì)、滲出和增生，以體表炎癥最為典型，其主要特征為患病部位發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹及局部功能性障礙。正常情況下炎癥反應(yīng)能夠清楚外來物質(zhì)，并使受損組織得以修復(fù)和愈合，但在一些病理情況下，例如有害物質(zhì)持續(xù)存在時，炎癥反應(yīng)反應(yīng)也會導(dǎo)致對自身組織的攻擊，甚至促進(jìn)疾病的發(fā)生。常見的炎癥類疾病有很多，如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、腎小球腎炎、腸胃炎、膿毒癥等，另外炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也具有一定的促進(jìn)作用。炎癥過程中涉及眾多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌、釋放，這些炎癥因子對炎癥過程具有極大的推動作用。研究發(fā)現(xiàn)，長期、慢性持續(xù)性的炎癥是胰島素抵抗、某些心腦血管疾病、糖尿病、阿茲海默癥等慢性疾病的誘因，可是說，炎癥相關(guān)疾病是困擾人類多年的醫(yī)學(xué)難題。

個體反應(yīng)的基礎(chǔ)是細(xì)胞及分子層面的改變，從炎癥的細(xì)胞基礎(chǔ)角度出發(fā)，致炎因素通過激活細(xì)胞內(nèi)特定的受體和通路引發(fā)炎癥因子的釋放，如toll樣受體、nod樣受體，炎癥因子又反過來繼續(xù)刺激參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞。從細(xì)胞和分子層面研究炎癥反應(yīng)有助于我們了解炎癥反應(yīng)的實質(zhì)，更有助于促使我們發(fā)現(xiàn)抗炎藥物及其機(jī)理。nlrp3是nod樣受體家族的一名成員，屬于先天性免疫系統(tǒng)中的模式識別受體，當(dāng)其被激活后，與接頭蛋白asc和半胱天冬酶-1(caspase-1)形成復(fù)合體，該復(fù)合體被稱為炎性小體(inflammasome)3，炎性小體的概念由tschopp研究小組于2002年首次提出，在自2002至今為止的15年時間中，國際上對于炎性小體的研究成果與數(shù)量成指數(shù)型增長，而在國內(nèi)，對于炎性小體相關(guān)疾病、原理的研究相對較少，水平落后于國際同領(lǐng)域研究者。在炎性小體nlrp3這個分子平臺上，白介素-1β(il-1β)被剪切成熟而后釋放出細(xì)胞，炎性小體nlrp3的激活離不開其重要組成部分nlrp3的大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以說，nlrp3的大量轉(zhuǎn)錄和翻譯是炎性小體nlrp3激活并組成聚合體最重要的一步。nlrp3炎性體的激活劑包括病原相關(guān)分子模式和毀壞相關(guān)分子模式，前者包括脂多糖(lps)、病毒dna等，后者則包括三磷酸腺苷(atp)、β-淀粉樣蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，在許多炎癥相關(guān)的疾病中，都存在nlrp3炎性體的激活。以炎性小體為靶點進(jìn)行藥物的篩選是目前抗炎藥物研發(fā)的發(fā)展方向，然而，目前在研究炎性小體3的激活與抑制時，所使用的手段主要是western、rt-pcr等，這些方法操作繁瑣、要求操作者必須具備一定的專業(yè)素質(zhì)，進(jìn)行一次western實驗通常需要兩天時間，抗體等試劑耗材價格昂貴，同一批次處理量少，最多只能操作個位數(shù)個樣本，顯然這樣的方法不適合也無法用于nlrp3干預(yù)劑的篩選。

細(xì)胞是形成有機(jī)體形態(tài)和功能的基本組成單位，對研究機(jī)體結(jié)構(gòu)和探索生命活動具有重要意義。細(xì)胞傳感技術(shù)以活細(xì)胞作為探測元件，通過對活細(xì)胞的基本生理性質(zhì)或細(xì)胞對被測物的響應(yīng)進(jìn)行檢測，從而定性定量地確定細(xì)胞的生理狀態(tài)或被檢物的含量。因此，細(xì)胞傳感技術(shù)對于研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、探索生命的活動和規(guī)律、疾病的診斷和治療、藥物的設(shè)計和篩選、食品安全的監(jiān)督和檢測等都具有十分重大的意義。隨著生命工程技術(shù)的發(fā)展與信息技術(shù)的飛躍，各學(xué)科間的交叉融合，使得細(xì)胞傳感檢測研究得到了飛速發(fā)展，新型的納米材料、熒光及電化學(xué)細(xì)胞傳感器不斷問世，極大推動了生物傳感技術(shù)地迅猛發(fā)展。

目前的熒光傳感器多用于毒性評價、毒物檢測等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種可以實時的、無抗體的、可視化的方法來反映nlrp3在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的方法，通過融合nlrp3啟動子核心區(qū)與綠色熒光蛋白基因，通過病毒轉(zhuǎn)染將外來基因整合到宿主細(xì)胞，當(dāng)外來刺激引起nlrp3的激活時，其啟動子將啟動綠色熒光蛋白的表達(dá)，因此綠色熒光蛋白實時地呈現(xiàn)出nlrp3的激活與抑制情況。

本發(fā)明建立了一種篩選炎性小體nlrp3激活劑及抑制劑的熒光細(xì)胞傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用，并成功發(fā)現(xiàn)了一種多酚b具有抑制nlrp3炎性體激活的作用。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因手段構(gòu)建了一種細(xì)胞熒光傳感器，thp-1細(xì)胞是人單核巨噬細(xì)胞，發(fā)明人將nlrp3啟動子核心區(qū)與綠色熒光蛋白(zsgreen)基因插入質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入thp-1細(xì)胞并進(jìn)行篩選，篩選得到的細(xì)胞即為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在接受到nlrp3炎性體的刺激后，會發(fā)出綠色熒光，采用寬場成像高內(nèi)涵捕捉熒光細(xì)胞。該熒光傳感器可以實現(xiàn)兩個目的，第一，快速高效的發(fā)現(xiàn)可以引起nlrp3高表達(dá)的物質(zhì)，第二，在nlrp3激活劑的作用下，可以快速高效的發(fā)現(xiàn)抑制nlrp3激活的物質(zhì)。并且，寬場成像高內(nèi)涵可以高通量的拍攝熒光圖像，極大的提高了篩藥的效率。該方法可以用于以nlrp3炎性體為靶點的藥物的初篩，也可以用于對nlrp3炎性體的科學(xué)研究。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種含有nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因(zsgreen)的重組載體質(zhì)粒。

在一種實施方式中，所述nlrp3受體核心啟動子區(qū)的核苷酸序列為seqidno:1。

在一種實施方式中，所述重組載體質(zhì)粒是將nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因融合后，轉(zhuǎn)化到載體中得到的。

在一種實施方式中，所述綠色熒光蛋白基因的核苷酸序列為seqidno:2。

在一種實施方式中，nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因融合后的核苷酸序列為seqidno:3。

在一種實施方式中，所述重組質(zhì)粒是在phblv-cmv-mcs-ef1-puro慢病毒載體(購買于漢恒生物科技(上海)有限公司)的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的，命名為nlrp3-gre。

在一種實施方式中，所述重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法是：確定nlrp3受體目的基因和zsgreen基因的序列后，合成模板dna，分段設(shè)計引物，引物為(如seqidno:4～seqidno:7所示)：nlrp3-clai-ecori-f:gcagagatccagtttatcgatatgctggggaagtgtgtct；zsgree(nnlrp3)-r:ccgtgcttggactgggccatggtggcatggagggaaaaatatgcaa；zsgree(nnlrp3)-f:ccctccatgccaccatggcccagtccaagcacgg；nlrp3-clai-ecori-r:agaactagtctcgaggaattcttagggcaaggcggagc，大量擴(kuò)增目的序列，將得到的目的序列與質(zhì)粒連接。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞于培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后收集、抽提質(zhì)粒，對抽提得到的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序符合預(yù)期則證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以進(jìn)行下一步。

本發(fā)明的第二個目的是提供含有nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因的nlrp3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

在一種實施方式中，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建，是將含有nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒的包裝，得到含目的質(zhì)粒的慢病毒液，然后使用獲得的含目的質(zhì)粒的慢病毒液對thp-1細(xì)胞進(jìn)行感染，篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

在一種實施方式中，所述慢病毒的包裝主要通過首先將質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入hek293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染進(jìn)行48-72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后過濾去沉淀，即為所述含目的質(zhì)粒的慢病毒液。

在一種實施方式中，所述對thp-1細(xì)胞進(jìn)行感染，具體是：將thp-1細(xì)胞按照2.5×10⁵/ml接種于12孔板，由于thp-1細(xì)胞感染難度較高，故采取感染復(fù)數(shù)100moi進(jìn)行感染，加入150μl的病毒液感染三天后，加入1μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每兩天更換一次新鮮培養(yǎng)液，每三天將嘌呤霉素的濃度提高一倍，連續(xù)篩選10天即得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(nlrp3-thp-1)。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種熒光細(xì)胞傳感器，所述熒光細(xì)胞傳感器為一種篩選炎性小體nlrp3激活劑或抑制劑的熒光細(xì)胞傳感器；通過構(gòu)建含目的基因的質(zhì)粒，通過病毒轉(zhuǎn)染的手段將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)目的細(xì)胞，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后，加入nlrp3炎性體激活劑或同時加入nlrp3激活劑和抑制劑，運用寬場高內(nèi)涵成像設(shè)備捕獲熒光信號，實現(xiàn)激活劑和/或抑制劑到熒光信號的傳感。

在一種實施方式中，所述目的基因的序列為含有nlrp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因的序列。

在一種實施方式中，所述目的基因的序列如seqidno:3所示。

在一種實施方式中，在寬場成像高內(nèi)涵儀器下捕獲到綠色熒光信號，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長530nm。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種篩選炎性小體nlrp3激活劑和/或抑制劑的方法，所述方法是在本發(fā)明的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)液中加入一定濃度的待測試劑，在寬場成像高內(nèi)涵下連續(xù)拍攝，觀察細(xì)胞熒光變化。

在一種實施方式中，所述方法是篩選炎性小體nlrp3激活劑，如果細(xì)胞熒光比不添加待測試劑的培養(yǎng)液相比增強(qiáng)，就代表加入的待測試劑為炎性小體nlrp3激活劑。

在一種實施方式中，所述細(xì)胞熒光比不添加待測試劑的培養(yǎng)液相比增強(qiáng)是指平均細(xì)胞熒光比不添加待測試劑的培養(yǎng)液的空白對照來說，產(chǎn)生了有統(tǒng)計學(xué)意義的增強(qiáng)。

在一種實施方式中，所述方法是篩選炎性小體nlrp3抑制劑，是先在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)液中加入nlrp3激活劑，刺激炎性小體nlrp3的激活；然后加入一定濃度的待測試劑，如果觀察到細(xì)胞熒光比起添加nlrp3激活劑的對照組出現(xiàn)了下降，就代表加入的待測試劑為炎性小體nlrp3抑制劑。

在一種實施方式中，所述方法是篩選炎性小體nlrp3抑制劑，是先在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)液中加入nlrp3激活劑，刺激炎性小體nlrp3的激活，此時可以觀察到平均細(xì)胞熒光比沒有添加激活劑的空白對照相比出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的增強(qiáng)；然后加入一定濃度的待測試劑，如果觀察到平均細(xì)胞熒光比添加了nlrp3激活劑的對照組出現(xiàn)了有統(tǒng)計學(xué)意義的下降，就代表加入的待測試劑為炎性小體nlrp3抑制劑。

在一種實施方式中，所述方法是篩選炎性小體nlrp3抑制劑，是將本發(fā)明的細(xì)胞傳感器應(yīng)用于由脂多糖(lps)所刺激引起的炎性小體nlrp3的激活下，尋找相應(yīng)的抑制劑。

在一種實施方式中，所述炎性小體nlrp3的激活是通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100ng/ml的lps，在寬場成像高內(nèi)涵下連續(xù)拍攝24h，觀察細(xì)胞熒光變化。

在一種實施方式中，所述對lps引起的nlrp3的激活的抑制是通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100ng/ml的lps和不同濃度的多酚，在寬場成像高內(nèi)涵下連續(xù)拍攝24h，觀察細(xì)胞熒光變化。

在一種實施方式中，所述方法是在寬場成像高內(nèi)涵儀器下捕獲到綠色熒光信號，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長530nm。

在一種實施方式中，所述的寬場成像高內(nèi)涵可以同時拍攝大量熒光圖像，并同時計算熒光均值，通過比較熒光均值，可以篩選出nlrp3炎性小體激活劑及抑制劑。

在一種實施方式中，所述熒光變化的觀察通過分析軟件進(jìn)行分析。

本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了一種新的炎性小體nlrp3抑制劑光甘草定。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

本發(fā)明的熒光傳感器可以實現(xiàn)兩個目的，第一，快速高效的發(fā)現(xiàn)可以引起nlrp3高表達(dá)的物質(zhì)，第二，在nlrp3激活劑的作用下，可以快速高效的發(fā)現(xiàn)抑制nlrp3激活的物質(zhì)。并且，寬場成像高內(nèi)涵可以高通量的拍攝熒光圖像，極大的提高了篩藥的效率。本發(fā)明方法可以用于以nlrp3炎性體為靶點的藥物的初篩，也可以用于對nlrp3炎性體的科學(xué)研究。

附圖說明

圖1：phblv-cmv-mcs-ef1-puro載體圖譜；

圖2：nlrp3單克隆鑒定pcr產(chǎn)物；其中，lane1-8：nlrp3單克隆鑒定pcr產(chǎn)物(marker從上至下依次為：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；

圖3：病毒感染前后細(xì)胞生長曲線；

圖4：lps引起穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系熒光變化。

具體實施方案

下面是對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實施例1nlrp3-gre載體質(zhì)粒的構(gòu)建

1、目的是nlrp3核心啟動子區(qū)與zsgreen連接，然后以clai/ecori雙酶切構(gòu)入phblv-cmvie-ef1-puro，載體圖譜如圖1所示。由于是將兩段單獨的序列拼接在一起共同形成一段序列，需分段設(shè)計引物，然后以pcr出的片段為模板進(jìn)行全長pcr反應(yīng)。其引物設(shè)計如下：

nlrp3-clai-ecori-f:gcagagatccagtttatcgatatgctggggaagtgtgtct

zsgree(nnlrp3)-r:ccgtgcttggactgggccatggtggcatggagggaaaaatatgcaa

zsgree(nnlrp3)-f:ccctccatgccaccatggcccagtccaagcacgg

nlrp3-clai-ecori-r:agaactagtctcgaggaattcttagggcaaggcggagc

2、phblv-cmvie-ef1-puro載體用ecori、clai酶切，酶切體系如下：

40ul酶切體系(2ul400ng/ul的載體、1ulecori酶、1ulclai酶、4ul10×buffer、32ulh2o)，于37度2小時左右。載體酶切完成后膠回收

3、nlrp3片段pcr回收

pcr擴(kuò)增nlrp3序列，體系(50ul)如表1。

表1

pcr程序如表2。

表2

4、處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)體系(20ul)如表3。

表3

以上連接液在16℃過夜。

得到構(gòu)建好的重組質(zhì)粒。

實施例2含有質(zhì)粒nlrp3-gre的慢病毒的包裝

1、載體質(zhì)粒在大腸桿菌e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增

(1)從-70℃冰箱中取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

(2)加入質(zhì)粒5μgdna溶液，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。

(3)42℃水浴中熱擊90秒，熱激過程中不要移動離心管，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5鐘。

(4)向管中加入1mllb液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，吸打混勻后于37℃，220rpm搖床振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。

(5)將上述菌液搖勻后，離心，去除900μl上清，余下培養(yǎng)基吸打混勻后取100μl涂布于含抗生素的篩選平板上。

(6)平板正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時。

(7)轉(zhuǎn)化后的nlrp3平板挑菌，37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時，用菌液進(jìn)行pcr鑒定，將陽性克隆菌液送測序公司測序。nlrp3單克隆pcr鑒定結(jié)果見圖2。nlrp3序列片段大小與預(yù)測一致，說明已成功擴(kuò)增出重組質(zhì)粒。最終重組質(zhì)粒中含有序列為seqidno:3的含有l(wèi)rp3受體核心啟動子區(qū)和綠色熒光蛋白基因的序列。

(8)測序結(jié)果無誤后，抽提收集質(zhì)粒。

2、慢病毒的包裝

(1)第一天：用無抗生素dmem+10％胎牛血清fbs鋪板hek293ft細(xì)胞，2ml/孔。確保第二天細(xì)胞密度達(dá)到80％-90％融合度。

(2)第二天：500ul無血清dmem培養(yǎng)基稀釋2μg表達(dá)質(zhì)粒+1.5μgpspax2+1.5μgpmd2.g；

500μl無血清培養(yǎng)基稀釋15μl脂質(zhì)體2000。5min后，將dna溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min。從6孔板中吸出1ml無血清培養(yǎng)基，然后滴加入1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。5.6-10h后，移除含有dna-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液dmed+10％fbs。

(3)第三天：轉(zhuǎn)染24h后，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到70％以上。

(4)第四天：轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的上清。3000rpm離心20min，0.45μm濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。12000rpm離心濃縮、分裝-80℃貯存。所得到的病毒液將用于后續(xù)的細(xì)胞感染、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。

實施例3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

1、慢病毒感染thp-1細(xì)胞

用無抗生素1640+2％胎牛血清fbs鋪板thp-1細(xì)胞，細(xì)胞密度為2.5×10⁵/ml，取500μl細(xì)胞懸液加入12孔板，8字晃動12孔板使細(xì)胞均勻；加入150μl慢病毒液，用封口膜封住12孔板

后置于平板離心機(jī)中，1500rpm離心60min，離心結(jié)束后取下封口膜置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)感染3h；3h感染后再加入500μl培養(yǎng)液，繼續(xù)感染8h；感染后12h，更換無病毒的完全1640培養(yǎng)液。

2、篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

感染72-96h后，可以開始篩選。將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有1μg/ml嘌呤霉素的完全1640培養(yǎng)液，每兩天對細(xì)胞換液，每三天提高一次嘌呤霉素的濃度；篩選10天后，所得到的細(xì)胞為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，命名為nlrp3-thp-1細(xì)胞。

3、細(xì)胞生長曲線判斷細(xì)胞活力

將篩選后的細(xì)胞與未經(jīng)任何處理的細(xì)胞分別以1×10⁵cells/ml種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每2-3天更換完全1640培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)七天，每天用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)細(xì)胞，繪制生長曲線。

細(xì)胞生長曲線如圖3所示，所篩選出的細(xì)胞生長速度與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本一致，隨著時間的推移，篩選后的細(xì)胞生長速率略低于未處理細(xì)胞，但對后期實驗影響不大，由此可以證明，經(jīng)轉(zhuǎn)染、篩選后的細(xì)胞活性正常。

實施例4脂多糖(lps)所刺激引起的炎性小體nlrp3的激活下，尋找相應(yīng)的抑制劑

1、lps引起炎性小體nlrp3的激活導(dǎo)致細(xì)胞熒光的變化

將獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系nlrp3-thp-1按照2×10⁵/ml鋪板于96孔板，每孔加入200μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有50ng/ml的pma刺激使nlrp3-thp-1細(xì)胞貼壁。48h后，細(xì)胞完全貼壁，換含有100ng/ml的lps的完全1640培養(yǎng)液，置于寬場高內(nèi)涵儀器下，連續(xù)拍攝24h，每一小時獲得一次熒光圖像。熒光圖像及平均細(xì)胞熒光折線圖如圖4所示，由圖中可以看出，lps刺激細(xì)胞引起了平均細(xì)胞熒光的加強(qiáng)，說明lps引起了nlrp3的激活，同時，當(dāng)時間推移至11h時，lps引起的細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化趨于穩(wěn)定。

2、多酚對lps引起的nlrp3炎性體的激活的干預(yù)

將獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系nlrp3-thp-1按照2×10⁵/ml鋪板于96孔板，每孔加入200μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有50ng/ml的pma刺激使nlrp3-thp-1細(xì)胞貼壁。48h后，細(xì)胞完全貼壁，換含有100ng/ml的lps和不同濃度的光甘草定(標(biāo)準(zhǔn)品)完全1640培養(yǎng)液，置于寬場高內(nèi)涵儀器下，連續(xù)拍攝24h，每一小時獲得一次熒光圖像。結(jié)果顯示10小時時，lps刺激細(xì)胞熒光達(dá)到最強(qiáng)，而光甘草定與lps共同作用的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比之前者，有著有統(tǒng)計學(xué)意義的降低，說明光甘草定抑制了lps導(dǎo)致的nlrp3的激活。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種篩選炎性體nlrp3激活劑及抑制劑的熒光細(xì)胞傳感器

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1099

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgctggggaagtgtgtcttttagtcatctattttgttgtctttgtctttgtctgactga60

aacaagtgatggaagacatggtctcatatctctggtcaaaatcctggctctgttccttcc120

tggttctaaacccctcggcaggcttcctagtccccctaagactcagtttatgcatctata180

aaatggggctaggaataggtgcacctcatagagctctgtgcaggttagatggggaaaaac240

atcagtgagtgcctagcctgtggaaagctctaaattaatgtgaattataatgataacaat300

tgcgaattttgcaaggagacattaaaggatgtatgtttttatttattttattttattcta360

ttttattttttgagatggagttttgctcttattgcccaggctggagtgcagtggtgtgat420

cttggctcatcgcaacctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccg480

agtagctgggattacaggtgcctggtaccatgcccggttaatttttgtatttttagtaga540

gacgggatttctccctgttgtttggtgagcctggtctccaactcctgacctcaggtgatc600

cgcccacctcggcctcccaaagtgctgggattacagggatgtatgtttttattattctcc660

attatgcactcccagcttcatctcacttcaatccactggttgatagaagtgcagtcaaag720

actgtcccctcctctgcaagcttttatgttctctctcctctctccctagccacgtcctgt780

tctgttatcaacacacttactcacctcctggccttctccttctattgtctctcatccctc840

ttccctcacaaaaacagaagcaaagagccagagccttcagtttggaggaactgaaaacat900

tctcttctgctttctcattttgtagatgaggaaactgaagttgaggaatagtgaagagtt960

tgtccaatgtcatagccccgtaatcaacgggacaaaaattttcttgctgatgggtcaaga1020

tggcatcgtgaagtggttgttcaccgtaaactgtaatacaatcctgtttatggatttgtt1080

tgcatatttttccctccat1099

<210>2

<211>696

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggc60

tgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggc120

aagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatc180

ttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtc240

gactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgag300

gacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatg360

taccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaag420

atgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatc480

ttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccag540

ttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatc600

cagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgacc660

gagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctaa696

<210>3

<211>1801

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atgctggggaagtgtgtcttttagtcatctattttgttgtctttgtctttgtctgactga60

aacaagtgatggaagacatggtctcatatctctggtcaaaatcctggctctgttccttcc120

tggttctaaacccctcggcaggcttcctagtccccctaagactcagtttatgcatctata180

aaatggggctaggaataggtgcacctcatagagctctgtgcaggttagatggggaaaaac240

atcagtgagtgcctagcctgtggaaagctctaaattaatgtgaattataatgataacaat300

tgcgaattttgcaaggagacattaaaggatgtatgtttttatttattttattttattcta360

ttttattttttgagatggagttttgctcttattgcccaggctggagtgcagtggtgtgat420

cttggctcatcgcaacctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccg480

agtagctgggattacaggtgcctggtaccatgcccggttaatttttgtatttttagtaga540

gacgggatttctccctgttgtttggtgagcctggtctccaactcctgacctcaggtgatc600

cgcccacctcggcctcccaaagtgctgggattacagggatgtatgtttttattattctcc660

attatgcactcccagcttcatctcacttcaatccactggttgatagaagtgcagtcaaag720

actgtcccctcctctgcaagcttttatgttctctctcctctctccctagccacgtcctgt780

tctgttatcaacacacttactcacctcctggccttctccttctattgtctctcatccctc840

ttccctcacaaaaacagaagcaaagagccagagccttcagtttggaggaactgaaaacat900

tctcttctgctttctcattttgtagatgaggaaactgaagttgaggaatagtgaagagtt960

tgtccaatgtcatagccccgtaatcaacgggacaaaaattttcttgctgatgggtcaaga1020

tggcatcgtgaagtggttgttcaccgtaaactgtaatacaatcctgtttatggatttgtt1080

tgcatatttttccctccatgccaccatggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagat1140

gaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcga1200

gggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcgg1260

ccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgtt1320

caccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacac1380

ctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcac1440

cgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccc1500

cgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagat1560

catccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaa1620

ggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccg1680

caagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgc1740

caagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggctccgccttgcccta1800

a1801

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcagagatccagtttatcgatatgctggggaagtgtgtct40

<210>5

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ccgtgcttggactgggccatggtggcatggagggaaaaatatgcaa46

<210>6

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccctccatgccaccatggcccagtccaagcacgg34

<210>7

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

agaactagtctcgaggaattcttagggcaaggcggagc38