本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用大腸桿菌重組工程菌，生產(chǎn)玉米黃素。

背景技術(shù)：

玉米黃素是一種高價(jià)值的類胡蘿卜素，除用作保健品，化妝品，食物等，臨床上還廣泛用于治療老年性黃斑病變。隨著玉米黃素的市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，原玉米黃素的生產(chǎn)方式(化學(xué)合成和直接從植物提純)難以穩(wěn)定的供給市場(chǎng)。因此，急需要提高玉米黃素的產(chǎn)量。

目前已有多個(gè)課題組報(bào)道了可用工程大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)玉米黃素(albrechtetal.biotechnollett1999,21(9):791–795；nishizakietal.,applenvironmicrobiol2007；73(4):1355–1361；lietal.,jindmicrobiolbiot.2015,42,627-636)。其中l(wèi)ietal.報(bào)道的工程大腸桿菌的玉米黃素產(chǎn)量最高，達(dá)到11.95mg/gdcw(菌干重)。

利用大腸桿菌生成玉米黃素，通常是先合成中間物質(zhì)ipp(異戊二烯焦磷酸)，再生成玉米黃素。

ipp(異戊二烯焦磷酸)為不僅為玉米黃素的前體,還是許多萜類化合物的前體，如番茄紅素、胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等類胡蘿卜素，檸檬烯和蒎烯等單萜化合物，發(fā)呢烯、沒(méi)藥烯和紫穗槐-4,11-二烯等類倍半萜類化合物，紫杉烯等雙萜類化合物等。

大腸桿菌由糖酵解途徑中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合通過(guò)dxp途徑(圖1)來(lái)合成ipp。而一些真核細(xì)胞如酵母，則是通過(guò)甲羥戊酸(mev)途徑(圖1)來(lái)合成ipp。

本領(lǐng)域人員研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中引入釀酒酵母的mev途徑，能夠增加ipp的供給，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物異戊烯類化合物的生產(chǎn)效率。

然而，他們所引入的mev途徑并沒(méi)有考慮途徑內(nèi)每個(gè)基因間的協(xié)調(diào)表達(dá)問(wèn)題，mev途徑內(nèi)基因間表達(dá)不協(xié)調(diào)導(dǎo)致mev途徑中間產(chǎn)物積累，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。目前為止，也沒(méi)有將mev途徑引入大腸桿菌，用于生產(chǎn)玉米黃素。

tigr(tunableintergenicregions，可調(diào)基因區(qū)域)是基因與基因間一段的非編碼序列，利用tigr，可以同時(shí)協(xié)同多個(gè)基因的表達(dá)。pfleger等報(bào)道了一種tigr(可調(diào)基因間隔區(qū))代謝通道技術(shù)，即在兩個(gè)基因間插入tigr能很好地協(xié)調(diào)基因的表達(dá)，他們利用該技術(shù)對(duì)釀酒酵母mev上游途徑的基因間插入了tigr后，使其合成甲羥戊酸的量提稿7倍(naturebiotechnology2006,24:1027-1032)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段，利用該重組基因片段可以提高ipp產(chǎn)量。

本發(fā)明的目的還在于提供一種含有上述重組片段的產(chǎn)玉米黃素大腸桿菌，利用所述的大腸桿菌可以提高玉米黃素的產(chǎn)量。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種tigr序列。

所述序列選自如seqidno.3所述的tigr3序列或如seqidno.4所述的tigr4序列。

本發(fā)明提供了一種tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段。

所述的mev途徑包括mev上游途徑基因和mev下游途徑基因。

所述的mev上游途徑基因包括：

atob：乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；

hmgs：羥甲基戊二酰輔酶a合成酶基因；

hmgr：羥甲基戊二酰輔酶a還原酶基因；

所述的mev上游途徑基因atob與hmgs間插有tigr1序列，hmgs與hmgr之間插有tigr2序列。

所述的tigr1如seqidno.1所示；

所述的tigr2如seqidno.2所示；

所述的mev下游途徑基因包括：

mk：甲羥戊酸激酶基因；

pmk：磷酸甲羥戊酸激酶基因；

mvd：焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。

所述的mev下游途徑基因mk與pmk間插有tigr3序列，pmk與mvd之間插有tigr4序列。

所述的tigr3如seqidno.3所示；

所述的tigr4如seqidno.4所示。

所述tigr序列既可以經(jīng)全合成，也可以采用pfleger等報(bào)道的文庫(kù)方法篩選得到(naturebiotechnology2006,24:1027-1032)。

本發(fā)明提供的tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段還包含啟動(dòng)子p1。

所述的啟動(dòng)子p1可以是p37、pgade、ptrc、ptac、pbad和placuv5等大腸桿菌啟動(dòng)子；優(yōu)選地，為pgade。

本發(fā)明提供的tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段還包含idi和ispa基因。

本發(fā)明提供的tigr調(diào)控mev途徑如圖2所示。

所述的mev途徑的第一個(gè)基因atob來(lái)自大腸桿菌；其他基因(atob、hmgs、hmgr、mk、pmk、mvd、idi、ispa)可來(lái)自于釀酒酵母、也可以來(lái)其他微生物，如金黃色釀膿葡萄球菌(staphylococcusaureus)、博德特氏菌(bordetellapetrii)、食酸戴爾福特菌(delftiaacidovorans)和甲羥戊酸假單胞菌(pseudomonasmevalonii)等。既可以是天然基因、也可以是其突變基因。既可以全部來(lái)自于一種上述微生物、也可以來(lái)自上述兩種或多種微生物的組合。

在本發(fā)明的實(shí)施例中mk、pmk和mvd均選自酵母菌，分別為erg12，erg8和erg19。

利用本發(fā)明的tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段，可用于產(chǎn)ipp為前體的異戊烯類化合物的大腸桿菌，包括番茄紅素、胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等類胡蘿卜素，檸檬烯和蒎烯等單萜化合物，發(fā)呢烯、沒(méi)藥烯和紫穗槐-4,11-二烯等類倍半萜類化合物，紫杉烯等雙萜類化合物等。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，用于生產(chǎn)玉米黃素。

本發(fā)明提供了一種含tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段的質(zhì)粒制備方法，具體如下：

s1.tigr調(diào)控的mev上游途徑的構(gòu)建

1)以f1/f2為引物、大腸桿菌escherichiacolidh5基因組為模板，pcr擴(kuò)增atob基因，連接到pbad33載體上，得到pbad33-atob；

2)以f3/f4為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增hmgs基因，連接到pmd18-t載體上，得到pmd-hmgs；

3)以f5/f6為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增thmgr基因，連接到pmd18-t載體上，得到pmd-thmgr；

4)以f7/f8為引物、pmd-hmgs為模板，pcr擴(kuò)增；以f9/f6為引物、pmd-thmgr為模板，pcr擴(kuò)增；

5)以f7/f6為引物、上一步膠回收的2個(gè)pcr片段為模版，pcr擴(kuò)增，連接到pbad33-atob的smai/psti間，得到pbad33-mevttigr。

6)nhei/psti酶切pbad33-mevttigr，連接到pzsbp的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到pzs-mevttigr.

seqidno.5

f1:gctgagctctttcggaattaaaggagcatcaaatatgaaaaattgtgtcatcgtcag(saci)

seqidno.6

f2:gatcccgggttaattcaaccgttcaatcacc(smai)

seqidno.7

f3:tcaggatacagtatctgcggtaccggaggacagctaaatgaaactgtccactaaactgt

seqidno.8

f4:gggtggtcgcgcaccgggatcaggagatcttgctaggcttattttttaacatcgtaagat

seqidno.9

f5:tatcgtcgcctccgagacaccatcattgtataggcggaggattacactatggaccaactggtgaaaactg

seqidno.10

f6:gctactgcagttaggatttaatgcaggtgacgg(psti)

seqidno.11

f7:tctcccggggcctagcaagatctcctgatcaggatacagtatctgcggtaccg(smai)

seqidno.12

f8:ggcgacgatacgccaatcctcagactggcccagactatgcagatgtccgggtggtcgcgcaccgggatcagg

seqidno.13

f9:atctgcatagtctgggccagtctgaggattggcgtatcgtcgcctccgagac

s2.mev下游途徑pbad24-mevbis的構(gòu)建

1)分別以f10/f11、f12/f13和f14/f15為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增erg12、erg19和erg8基因，連接到pbad24上，得到pbad24-mevb。

seqidno.14

f10:ctagctagctttcggaattaaaggagcatcaaatatgtctctgccgttcctg(nhei)

seqidno.15

f11:ctacccgggaaactcgagttatgaagtccatggtaaattcg(smai/xhoi)

seqidno.16

f12:gatcccgggtttcggaattaaaggagcatcaaatatgaccgtttacacggcatcc(smai)

seqidno.17

f13:tgcctgcagccaatcgatttatttctttggtagaccag(psti/clai)

seqidno.18

f14:attctcgagaaaagggccctttcggaattaaaggagcatcaaatatgtctgagctgcgtgccttctctgccccaggt(xhoi/apai)

seqidno.19

f15:attcccgggaaaaactagtttatttatcaagataagtttccgga(smai/spei)

2)以f16/f17為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增idi基因，連接到pmd-18t上，并點(diǎn)突變?nèi)コ齭pei酶切位點(diǎn)，得到pmd-idi。

seqidno.20

f16:atcgattttcggaattaaggaggtaataaatatgcaaacggaacacgtcatt(clai)

seqidno.21

f17:gtcgacaaaagatctttatttaagctgggtaaatgc(psti/bglii)

3)以f18/f19為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增ispa基因，克隆到pmd-idi的bglii/psti間，并并點(diǎn)突變?nèi)コ齨hei和smai酶切位點(diǎn)，得到pmd-idi-ispa。然后用clai/psti酶切pmd-idi-ispa，并將idi-ispa片段連接到pbad24-mevb上，得到pbad24-mevbis。

seqidno.22

f18:ttagtcgactttcggaattaaggaggtaataaatatggactttccgcagcaactcg(bamhi)

seqidno.23

f19:ttaagcatgcttatttattacgctggatgatg(psti)

s3.tigr調(diào)控mev下游途徑的構(gòu)建

1)在pbad24-mevbis中插入如下tigr序列，得到pbad24-mevbtigris

erg12與erg8基因間tigr序列為seqidno.3：

tigr3:5'-gcctagcaagatctcctgatcccggtgcgcgaccacccggacatctgcatagtctgggtggatcaggtacacttacacttgccttgaatttacagtatttcagttaccgctctatccttatccttatccgctcaagataaccggataccggcccgatcggtaccgcagatactgaatcc-3'

erg8與erg19基因間tigr序列為seqidno.4：

tigr4:5'-gcctagcaagatctcctgatccacctttgatggctagaaaaattaagctgcggacatctgcatagtctgggccagtctgaggactggcggatcagggccttgaatttacagtatttaatgaactagcgttccgagtgcatgccttatccgctcaagacatgcactcggaacgcatctagggtaccgcagatactgtatcc-3'

上述tigr序列既可以經(jīng)全合成，也可以采用pfleger等報(bào)道的文庫(kù)方法篩選得到(naturebiotechnology2006,24:1027-1032)。

2)用nhei/psti酶切pbad24-mevbtigris，連接到pzsbp的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到pzs-mevbtigris。

s4.tigr調(diào)控mev途徑的構(gòu)建

1)用avrii/sali酶切pzs-mevbtigris，連接到pzs-mevttigr的xbai/sali間，得到tigr調(diào)控mev途徑質(zhì)粒pzs-mevttigr-mevbtigris。

2)以f20/21為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增基因gade的啟動(dòng)子，連接到pzs-mevttigr的bglii/nhei間，得到pzspgade-mevttigr。然后按1)的方法，與pzs-mevbtigris進(jìn)行組裝，得到pzspgade-mevttigr-mevbtigris。

seqidno.24

f20:caacagatctttaatactctctccgctacg(bglii)

seqidno.25

f21:atatacgctagctcgtttcgaatatgtcatcc(nhei)

本發(fā)明的重組基因片段中，大腸桿菌啟動(dòng)子的存在對(duì)于玉米黃素的產(chǎn)量提高起重要作用。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌啟動(dòng)子的存在，對(duì)于產(chǎn)量有58％-71％的提升。所述的大腸桿菌可以是p37、pgade、ptrc、ptac、pbad和placuv5等大腸桿菌啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，優(yōu)選的啟動(dòng)子為pgade。

本發(fā)明提供了一種含有上述tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段的產(chǎn)玉米黃素大腸菌。

所述的產(chǎn)玉米黃素大腸桿菌中tigr調(diào)控mev途徑的重組基因片段即可以用質(zhì)粒來(lái)表達(dá)、也可以整合到染色體上進(jìn)行表達(dá).

所述的產(chǎn)玉米黃素大腸桿菌為zeax(lixretal.,jindmicrobiolbiot.2015,42,627-636).

所述的大腸桿菌生產(chǎn)玉米黃素采用搖床發(fā)酵培養(yǎng)方式(詳見(jiàn)lixretal.,jindmicrobiolbiot.2015,42,627-636).

本發(fā)明取得的有益效果:

本發(fā)明首次將外源mev途徑引入到產(chǎn)玉米黃素的工程大腸桿菌中，尤其時(shí)引入tigr調(diào)控的mev途徑。并同時(shí)對(duì)mev整個(gè)途徑(包括上游的3個(gè)基因和下游的3個(gè)基因)進(jìn)行調(diào)控，協(xié)調(diào)平衡基因的表達(dá)，從而避免的甲羥戊酸途徑的中間產(chǎn)物積累及其對(duì)大腸桿菌的毒性。此外，tigr調(diào)控的mev途徑顯著提高了中間產(chǎn)物ipp的產(chǎn)量，從而提高了以ipp為前體物的玉米黃素的產(chǎn)量。

附圖說(shuō)明

圖1異戊二烯焦磷酸合成途徑.

atob:乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；hmgs:羥甲基戊二酰輔酶a合成酶基因；hmgr:羥甲基戊二酰輔酶a還原酶基因；mk(erg12):甲羥戊酸激酶基因；pmk(errg8):磷酸甲羥戊酸激酶基因；mvd(erg19):焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。

圖2tigr調(diào)控mev途徑

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施例不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本方案中，所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括pcr擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、dna片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)。

實(shí)施例1tigr調(diào)控的mev上游途徑的構(gòu)建

1)以f1/f2為引物、大腸桿菌escherichiacolidh5基因組為模板，pcr擴(kuò)增atob基因，連接到pbad33載體上，得到pbad33-atob；

2)以f3/f4為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增hmgs基因，連接到pmd18-t載體上，得到pmd-hmgs；

3)以f5/f6為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增thmgr基因，連接到pmd18-t載體上，得到pmd-thmgr；

4)以f7/f8為引物、pmd-hmgs為模板，pcr擴(kuò)增；以f9/f6為引物、pmd-thmgr為模板，pcr擴(kuò)增；

5)以f7/f6為引物、上一步膠回收的2個(gè)pcr片段為模版，pcr擴(kuò)增，連接到pbad33-atob的smai/psti間，得到pbad33-mevttigr。

6)nhei/psti酶切pbad33-mevttigr，連接到pzsbp的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到pzs-mevttigr

seqidno.5

f1:gctgagctctttcggaattaaaggagcatcaaatatgaaaaattgtgtcatcgtcag(saci)

seqidno.6

f2:gatcccgggttaattcaaccgttcaatcacc(smai)

seqidno.7

f3:tcaggatacagtatctgcggtaccggaggacagctaaatgaaactgtccactaaactgt

seqidno.8

f4:gggtggtcgcgcaccgggatcaggagatcttgctaggcttattttttaacatcgtaagat

seqidno.9

f5:tatcgtcgcctccgagacaccatcattgtataggcggaggattacactatggaccaactggtgaaaactg

seqidno.10

f6:gctactgcagttaggatttaatgcaggtgacgg(psti)

seqidno.11

f7:tctcccggggcctagcaagatctcctgatcaggatacagtatctgcggtaccg(smai)

seqidno.12

f8:ggcgacgatacgccaatcctcagactggcccagactatgcagatgtccgggtggtcgcgcaccgggatcagg

seqidno.13

f9:atctgcatagtctgggccagtctgaggattggcgtatcgtcgcctccgagac

實(shí)施例2mev下游途徑pbad24-mevbis

1)分別以f10/f11、f12/f13和f14/f15為引物、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因組為模板，pcr擴(kuò)增erg12、erg19和erg8基因，連接到pbad24上，得到pbad24-mevb。

seqidno.14

f10:ctagctagctttcggaattaaaggagcatcaaatatgtctctgccgttcctg(nhei)

seqidno.15

f11:ctacccgggaaactcgagttatgaagtccatggtaaattcg(smai/xhoi)

seqidno.16

f12:gatcccgggtttcggaattaaaggagcatcaaatatgaccgtttacacggcatcc(smai)

seqidno.17

f13:tgcctgcagccaatcgatttatttctttggtagaccag(psti/clai)

seqidno.18

f14:attctcgagaaaagggccctttcggaattaaaggagcatcaaatatgtctgagctgcgtgccttctctgccccaggt(xhoi/apai)

seqidno.19

f15:attcccgggaaaaactagtttatttatcaagataagtttccgga(smai/spei)

2)以f16/f17為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增idi基因，連接到pmd-18t上，并點(diǎn)突變?nèi)コ齭pei酶切位點(diǎn)，得到pmd-idi。

seqidno.20

f16:atcgattttcggaattaaggaggtaataaatatgcaaacggaacacgtcatt(clai)

seqidno.21

f17:gtcgacaaaagatctttatttaagctgggtaaatgc(psti/bglii)

3)以f18/f19為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增ispa基因，克隆到pmd-idi的bglii/psti間，并并點(diǎn)突變?nèi)コ齨hei和smai酶切位點(diǎn)，得到pmd-idi-ispa。然后用clai/psti酶切pmd-idi-ispa，并將idi-ispa片段連接到pbad24-mevb上，得到pbad24-mevbis。

seqidno.22

f18:ttagtcgactttcggaattaaggaggtaataaatatggactttccgcagcaactcg(bamhi)

seqidno.23

f19:ttaagcatgcttatttattacgctggatgatg(psti)

實(shí)施例3tigr調(diào)控mev下游途徑的構(gòu)建

1)在pbad24-mevbis中插入如下tigr序列，得到pbad24-mevbtigris

erg12與erg8基因間tigr序列為seqidno.3：

tigr3:5'-gcctagcaagatctcctgatcccggtgcgcgaccacccggacatctgcatagtctgggtggatcaggtacacttacacttgccttgaatttacagtatttcagttaccgctctatccttatccttatccgctcaagataaccggataccggcccgatcggtaccgcagatactgaatcc-3'

erg8與erg19基因間tigr序列為seqidno.4：

tigr4:5'-gcctagcaagatctcctgatccacctttgatggctagaaaaattaagctgcggacatctgcatagtctgggccagtctgaggactggcggatcagggccttgaatttacagtatttaatgaactagcgttccgagtgcatgccttatccgctcaagacatgcactcggaacgcatctagggtaccgcagatactgtatcc-3'

上述tigr序列既可以經(jīng)全合成，也可以采用pfleger等報(bào)道的文庫(kù)方法篩選得到(naturebiotechnology2006,24:1027-1032)。

2)用nhei/psti酶切pbad24-mevbtigris，連接到pzsbp的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到pzs-mevbtigris。

實(shí)施例4tigr調(diào)控mev途徑的構(gòu)建

1)用avrii/sali酶切pzs-mevbtigris，連接到pzs-mevttigr的xbai/sali間，得到tigr調(diào)控mev途徑質(zhì)粒pzs-mevttigr-mevbtigris。

2)以f20/21為引物、大腸桿菌基因組為模板，pcr擴(kuò)增基因gade的啟動(dòng)子，連接到pzs-mevttigr的bglii/nhei間，得到pzspgade-mevttigr。然后按1)的方法，與pzs-mevbtigris進(jìn)行組裝，得到pzspgade-mevttigr-mevbtigris。

seqidno.24

f20:caacagatctttaatactctctccgctacg(bglii)

seqidno.25

f21:atatacgctagctcgtttcgaatatgtcatcc(nhei)

實(shí)施例5生產(chǎn)玉米黃素的方法

將實(shí)施例4中的tigr調(diào)控mev途徑質(zhì)粒pzs-mevttigr-mevbtigris和pzspgade-mevttigr-mevbtigris分別轉(zhuǎn)化到產(chǎn)玉米黃素的大腸桿菌zeax(lixretal.,jindmicrobiolbiot.2015,42,627-636)，并按該文所介紹的方法進(jìn)行搖床培養(yǎng)發(fā)酵，分析其合成玉米黃素的情況，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1不同mev途徑對(duì)大腸桿菌合成玉米黃素的影響

由表1可看出，引入外源甲羥戊酸途徑能促進(jìn)大腸桿菌合成玉米黃素的能力，而且pgade驅(qū)動(dòng)的tigr調(diào)控mev途徑的效果最佳，其玉米黃素的產(chǎn)量為22.48mg/gdcw，是lietal(lixretal.,jindmicrobiolbiot.2015,42,627-636)報(bào)道的兩倍((11.95±0.21mg/gdcw)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方案顯著提高了玉米黃素的產(chǎn)量。