本發(fā)明公開了一種以人ad5復制缺陷型腺病毒為載體的寨卡病毒病疫苗，本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
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背景技術：
：：寨卡病毒(zikavirus，zikv)是一種單股正鏈rna病毒，與黃熱病毒(yellowfever)、登革熱病毒(denguefever)、日本腦炎病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)、森林腦炎病毒(tick-borneencephalitisvirus，tbev)和西尼羅河病毒(westnilevirus，wnv)等同屬于黃病毒(flavivirus)科黃病毒屬。zikv于1947年首次發(fā)現于烏干達寨卡森林的猴子身上，主要通過伊蚊傳播，少數情況下也可以通過母嬰傳播、性傳播和輸血傳播。zikv最初僅在少數地區(qū)有小規(guī)模的爆發(fā)和流行:1952年，在烏干達、尼日利亞和印度進行的血清流行病學調查顯示人類有感染寨卡病毒；1951-1983年，寨卡病毒在非洲和亞洲多個國家傳播；2007年，大洋洲的密克羅尼西亞爆發(fā)了寨卡疫情，為首次非洲和亞洲之外的爆發(fā)；2013-2014年，法屬波利尼西亞、復活節(jié)島、庫克群島、法屬新喀里多尼亞有疫情的小規(guī)模爆發(fā)。2015年美洲疫情為首次大規(guī)模的寨卡疫情爆發(fā)，短時間內便席卷南美，后又擴散至北美和世界其他地區(qū)，全球累計有73個國家和地區(qū)有疫情報告，根據泛美衛(wèi)生組織(panamericanhealthorganization，paho)的數據，截止2017年3月23日，美洲各地政府累計報告確診病例1003509例。大部分zikv的感染沒有明顯的癥狀或者僅有發(fā)熱、頭痛、皮疹、關節(jié)痛等輕微癥狀，這也是之前zikv并未受到國際社會重視的原因之一。但在此次美洲疫情的流行中，研究人員發(fā)現寨卡感染也能夠導致非常嚴重的疾?。涸袐D感染導致的新生兒小頭畸形及其他形式的腦部畸形，成年人的guillain-barre綜合癥，近期的研究還發(fā)現病毒可以長達半年時間存在于精液等體液中，而且具有傳染性；此外，動物模型的研究也發(fā)現zikv能夠損害雄性小鼠的生殖系統(tǒng)。zikv基因組的長度在11kb左右，所編碼的10個蛋白被翻譯為一條多肽鏈，然后經由宿主和病毒編碼的蛋白酶切割為3個結構蛋白(衣殼蛋白(capsid，c)、前膜/膜蛋白(premembrane/membraneprotein，prm/m)和包膜蛋白(envelope，e))和7個非結構蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)?；趎s5基因序列的遺傳分析認為：zikv可以分為三個系(lineage)，東非系、西非系和亞洲系。zikv只有一個血清型，因此，單價疫苗即有可能形成針對當前所有毒株的防護。zikv與其他黃病毒屬的成員具有相似的基因結構和病毒結構，其prm/m蛋白和env蛋白位于病毒的表面，其中env蛋白負責病毒與其細胞膜上受體的結合及病毒與細胞膜的融合，是主要的保護性抗原。盡管已經有針對黃熱病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒等其他黃病毒屬成員的上市疫苗，但到目前為止還沒有獲得批準的針對zikv的疫苗，甚至在2015年南美疫情大爆發(fā)之前，科學家對機體應對zikv的保護性免疫反應也知之甚少。疫情爆發(fā)后，who在寨卡疫苗產品特征(targetproductprofileforzikvvaccines，tpp)文件中對zikv疫苗及疫苗的研發(fā)提出了建議和要求。zikv疫苗需要滿足針對大規(guī)模人群進行的應急免疫，需要能夠快速產生保護性免疫反應，此外，疫苗的優(yōu)先人群是懷孕的婦女和育齡婦女，因此，疫苗要有足夠的安全性來滿足特定人群的需要。目前全世界正在研發(fā)的zikv疫苗有30多個，僅美國nih就在2016年獲得國會兩億美元的撥款用于多種zikv疫苗的研發(fā)。根據疫苗平臺的不同，在研的zikv疫苗主要有五種類型：zikv滅活病毒疫苗、zikv重組亞單位疫苗、zikv減毒疫苗(包括嵌合疫苗)、病毒載體疫苗和核酸疫苗(mrna/dna)。每種類型都有各自的優(yōu)點和缺點：滅活zikv疫苗的優(yōu)點在于安全性高，適合孕婦和兒童等特定人群的使用，之前已經有其它獲批的滅活黃病毒類疫苗上市，但缺點在于需要多次免疫才能產生足夠的保護性免疫反應，不利于大規(guī)模人群應急免疫的使用；重組亞單位疫苗也具有安全性高的優(yōu)點，但其缺點也在于需要多次免疫，此外，目前尚未有獲得批準的黃病毒類重組亞單位疫苗。減毒疫苗的優(yōu)點在于僅1次免疫就可以產生很高的免疫反應，減毒的黃病毒疫苗已經使用多年，但對于特定人群(孕婦、老人和兒童等免疫低下者)，考慮到其安全性，減毒疫苗要慎用；病毒載體疫苗，如以腺病毒或水泡性口炎病毒為載體的疫苗，具有單次免疫就可迅速產生較高免疫反應的優(yōu)點，此類疫苗在埃博拉疫苗的研發(fā)期間積累了大量的人體安全性數據，盡管目前沒有上市的此類疫苗，但其還是具有很高的臨床應用前景；核酸疫苗具有制備和儲存上簡單、快速和穩(wěn)定的優(yōu)勢，但其缺點在于人體的免疫原性低，目前也沒有獲批上市的核酸疫苗。在美國，zikv的滅活疫苗與核酸疫苗(包括dna疫苗和mrna疫苗)已經獲得fda的批準率先進入臨床i期的研究，其中dna疫苗已經于2017年3月份進入臨床ⅱ期的研究。復制缺陷型腺病毒的大規(guī)模制備具有成本較低和工藝簡單的優(yōu)點，其宿主范圍廣、外源蛋白表達水平高、不整合到染色體中，無插入致突變性，因此，近年來越來越多的被應用于基因治療和疫苗的研發(fā)中。本發(fā)明中使用的admax腺病毒系統(tǒng)是由frankgraham在1999年創(chuàng)建，由加拿大的micobix公司開發(fā)成為一種腺病毒載體包裝系統(tǒng)。它本身不具備增殖能力，需要通過重組酶在真核細胞內完成重組出毒，高效且穩(wěn)定，是目前最方便快捷的腺病毒包裝系統(tǒng)之一。雖然admax系統(tǒng)具有出毒快，產率高等優(yōu)點。但作為一種有效的活病毒載體疫苗，除了載體本身的優(yōu)勢，如何使插入的外源目標蛋白更有效地表達至關重要。如果外源蛋白的表達水平過低，需通過增加免疫劑量來獲得有效的免疫效果，這樣必然會增加載體對接種者的不良影響。因此，通過對目標蛋白的基因進行優(yōu)化，使其能夠更高效的正確表達，是提高疫苗免疫效果的一種有效方法。基于現有
技術領域：
：在寨卡病毒病預防接種上的現實需求，及目前現有疫苗在預防效果上效率不高，以及admax系統(tǒng)在應用上存在的技術難題，本申請人欲通過對相關蛋白進行密碼子優(yōu)化，并對抗原的表達形式進行合理的設計，使其在真核細胞中的表達量明顯增高，并提供具有更強免疫原性，在相同劑量下能夠誘導更高水平的抗體的重組腺病毒載體寨卡病毒病疫苗。技術實現要素：基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種能夠表達寨卡病毒env蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如seqidno:1所示的env蛋白編碼序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸序列還含有如seqidno:2所示的編碼前膜蛋白的核苷酸序列。在一個更為優(yōu)選的實施方案中，所述編碼前膜蛋白的核苷酸序列位于所述核苷酸序列的5’端。在一個尤為優(yōu)選的實施方案中，在所述編碼前膜蛋白的5’端還含有如seqidno:3所示的前膜蛋白內源信號肽密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。在一個最為優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸序列如seqidno:4所示，所述核苷酸序列表達出的融合多肽為zikvprm蛋白內源信號肽-prm-env融合多肽，即sig-prm-env。其次，本發(fā)明還提供了一種能夠表達寨卡病毒前膜蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如seqidno:2所示的前膜蛋白編碼序列第三，本發(fā)明還提供了一種含有如上所述核苷酸序列的穿梭質粒載體，所述載體為pdc316。第四，本發(fā)明提供了一種能夠表達如上所述核苷酸序列的人復制缺陷重組腺病毒載體，所述重組腺病毒載體來源于admax腺病毒系統(tǒng)。第五，本發(fā)明提供了如上所述的人復制缺陷重組腺病毒載體在制備預防寨卡病毒病疫苗中的應用。最后，本發(fā)明提供了一種制備可表達zikvenv蛋白的重組腺病毒的方法，所述方法包括以下步驟：(1)構建含有如前任一所述核苷酸序列的穿梭質粒載體；(2)將步驟(1)所述載體與骨架質粒一起轉染入宿主細胞；(3)培養(yǎng)步驟(2)所述宿主細胞；(4)收獲從步驟(3)所述細胞釋放的人復制缺陷重組腺病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)所述載體為pdc316。在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(2)所述骨架質粒為pbhglox_e1,3cre。在又一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(3)所述細胞為hek293細胞。在又一個優(yōu)選的實施方案中，在步驟(4)中采用benzonase消化核酸后通過source30q柱層析法對重組腺病毒進行純化。本發(fā)明提供的env密碼子優(yōu)化核苷酸序列或所述的prm蛋白內源信號肽-prm-env融合多肽(sig-prm-env)密碼子優(yōu)化核苷酸序列插入穿梭載體pdc316后，與輔助載體pbhglox_e1,3cre共轉染hek293細胞，包裝出以e1、e3聯(lián)合缺失的復制缺陷型人5型腺病毒為載體的重組腺病毒，該重組腺病毒攜帶有密碼子經過優(yōu)化的亞洲型寨卡病毒毒株mrs_opy_martinique_pari_2015(genebankaccessionnoku647676)的包膜糖蛋白(envelope，env)基因或者該株病毒prm蛋白內源信號肽-prm-env融合多肽的基因。攜帶上述基因的重組質粒載體和重組腺病毒載體能夠在轉染/感染細胞中高效表達寨卡病毒的包膜蛋白，插入所述核苷酸的重組腺病毒作為疫苗免疫動物后能夠快速誘發(fā)針對寨卡病毒包膜蛋白的體液免疫和細胞免疫反應。重組腺病毒載體寨卡病毒病疫苗可以進行大規(guī)模的快速制備，具有單次注射即可誘發(fā)強烈免疫反應的特點，能夠用于寨卡疫情爆發(fā)時大規(guī)模人群的應急接種及平時人群的預防性免疫。附圖說明圖1a.穿梭質粒pdc316結構示意圖；圖1b.重組穿梭質粒pdc316-envori結構示意圖；圖1c.pdc316-envopt結構示意圖；圖1d.pdc316-sig-prm-envopt結構示意圖；圖2.重組穿梭質粒體外表達env蛋白的westernblot檢測圖譜；圖3.重組腺病毒載體zikv疫苗中目標序列的擴增鑒定；圖4.重組腺病毒載體zikv疫苗表達zikvenv蛋白的westernblot檢測圖譜；圖5.source30q柱層析純化重組腺病毒載體zikv疫苗的層析圖譜；圖6.重組腺病毒載體zikv疫苗免疫小鼠四周后血清env特異性igg抗體水平和血清prm特異性igg抗體水平；圖7.細胞內細胞因子染色流式細胞術檢測zikv疫苗免疫小鼠脾細胞ifnγ和il-2分泌水平的統(tǒng)計分析圖；圖8.elispot檢測zikv疫苗免疫小鼠脾細胞ifnγ和il-2分泌水平統(tǒng)計分析圖。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護范圍構成任何限制。實施例1：以人復制缺陷腺病毒為載體的寨卡病毒病疫苗的制備1.zikvprm內源信號肽密碼子序列、prm蛋白密碼子序列及env蛋白密碼子序列的優(yōu)化及合成。使用軟件upgene(gao,w.,rzewski,a.,sun,h.,robbins,p.d.,&gambotto,a.(2004).upgene:applicationofaweb-baseddnacodonoptimizationalgorithm.biotechnolprog,20(2),443-448.doi:10.1021/bp0300467)對2015年在加勒比地區(qū)martinique爆發(fā)流行時分離到的zikv毒株mrs_opy_martinique_pari_2015(genebankaccessionnoku647676)的zikvprm內源信號肽密碼子序列、prm蛋白密碼子序列及env蛋白密碼子序列進行優(yōu)化，使其更適合在哺乳動物細胞中進行表達。優(yōu)化后的zikvprm內源信號肽密碼子序列見seqidno.3，按照該序列進行寡核苷酸片段的合成；優(yōu)化后的prm蛋白密碼子序列見seqidno.2，按照該序列進行基因的合成；優(yōu)化后env蛋白密碼子序列見seqidno.1，將組織纖溶酶原激活物信號肽tpa的編碼序列置于其5’端，并在翻譯起始密碼子前面加入kozak序列，進行基因的合成；優(yōu)化后的zikvprm蛋白內源信號肽-prm-env-融合多肽(sig-prm-env)的密碼子序列見seqidno.4，按照該序列進行該融合多肽編碼序列的構建。2.重組穿梭載體的構建及zikvenv蛋白的表達鑒定。2.1載體構建將合成的tpa信號肽-env原始序列或者tpa信號肽-env密碼子優(yōu)化序列使用ncoi和sali進行雙酶切，回收酶切產物，將其與ncoi和sali雙酶切的admax腺病毒系統(tǒng)(加拿大microbixbiosystemsinc.)的穿梭質粒pdc316(結構如圖1a所示)進行連接，連接產物轉化dh5α感受態(tài)，涂布amprlb平板，挑單克隆進行菌落pcr鑒定，并對pcr鑒定為陽性的克隆進行測序驗證。測序正確的質粒命名為pdc316-envori(原始序列)或者pdc316-envopt(優(yōu)化序列)，質粒圖譜如圖1b和1c所示。以合成的寡核苷酸序列p1和p2為引物，重組穿梭質粒pdc316-envopt為模板，使用q5dna聚合酶(neb)擴增出線狀序列l(wèi)-pdc316-envopt，使用ncoi單切該序列后回收酶切產物；以合成的寡核苷酸p3和p4為引物，合成的密碼子優(yōu)化的prm為模板，使用q5dna聚合酶(neb)擴增出s-prm序列；以合成的寡核苷酸p5和p4為引物，s-prm序列為模板，使用q5dna聚合酶(neb)擴增出sig-prm序列，使用序列ncoi單切該序列，然后將其與上述ncoi單切的l-pdc316-env進行連接，連接產物轉化dh5α感受態(tài)，涂布amprlb平板，挑單克隆進行菌落pcr鑒定，并對pcr鑒定為陽性的克隆進行測序驗證。測序正確的質粒命名為pdc316-sig-prm-envopt，其插入有zikvprm蛋白內源信號肽-prm-env-融合多肽(sig-prm-env)的優(yōu)化密碼子序列，質粒圖譜如圖1d所示。pdc316-sig-prm-envopt構建所使用的引物及其序列如下所示：p1：atccgctgcattggtgtctcgaac；p2：ctatccatggccatggtggcggcaagcttagatc；p3：atctgttgggatcgtcgggcttctccttaccacggcgatggcagctgaggtgacccgtcgc；p4：ggaataggcgggggcg；p5：ctatccatgggcgctgagacatctgttgggatcgtcggg；2.2重組穿梭質粒pdc316-envori、pdc316-envopt和pdc316-sig-prm-envopt表達zikvenv蛋白的體外鑒定。293t細胞的轉染：轉染前一天，將293t細胞以1×106細胞/孔接種6孔板，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第二天，細胞豐度大約在80％左右，培養(yǎng)基更換為0.5ml/孔的新鮮培養(yǎng)基(mem+10％fbs)。分別將4μg的無關質粒、pdc316-envori、pdc316–envopt或pdc316-sig-prm-envopt與10μl的lipofectamine2000tm(lifescience)在opti-mem中混合后加入細胞孔中(轉染的詳細步驟參見廠家說明書)，轉染4小時后更換為新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，48小時后制備樣品，用于目標蛋白的表達分析。細胞裂解樣品的制備：轉染48小時后，吹打使貼壁細胞懸??；將細胞懸浮液轉移入離心管中，室溫，500g離心5分鐘，棄上清；用冰冷的pbs將細胞清洗一遍；然后加入100μl的90μlripabuffer(pierce)+10μl蛋白酶抑制劑混合物(sigma)懸浮細胞，置于冰上20分鐘，每2分鐘震蕩一次；20分鐘后，將細胞裂解液于12000g，4℃離心10分鐘，取上清，與4×的sds-page上樣緩沖液(含有40％的2-mercaptoethanol)混合，分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆?。wb檢測zikvenv蛋白的表達：使用12％的sds-page不連續(xù)凝膠對樣品進行分離，電泳條件為50v恒壓，電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，電轉條件為100v恒壓1小時。電轉完成后按照下列步驟進行wb分析：1)預洗：將膜在20mlpbst(0.05％tween20)中預洗10分鐘；2)封閉：將膜在含有3％脫脂奶粉的pbst溶液中室溫震蕩孵育1小時；3)zikvenv特異性抗體結合：pbst洗膜3次，每次10分鐘，然后將膜在10ml的含有1％脫脂奶粉和zikvenv特異性兔多抗(1：2000稀釋，多抗購自alphadiagnosticinternational)的pbst溶液中于4℃孵育過夜；4)酶標二抗結合：pbst洗膜3次，每次10分鐘間隔，然后將膜在10ml的含有1％脫脂奶粉和hrp標記的羊抗兔(1：2000，購自santacluz)的pbst溶液中于室溫孵育1小時；6)顯色：pbst洗膜4次，每次10分鐘間隔；使用immobilontmwesternchemiluminescenthrpsubsrate(millipore)進行化學發(fā)光顯色，化學發(fā)光成像儀采集不同曝光時間的圖像。結果如圖2所示，圖2中a部分：從左到右依次為1號：pdc316-envori，2號：pdc316-envopt，序列優(yōu)化后env的表達量大約是未優(yōu)化序列表達量的2倍；圖2中b部分：從左到右依次為1號：pdc316-envopt，2號：無關質粒，3號：pdc316-sig-prm-envopt；pdc316-envori、pdc316-envopt和pdc316-sig-prm-envopt轉染的樣品都能夠檢測到zikvenv蛋白的表達，而且目標產物分子量與預期一致(大約53kd)。3.重組腺病毒ad5-envopt和ad5-sig-prm-envopt的包裝、制備及目標蛋白zikvenv的表達鑒定3.1重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env的包裝將重組穿梭質粒pdc316-envopt和pdc316-sig-prm-envopt分別與admax腺病毒系統(tǒng)的骨架質粒pbhglox_e1,3cre混合后共轉染hek293細胞以包裝出重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env，具體過程如下所示：1)hek293細胞的準備：轉染前1天，將hek293細胞消化后以5×105細胞/孔的數量接種于6孔板，所用培養(yǎng)基為mem+10％fbs，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；2)轉染前，更換新鮮培養(yǎng)基，細胞豐度大約在85％左右，取4μg的骨架質粒(pbhglox_e1,3cre)與1μg的重組穿梭質粒(pdc316-envopt或pdc316-sig-prm-envopt)混合，將其稀釋于300μl的opti-mem培養(yǎng)基中，室溫放置；取10μl的lipofectaminetm2000脂質體，稀釋于300μl的opti-mem培養(yǎng)基中,室溫放置5分鐘；5分鐘后，將上述dna與lipofectaminetm2000脂質體混合后室溫放置30分鐘，然后輕輕加入培養(yǎng)有hek293細胞的培養(yǎng)孔中；繼續(xù)培養(yǎng)細胞，第二天，將6孔板中接近100％豐度的細胞轉接于t25細胞培養(yǎng)瓶中，使用添加了5％fbs的mem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞再次達到100％豐度時，將其轉接入t75細胞培養(yǎng)瓶中，每日觀察出毒跡象，出毒時細胞會逐漸變圓并不再粘附于培養(yǎng)容器，當大部分細胞出現出毒病變時，吹打細胞，使其完全脫落，轉移入15ml的細胞離心管中，反復3次-75℃冰箱低溫冷凍與37℃水浴融化，3000g，4℃離心細胞裂解液5分鐘，收集上清，上清中的病毒即為第一代毒種(p1)，將其分別命名為p1-ad5-env和p1-ad5-sig-prm-env。3.2p1-ad5-env和p1-ad5-sig-prm-env中目標基因的序列鑒定使用引物p6和p7，以p1-ad5-env和p1-ad5-sig-prm-env為模板，分別擴增出env和sig-prm-env的編碼序列，具體操作過程如下所示：1)合成引物p6和p7：p6位于上游的mcmv啟動子內，p7位于下游的sv40終止子內，其序列如下所示：p6：acgtgggtataagaggcgp7：cgatgctagacgatccag2)模板制備：取50μl的p1-ad5-env或p1-ad5-sig-prm-env上清液，加入5μl的蛋白酶k(2mg/ml)溶液，50℃孵育1小時，然后于4℃，12000g離心10分鐘，取上清作為擴增模板。3)pcr反應體系及反應條件100μl反應體系如表1所示：表1.pcr反應體系pcr參數及循環(huán)數：94℃預變性5分鐘，循環(huán)參數：94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，25個循環(huán)，最后72℃孵育5分鐘。pcr結果如圖3中a和b所示，圖3的a中，從左到右依次分別是dnamarker(dl-2000)、1號：p1-ad5-env模板擴增產物；圖3的b中，從左到右依次分別是dnamarker(dl-2000)、1號：p1-ad5-sig-prm-env模板擴增產物。將凝膠上的目標條帶切下后回收，測序顯示為目標條帶且序列正確。3.3重組腺病毒p1-ad5-env和p1-ad5-sig-prm-env表達zikvenv蛋白的鑒定hek293細胞的準備及感染：感染前一天，將293t細胞以1×106細胞/孔接種6孔板，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第二天，細胞豐度大約在80％左右，培養(yǎng)基更換為1ml/孔的新鮮培養(yǎng)基；將10μl的p1-ad5-env或p1-ad5-sig-prm-env加入細胞孔中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48小時。細胞裂解樣品的制備：感染48小時后，吹打使細胞懸浮后轉移入離心管中，500g離心5分鐘，棄上清，先用冰冷的pbs將細胞清洗一遍，然后加入90μl的ripabuffer(pierce)和10μl蛋白酶抑制劑混合物(sigma)懸浮細胞，置于冰上20分鐘，每2分鐘震蕩一次。20分鐘后，將細胞裂解液于12000g，4℃離心10分鐘，取上清，與4×的sds-page上樣緩沖液(含有40％的2-mercaptoethanol)混合，分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆?。wb檢測zikv-env蛋白的表達：使用12％的sds-page不連續(xù)凝膠對樣品進行分離，電泳條件為50v恒壓，電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，電轉條件為100v恒壓1小時。電轉完成后按照下列步驟進行wb分析：1)預洗：將膜在20mlpbst(0.05％tween20)中預洗10分鐘；2)封閉：將膜在含有3％脫脂奶粉的pbst溶液中室溫震蕩孵育1小時；3)zikv-env特異性抗體結合：pbst洗膜3次，每次10分鐘，然后將膜在10ml的含有1％脫脂奶粉和zikv-env特異性兔多抗(1：2000稀釋，多抗購自alphadiagnosticinternational)的pbst溶液中于4℃孵育過夜；4)酶標二抗結合：pbst洗膜3次，每次10分鐘間隔，然后將膜在10ml的含有1％脫脂奶粉和hrp標記的羊抗兔(1：2000，購自santacluz)的pbst溶液中于室溫孵育1小時；6)顯色：pbst洗膜4次，每次10分鐘間隔；使用immobilontmwesternchemiluminescenthrpsubsrate(millipore)進行化學發(fā)光顯色，化學發(fā)光成像儀采集不同曝光時間的圖像。結果如圖4所示：pdc316-env和pdc316-sig-prm-env轉染的樣品都能夠檢測到zikv-env蛋白的表達，而且目標產物分子量與預期一致(大約53kd)，后者的目標蛋白表達量大約是前者的2.5倍，一般認為，表達量的提高與密碼子優(yōu)化的prm蛋白對于env蛋白形成特異性的分子伴侶從而對表達產生了協(xié)同效應。4.重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env的擴增培養(yǎng)、純化及純化病毒的滴度測定4.1重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env的小規(guī)模擴增制備培養(yǎng)在37℃、5％co2，130rpm條件下懸浮培養(yǎng)293f細胞，將活度大于95％的細胞調整濃度為1×106細胞/ml，體積為2l。ad5-env或ad5-sig-prm-env以10個moi進行感染，繼續(xù)之前條件培養(yǎng)細胞，每隔24小時取樣檢測細胞活度和密度。大約在接種72小時后，細胞活度下降到40％以下時，停止培養(yǎng)，500g室溫離心收獲細胞，將細胞懸浮于1/10體積的a液(20mmtris，250mmnacl，1mmmgcl2，ph7.5)中，反復3次-75℃冰箱低溫冷凍與37℃水浴融化，然后4℃，12000g離心20分鐘，取上清用于病毒純化。4.2重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env的純化在病毒上清中加入終濃度為50u/ml的benzonase(sigma)，37℃孵育2小時以降解溶液中的核酸，然后4℃，12000g離心20分鐘，取上清；使用a液平衡source30q柱子，上樣流速5ml/分鐘，上樣結束后，繼續(xù)使用a液沖洗至uv基線走平；使用b液(20mmtris，2mnacl，2mmmgcl2，ph7.5)以線性梯度洗脫，20個柱體積內從0-40％b液，如圖5所示，病毒主要分布在紅色箭頭所示的洗脫峰中。將收集的病毒溶液合并后使用截留分子量為100kd的超濾管(millipore)進行濃縮，使用0.2μm的濾膜過濾病毒濃縮液以除菌，然后加入終濃度為10％的無菌甘油，分裝后凍存于-80℃。4.3重組腺病毒ad5-env和ad5-sig-prm-env的滴度測定病毒滴度測定使用clontechadeno-xtmrapidtiterkit進行，操作過程如下所示(詳見廠家的操作說明)：1)消化hek293細胞，然后將細胞懸浮于新鮮的mem+10％fbs中，調整細胞濃度為5.0×105/ml，以0.5ml/孔的量加入24孔板中，然后將24孔板放入培養(yǎng)箱中；2)使用mem(10％fbs)稀釋病毒，取10μl的病毒加入90μl的稀釋液中，依次10倍稀釋，從10倍到107倍，稀釋完畢后從102倍稀釋度開始，每孔中加入50μl的病毒稀釋液；3)培養(yǎng)48小時后，傾去培養(yǎng)基，使細胞在生物安全柜中干燥5分鐘；4)每孔中加入0.5ml的100％的甲醇，于-20℃孵育10分鐘；5)吸棄甲醇，使用pbs+1％bsa洗細胞3次，0.5ml/孔；6)吸棄洗液，加入0.25ml的抗hexon抗體(1:1000稀釋于pbs+1％bsa)，37℃孵育1小時；7)吸棄抗體，加入0.5ml的pbs+1％bsa洗細胞3次；8)使用pbs+1％bsa以1：500的比例稀釋ratanti-mouseantibody(hrpconjugate)，0.25ml/孔，37℃孵育1小時；9)使用1×的stableperoxidasebuffer稀釋10×的dabsubstrate，使其溫度達到室溫；10)吸棄酶標二抗，加入0.5ml的pbs+1％bsa洗細胞3次；11)加入0.25ml的dab工作液到細胞孔，室溫孵育10分鐘；12)吸棄dab工作液，加入pbs，0.5ml/孔；13)在顯微鏡下數至少6個視野的棕色/黑色的陽性細胞的數目，然后計算其平均數；14)依下列公式進行計算。滴度測定結果顯示，純化ad5-env和ad5-sig-prm-env的感染滴度分別為5.19×109ifu/ml和2.97×109ifu/ml。實施例2寨卡病毒病疫苗在小鼠模型上的免疫學評價。在小鼠模型上，研究重組腺病毒載體zikv疫苗的免疫劑量，評價疫苗所誘導的體液免疫和細胞免疫的水平。1.重組腺病毒載體zikv疫苗ad5-env和ad5-sig-prm-env誘發(fā)機體體液免疫反應的評價和比較1.1疫苗免疫劑量的比較及小鼠體液免疫反應的評價spf級雌性balb/c小鼠(4-6周齡)，購自維通利華。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院豐臺院動物房。注射體積為50μl，免疫后每周采血，所制備血清凍存于-20℃?zhèn)溆?。小鼠分組、免疫劑量及免疫部位如表2-4所示：表2：ad5-env免疫分組、免疫部位、免疫劑量及免疫體積*luc：熒光素酶表3：ad5-sig-prm-env免疫分組、免疫部位、免疫劑量及免疫體積表4:比較ad5-env和ad5-sig-prm-env誘發(fā)的體液免疫血清總igg滴度的測定使用elisa法，具體方法如下所示：1)包被緩沖液為ph9.6的碳酸鹽緩沖液，重組renv1-409(本室制備，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達后復性)的包被濃度為8μg/ml，重組rprm1-110(本室制備，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達后復性)的包被濃度為4μg/ml，以100μl/孔的體積加入96孔eia板(coastar)，4℃包被過夜；2)第二天，取出采集的免疫后血清，置于室溫，待其融化后，輕彈管壁使融化后的溶液均勻，短暫離心后將ep管置于管架上排列好；3)使用pbst(0.3％的tween-20)洗板3次，每次間隔3分鐘；4)根據樣品布局圖，使用封閉緩沖液(含有3％bsa的pbst)以2倍梯度稀釋樣品，100μl/孔加樣；5)37℃孵育1小時后洗板6次，每次間隔3分鐘；6)使用稀釋緩沖液(含有1％bsa的pbst)以1：5000的比例稀釋酶標二抗(anti-mouseigghrp-linkedantibody，cellsignaling)，100μl/孔加樣；7)37℃孵育1小時后洗板6次，每次間隔3分鐘；8)以100μl/孔加入顯色緩沖液(tmb，solarbio)進行顯色；9)顯色5分鐘，加入50μl/孔的終止液(2nh2so4)終止反應，然后立即放入酶標儀(bio-rad)讀值a450。以大于空白孔2倍的讀值對應的稀釋度作為血清中特異性抗體的滴度。免疫后四周的檢測結果如圖6所示：不管是ad5-env，還是ad5-sig-prm-env，都能夠迅速激發(fā)小鼠產生較高的體液免疫；對于ad5-env來說，1×108ifu的免疫劑量能夠產生最高及最一致的抗體水平(圖6，a)，而ad5-sig-prm-env僅需要1×107ifu的免疫劑量即可(圖6，b)，ad5-sig-prm-env所產生的針對prm的抗體水平較低(圖6，c)；同時免疫兩種候選疫苗，ad5-sig-prm-env在第四周所產生的體液免疫水平與ad5-env沒有太大的區(qū)別(圖6，d)。2.重組腺病毒載體zikv疫苗ad5-env和ad5-sig-prm-env誘發(fā)機體細胞免疫反應的評價和比較2.1小鼠的免疫spf級雌性balb/c小鼠(4-6周齡)，購自維通利華。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院豐臺院動物房。注射體積為50μl，小鼠分組、免疫劑量及免疫部位如表5所示：表5重組腺病毒載體zikv疫苗免疫分組、免疫部位、免疫劑量及免疫體積2.2小鼠脾淋巴細胞的分離免疫2周后將小鼠處死，取出脾臟，研磨釋放淋巴細胞，200目細胞篩過濾，使用rbclysisbuffer(biolegend)裂解紅細胞，接著使用rpmi1640完全培養(yǎng)基清洗細胞一次，然后將細胞懸浮于rpmi1640完全培養(yǎng)基中，細胞計數后待用。2.3elispot檢測ifn-γ和il-2使用bdtmelispotmouseifn-γset和bdtmelispotmouseil-2set進行ifn-γ和il-2的elispot檢測。方法簡述如下，詳見制造商的說明書。1)分別使用5μg/ml抗小鼠ifn-γ和il-2抗體包被elispot板，4℃孵育過夜；2)實驗前使用rpmi1640+10％fbs培養(yǎng)基于室溫封閉elispot板2小時；3)棄封閉液，每孔加入5μg/ml的zikv的env蛋白重疊肽庫或prm蛋白重疊肽庫(長度為15個aa殘基，相鄰多肽之間有10個氨基酸的重疊，由上海吉爾生化合成)刺激細胞，含有相同體積dmso的rpmi1640+10％fbs培養(yǎng)基作為對照，均設置3個復孔；4)每孔加入50μl的小鼠脾淋巴細胞，ifn-γ檢測的細胞濃度為2×106cells/ml，il-2檢測的細胞濃度為4×106cells/ml，常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時；5)吸棄孔內的細胞，使用蒸餾水洗兩次，然后使用pbst(0.05％tween-20)洗3次，每次洗液孵育3分鐘；6)每孔加入100μl的稀釋于pbs+10％fbs的biotinylatedanti-mouseifn-γ或biotinylatedanti-mouseil-2(250倍稀釋)，室溫孵育2小時；7)棄去孔內液體，使用pbst(0.05％tween-20)洗3次，每次洗液孵育3分鐘；8)每孔加入100μl的稀釋于pbs+10％fbs的streptavidin-horseradishperoxidase(100倍稀釋)，室溫孵育1小時；9)棄去孔內液體，使用pbst(0.05％tween-20)洗4次，每次洗液孵育3分鐘，然后使用pbs洗3次；10)使用bdtmelispotaecsubstrateset進行生色反應。待孔內斑點長至合適大小時(一般于室溫反應15-25分鐘)棄去顯色底物，用大量的蒸餾水沖洗以終止反應。將板晾干，使用酶聯(lián)斑點成像分析系統(tǒng)(安泰永信，at-spot2100)進行斑點計數2.4細胞內細胞因子的染色及流式細胞術檢測1)將分離的小鼠脾淋巴細胞調整為4×106cells/ml，以0.5ml/孔加入24孔板中，每只小鼠的細胞加入3個孔，然后分別加入env蛋白的重疊多肽、prm蛋白的重疊多肽和等體積的dmso，多肽混合溶液中每條多肽的終濃度為2.5μg/ml；2)常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后，每孔加入適量的bdgolgistoptm(4μl作用于6ml細胞)和bdgolgiplugtm(1μl作用于1ml細胞)，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4小時后將細胞轉移至流式管中，每管加入3mlpbs清洗一次，4℃，500g離心5分鐘，棄上清；3)使用live/deadtmfixablenear-irdeadcellstainkit(invitrogen)對死細胞染色30分鐘；4)使用3mlpbs+2％fbs洗滌一次，然后使用mousebdfcblocktm(biolegend,clone,2.4g2)室溫阻斷fc受體10分鐘；5)使用percp/cy5.5anti-mousecd3(biolegend,clone,17a2)，brilliantviolet510tmanti-mousecd4(biolegend,clone,rm4-5)，fitcanti-mousecd8a(biolegend,clone,5h10-1)，brilliantviolet421tmanti-mousecd107a(biolegend,clone,1d4b)，alexa700anti-mousecd62l(biolegend,clone,mel-14)和pe/cy7anti-mousecd127(biolegend,clone,a7r34)，按說明書建議濃度進行細胞表面標示物的染色。將上述抗體稀釋于cellstainingbuffer(biolegend)，然后4℃孵育30分鐘；6)使用3mlpbs+2％fbs洗滌一次，每管加入200μlcytofix/cytopermtmfixationandpermeabilizaitonsolution(bd)，4℃孵育20分鐘，對細胞進行固定和穿孔；7)20分鐘后，每管加入1ml1×perm/washtmbuffer(bd)，4℃，600g離心5分鐘，棄上清；8)使用1×perm/washtmbuffer按說明書推薦使用量先稀釋好適量的peanti-mouseifn-γ(biolegend,clonexmg1.2),apcanti-mousetnf-α(biolegend,clonemp6-xt22)和brilliantviolet605tmanti-mouseil-2(biolegend,clone,jes6-5h4)，每管加50μl，并輕輕混勻，于4℃孵育30分鐘。最后，每管分別用1ml1×perm/washtmbuffer和3ml的pbs各洗一次，棄上清后用200μlpbs重懸，用于檢測。9)為了在檢測時調節(jié)各染料間的熒光補償，設置不染色細胞管，并將以上各熒光染料抗體單染anti-rat/hamsterig,κ/negativecontrolcompensationparticlesset(bd)。使用bdfacscanto流式細胞儀進行樣品檢測，使用bdfacsdiva軟件對檢測結果進行分析。2.5重組腺病毒zikv疫苗刺激細胞免疫結果ad5-env和ad5-sig-prm-env以1×108ifu/只的劑量免疫balb/c小鼠2周后，其脾細胞可檢測到強烈的特異性細胞免疫反應。細胞內細胞因子染色結果(圖7)顯示，ad5-env和ad5-sig-prm-env均可誘導balb/c小鼠產生強烈的zikvenv特異性cd8+t細胞和cd4+t細胞免疫反應。兩者cd8+t細胞的ifn-γ和il-2陽性細胞的百分比以及cd4+t細胞的ifn-γ和il-2陽性細胞百分比均顯著高于ad5-luc對照小鼠。盡管ad5-env誘導產生的細胞免疫水平略高于ad5-sig-prm-env，但兩者誘導產生的cd8+t細胞和cd4+t細胞免疫反應無顯著性差異。同時，ad5-sig-prm-env免疫的小鼠還誘導產生了低水平的zikvprm特異的細胞免疫反應，prm特異的cd8+t細胞和cd4+t細胞ifn-γ陽性細胞的百分比均顯著高于ad5-env免疫的小鼠和ad5-luc免疫的小鼠。ifn-γ和il-2elispot檢測結果(圖8)進一步證實了細胞內細胞因子染色的檢測結果，說明ad5-env和ad5-sig-prm-env均可誘導產生強烈的細胞免疫反應?？偨Y：研究結果表明寨卡疫苗免疫后主要起保護作用的是體液免疫(laroccara,abbinkp,peronjp,etal.vaccineprotectionagainstzikavirusfrombrazil.nature.2016aug25；536(7617):474-8.)。通過密碼子優(yōu)化，重組寨卡病毒env的表達量得到明顯的提高，通過進一步采用與prm蛋白融合表達的方式，表達量進一步得以提高，盡管表達量提高后細胞免疫水平保持不變，但要達到相同的體液免疫水平，免疫劑量可以降低一個數量級。這可以大大降低疫苗制備、運輸和儲存方面的成本，此外，也有助于免疫時減少不良副反應的發(fā)生。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所<120>一種以人ad5復制缺陷型腺病毒為載體的寨卡病毒病疫苗<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>1512<212>dna<213>zikavirus<400>1atccgctgcattggtgtctcgaaccgcgatttcgtggagggcatgagcggcgggacctgg60gtggacgtggtgctggaacatggcggctgcgtgactgtgatggcccaggataaacccacc120gtggacatcgagttagtcacaactactgtgtccaatatggccgaggtgagatcgtactgc180tacgaggcctcgatctcggatatggccagtgattcccgctgcccaacccagggggaggcg240tacctggacaaacagagtgatacacagtacgtgtgcaagcggaccctcgtggaccgcggg300tgggggaacggctgcggactgttcggcaagggctccctggtgacttgtgctaaattcgcc360tgcagtaagaagatgactggcaagagtatccagccggagaatctcgagtaccgcatcatg420ctgtccgtgcacggatcgcagcactcgggcatgatcgtaaacgacaccggccacgagact480gacgagaaccgcgcgaaagtcgagatcacccccaatagtccccgggctgaggcgaccctg540ggaggcttcgggagtctcgggctggactgcgagccacggacaggtctcgacttttccgat600ctttactatctcactatgaataataagcactggctggtgcacaaggagtggttccacgat660attccactcccctggcacgccggcgcagacaccggcactccacattggaataacaaagag720gccctggtcgagttcaaggatgcgcatgccaagcgccagacggtggtggtgctgggctcc780caggagggggctgtacacacagcgctcgctggggccctggaggccgagatggatggggct840aaagggcgcctgagcagcgggcaccttaagtgcaggctcaagatggacaaactgaggctg900aagggcgtgagctactcactgtgcaccgctgctttcacgtttacgaagatccctgctgag960accctgcacggtaccgtgacggtggaggttcagtacgccggtaccgatggcccttgcaaa1020gtgccagcacagatggctgtggatatgcagactctcacgcctgtcggccgcctgataacg1080gctaatcccgtgataacagaatcgaccgaaaattctaagatgatgctggagctggacccg1140ccattcggcgattcctatatcgtgatcggggtgggagagaagaagatcacacatcactgg1200caccgcagcggttctactatcggcaaagcattcgaggccaccgtgcggggagccaagcgg1260atggctgtgctgggggacaccgcctgggactttggttcggtgggcggcgcccttaactcc1320ctcgggaagggcatacatcagattttcggagcggccttcaagtccctcttcgggggcatg1380tcctggttctcccagatcctgatcggtactctgctgatgtggctgggcctcaataccaag1440aacggcagcatctccctgatgtgtctcgcgctgggaggagtcctgatcttcctgtccacc1500gccgtgtccgcc1512<210>2<211>504<212>dna<213>zikavirus<400>2gctgaggtgacccgtcgcggctccgcttactatatgtatctggacaggaacgacgccggc60gaggccatcagtttccccactacgctgggtatgaacaagtgttacatccagatcatggac120ctgggccacatgtgcgatgccacgatgagttacgaatgtccaatgctggacgagggtgtt180gagcctgatgatgtggactgctggtgcaacacgaccagcacctgggtcgtgtacgggact240tgtcaccacaagaagggcgaggccagacggtccagacgcgcggtgacattgccttcccac300tcaacgcgcaaactccagacccggtcccagacctggctggagagtcgggagtatacgaag360catctcatccgcgtggagaattggatcttccgcaaccccggcttcgccctggccgccgcc420gcgattgcttggctgctggggtctagcacatcccagaaggtcatctacctggtaatgatc480ctgctcatcgcccccgcctattcc504<210>3<211>54<212>dna<213>zikavirus<400>3ggcgctgagacatctgttgggatcgtcgggcttctccttaccacggcgatggca54<210>4<211>2070<212>dna<213>zikavirus<400>4ggcgctgagacatctgttgggatcgtcgggcttctccttaccacggcgatggcagctgag60gtgacccgtcgcggctccgcttactatatgtatctggacaggaacgacgccggcgaggcc120atcagtttccccactacgctgggtatgaacaagtgttacatccagatcatggacctgggc180cacatgtgcgatgccacgatgagttacgaatgtccaatgctggacgagggtgttgagcct240gatgatgtggactgctggtgcaacacgaccagcacctgggtcgtgtacgggacttgtcac300cacaagaagggcgaggccagacggtccagacgcgcggtgacattgccttcccactcaacg360cgcaaactccagacccggtcccagacctggctggagagtcgggagtatacgaagcatctc420atccgcgtggagaattggatcttccgcaaccccggcttcgccctggccgccgccgcgatt480gcttggctgctggggtctagcacatcccagaaggtcatctacctggtaatgatcctgctc540atcgcccccgcctattccatccgctgcattggtgtctcgaaccgcgatttcgtggagggc600atgagcggcgggacctgggtggacgtggtgctggaacatggcggctgcgtgactgtgatg660gcccaggataaacccaccgtggacatcgagttagtcacaactactgtgtccaatatggcc720gaggtgagatcgtactgctacgaggcctcgatctcggatatggccagtgattcccgctgc780ccaacccagggggaggcgtacctggacaaacagagtgatacacagtacgtgtgcaagcgg840accctcgtggaccgcgggtgggggaacggctgcggactgttcggcaagggctccctggtg900acttgtgctaaattcgcctgcagtaagaagatgactggcaagagtatccagccggagaat960ctcgagtaccgcatcatgctgtccgtgcacggatcgcagcactcgggcatgatcgtaaac1020gacaccggccacgagactgacgagaaccgcgcgaaagtcgagatcacccccaatagtccc1080cgggctgaggcgaccctgggaggcttcgggagtctcgggctggactgcgagccacggaca1140ggtctcgacttttccgatctttactatctcactatgaataataagcactggctggtgcac1200aaggagtggttccacgatattccactcccctggcacgccggcgcagacaccggcactcca1260cattggaataacaaagaggccctggtcgagttcaaggatgcgcatgccaagcgccagacg1320gtggtggtgctgggctcccaggagggggctgtacacacagcgctcgctggggccctggag1380gccgagatggatggggctaaagggcgcctgagcagcgggcaccttaagtgcaggctcaag1440atggacaaactgaggctgaagggcgtgagctactcactgtgcaccgctgctttcacgttt1500acgaagatccctgctgagaccctgcacggtaccgtgacggtggaggttcagtacgccggt1560accgatggcccttgcaaagtgccagcacagatggctgtggatatgcagactctcacgcct1620gtcggccgcctgataacggctaatcccgtgataacagaatcgaccgaaaattctaagatg1680atgctggagctggacccgccattcggcgattcctatatcgtgatcggggtgggagagaag1740aagatcacacatcactggcaccgcagcggttctactatcggcaaagcattcgaggccacc1800gtgcggggagccaagcggatggctgtgctgggggacaccgcctgggactttggttcggtg1860ggcggcgcccttaactccctcgggaagggcatacatcagattttcggagcggccttcaag1920tccctcttcgggggcatgtcctggttctcccagatcctgatcggtactctgctgatgtgg1980ctgggcctcaataccaagaacggcagcatctccctgatgtgtctcgcgctgggaggagtc2040ctgatcttcctgtccaccgccgtgtccgcc2070當前第1頁12當前第1頁12