本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用樺褐孔菌固體發(fā)酵農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)酸性纖維素酶的工藝。

背景技術(shù)：

植物纖維在自然界中普遍存在，而大部分的植物纖維因無法分解利用而廢棄，如果這些纖維素能被合理利用，不僅可以作為新資源、新能源為人類造福，同時也可以緩解或解決農(nóng)作物資源對環(huán)境的污染問題，具有重大的戰(zhàn)略意義。

纖維素分子是由β-2d葡萄糖分子以β-1,4糖苷鍵結(jié)合形成的鏈狀聚合物,所以很難分解。纖維素酶可以將纖維素最終水解成葡萄糖。而纖維素酶一般只在微生物體內(nèi)產(chǎn)生很少一部分動物也可以產(chǎn)生纖維素酶。目前纖維素的降解一般是由微生物分解實現(xiàn)的，現(xiàn)在人們正在研究利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解纖維素產(chǎn)生葡萄糖，再以葡萄糖為原料生產(chǎn)其他物質(zhì)。這已經(jīng)成為一個熱門話題，當(dāng)前研究較多的能夠降解天然纖維的微生物主要是木霉、青霉、曲霉和白腐菌等真菌，主要原因是這類真菌產(chǎn)纖維素酶系較全，能較好地降解天然纖維素。但研究野生纖維素酶產(chǎn)出菌主要存在兩個問題，一是產(chǎn)纖維素酶的菌株的產(chǎn)酶量低，二是產(chǎn)生的纖維素酶的活力不高，也就是分解纖維素的能力較弱。人們主要是通過菌種篩選、基因克隆等手段來提高酶的產(chǎn)量和活力，以降低產(chǎn)酶成本，改進(jìn)酶的回收利用，二是改變天然纖維素酶的結(jié)構(gòu)，以提高其對酶作用的敏感性。并且自然界中廢棄的植物纖維資源用于生產(chǎn)蛋白飼料的研究也是目前的熱點之一，利用高效降解植物纖維的纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理后再經(jīng)過微生物發(fā)酵能夠有效提高植物原料中的蛋白含量用于飼料成分，具有重要的應(yīng)用價值。

在微生物發(fā)酵的過程中，纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力低且質(zhì)量不穩(wěn)定是目前纖維素酶研究與實際應(yīng)用的主要瓶頸，如何有針對性的提高纖維素酶活性的技術(shù)還有待提高:現(xiàn)在的研究渠道顯示，纖維素酶能夠在其它工程菌中得以表達(dá)，但是怎樣研究出一套既能表達(dá)纖維素酶又能使其具有良好的熱穩(wěn)定性和低的末端產(chǎn)物抑制調(diào)節(jié)以及高產(chǎn)量的研究方案，是現(xiàn)在研究者探討的問題:尤其現(xiàn)在我國的纖維素酶還大量依靠于國外進(jìn)口，其價格非常昂貴，大大限制了其應(yīng)用范圍,生產(chǎn)國產(chǎn)化的纖維素酶以及降低纖維素酶的生產(chǎn)成本還是一個急待解決的問題。而要想進(jìn)一步提高纖維素酶的分泌能力，除選育優(yōu)良菌株外還必須對培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的大幅度積累。

隨著科學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，將有望選育出高產(chǎn)率、低成本的優(yōu)良生產(chǎn)菌株。至今尚未報道有關(guān)白腐真菌樺褐孔菌固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用樺褐孔菌固體發(fā)酵農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)酸性纖維素酶的工藝，設(shè)備投資少,后處理簡單,基本無污染,成本低，生產(chǎn)的纖維素酶具有較好的ph耐受性和溫度穩(wěn)定性。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種利用樺褐孔菌固體發(fā)酵農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)酸性纖維素酶的工藝，包括如下步驟：

（1）菌種活化：以樺褐孔菌為菌種，接種至斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得活化菌種；

（2）液體菌種培養(yǎng)：將活化菌種轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下?lián)u床培養(yǎng)3天得液體菌種；

（3）固體發(fā)酵：將液體菌種接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制初始ph至3.5-9.0，24-32℃下發(fā)酵培養(yǎng)10-15天；所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基由農(nóng)林廢棄物與營養(yǎng)鹽溶液按1g:1-4ml的配比，ph6.0，充分?jǐn)嚢瑁?21℃濕熱滅菌20min而得；

（4）酸性纖維素酶分離：發(fā)酵結(jié)束后，按照每1g發(fā)酵產(chǎn)物干重加10ml醋酸-醋酸鈉緩沖液的配比加入濃度50mm的ph5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌混合均勻，在28℃下振蕩浸提1h，4000r/min離心5min，透析，冷凍干燥。

作為優(yōu)選，所述農(nóng)林廢棄物為麩皮、玉米芯、櫸木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生殼中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，所述的營養(yǎng)鹽溶液配方為：(nh4)2so41.7g，kh2po42g，cacl20.3g，蛋白胨1g，tween-802ml，mgso40.3g，蒸餾水1000ml，微量元素混合液1ml；所述微量元素混合液每毫升含：feso40.005mg，mnso40.002mg，znso4·7h2o0.0016mg，cocl20.0014mg。本發(fā)明針對樺褐孔菌固體發(fā)酵，設(shè)計了特定的營養(yǎng)鹽溶液配方以適合固體發(fā)酵所需。其中，添加的tween-80是一種表面活性劑，在本發(fā)明中還具有誘導(dǎo)劑的作用，加入tween-80促進(jìn)了酸性纖維素酶的產(chǎn)生。

作為優(yōu)選，步驟（3）中液體菌種的接種量為每1g農(nóng)林廢棄物加0.1-0.8ml。

作為優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)基組成為：kh2po40.3g，mgso40.2g，酵母浸膏3g，蛋白胨0.5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000ml，ph自然，121℃濕熱滅菌20min。

作為優(yōu)選，所述斜面菌種培養(yǎng)基的配方為：麥芽浸膏40g/100ml，蛋白胨4g/100ml，瓊脂10g/100ml，ph值為5.4-5.6。

作為優(yōu)選，斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的參數(shù)為：溫度27-28℃，培養(yǎng)200-250小時。

作為優(yōu)選，所述酸性纖維素酶最適反應(yīng)溫度范圍為40℃-60℃，最適反應(yīng)ph范圍為3.0-4.0。

一種酸性纖維素酶的應(yīng)用，所述酸性纖維素酶用于稻稈和麥稈的降解糖化。

本發(fā)明的有益效果是：

固體發(fā)酵相比較液體發(fā)酵具有設(shè)備投資少,后處理簡單,基本無污染,成本低等優(yōu)點。

利用農(nóng)林廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料,節(jié)約了能源和材料,做到了廢物利用，改善環(huán)境，又有效降低了纖維素酶制備的成本。該措施遵從了我國節(jié)約資源和保護(hù)環(huán)境的基本國策，遵循了尊重自然、順應(yīng)自然、保護(hù)自然的理念。

本發(fā)明公開的產(chǎn)纖維素酶的白腐真菌樺褐孔菌在較廣泛的ph條件下均可產(chǎn)cmcase、濾紙纖維素酶和β-葡萄糖苷酶。

本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶具有較好的ph耐受性和溫度穩(wěn)定性。

本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶能用于稻稈、麥稈的降解糖化。

附圖說明

圖1是不同木質(zhì)纖維素對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

圖2是接種量對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

圖3是不同初始ph對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

圖4是水料比對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

圖5是培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后樺褐孔菌的產(chǎn)酶曲線。

圖6是酶促反應(yīng)溫度與酶活力的關(guān)系。

圖7是酶促反應(yīng)ph與酶活力的關(guān)系。

圖8是酸性纖維素酶熱穩(wěn)定性。

圖9是在酸性纖維素酶作用下的稻稈、麥稈隨時間變化的糖化曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實施例：

一種利用樺褐孔菌固體發(fā)酵農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)酸性纖維素酶的工藝，包括如下步驟：

（1）菌種活化：以樺褐孔菌為菌種（市售），接種至斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得活化菌種；所述斜面菌種培養(yǎng)基的配方為：麥芽浸膏40g/100ml，蛋白胨4g/100ml，瓊脂10g/100ml，ph值為5.4-5.6，斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的參數(shù)為：溫度27-28℃，培養(yǎng)200-250小時。

（2）液體菌種培養(yǎng)：將活化菌種轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下?lián)u床培養(yǎng)3天得液體菌種；所述種子培養(yǎng)基組成為：kh2po40.3g，mgso40.2g，酵母浸膏3g，蛋白胨0.5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000ml，ph自然，121℃濕熱滅菌20min。

（3）固體發(fā)酵：將液體菌種接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體菌種的接種量為每1g農(nóng)林廢棄物加0.1-0.8ml，控制初始ph至3.5-9.0，24-32℃下發(fā)酵培養(yǎng)10-15天；所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基由農(nóng)林廢棄物與營養(yǎng)鹽溶液按1g:1-4ml的配比，ph6.0，充分?jǐn)嚢瑁?21℃濕熱滅菌20min而得；所述農(nóng)林廢棄物為麩皮、玉米芯、櫸木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生殼中的一種或幾種。所述的營養(yǎng)鹽溶液配方為：(nh4)2so41.7g，kh2po42g，cacl20.3g，蛋白胨1g，tween-802ml，mgso40.3g，蒸餾水1000ml，微量元素混合液1ml；所述微量元素混合液每毫升含：feso40.005mg，mnso40.002mg，znso4·7h2o0.0016mg，cocl20.0014mg。

（4）酸性纖維素酶分離：發(fā)酵結(jié)束后，按照每1g發(fā)酵產(chǎn)物干重加10ml醋酸-醋酸鈉緩沖液的配比加入濃度50mm的ph5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌混合均勻，在28℃下振蕩浸提1h，4000r/min離心5min，透析，冷凍干燥。

工藝優(yōu)化：

1、固體發(fā)酵條件優(yōu)化

不同木質(zhì)纖維素對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：向250ml錐形瓶中分別加入5g不同種類的農(nóng)林廢棄物（麩皮、玉米芯、櫸木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生殼），2ml的接種量，于28℃、150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d后測定酶活。根據(jù)cmcase、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活的方法測定不同農(nóng)林廢棄物對酶活力的影響，確定最佳農(nóng)林廢棄物。如圖1所示，麩皮為最佳的底物。

接種量對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：在已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，分別按0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml的接種量接入液體菌種，28℃、150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d后測定酶活，根據(jù)cmcase、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活,確定不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。如圖2所示，最適接種量為2ml。

不同初始ph對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：在已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始酸堿值，使ph分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,于28℃、150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d后測定酶活,根據(jù)cmcase、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活力，確定最佳初始ph值。如圖3所示，最佳初始ph值為6.0。

水料比對固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在已優(yōu)化的培養(yǎng)基中,分別加入5ml、7.5ml、10ml、12.5ml、15ml、17.5ml、20ml改良mandels’營養(yǎng)鹽溶液，使各水平的水料比(營養(yǎng)鹽溶液體積/ml:農(nóng)林廢棄物質(zhì)量/g)分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,于28℃、150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d后測定酶活,根據(jù)cmcase、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活力,確定最佳水料比。如圖4所示，最佳水料比為1:2.5。

2、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后白腐真菌樺褐孔菌的產(chǎn)酶曲線

向前面實驗優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入液體菌種，于28℃、150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24h取樣測定固態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)酶（cmcase、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶）。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)培養(yǎng)至第10d時,cmcase和fpase酶活達(dá)到最大,分別為27.15iu/g,3.16iu/g,而β-glucosidase在第12d酶活力達(dá)到最大,為2.53iu/g。

酶促反應(yīng)溫度對纖維素酶活力的影響：在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃條件下分別進(jìn)行酶促反應(yīng),并測定相對酶活。如圖6所示，cmcase、fpase和β-glucosidase的最適反應(yīng)溫度分別為55℃,40℃和60℃。

酶促反應(yīng)ph對纖維素酶活力的影響：在ph為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的條件下分別進(jìn)行酶促反應(yīng)，并測定相對酶活。如圖7所示，cmcase、fpase和β-glucosidase的最適反應(yīng)ph分別為3.5,4.0和3.5。

纖維素酶的溫度穩(wěn)定性：粗酶液在50℃條件下分別保溫30min、60min、90min、120min、180min、240min、300min、360min、420min、480min、540min、600min、660min、720min、1440min、2880min和3000min后,在50℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定相對酶活。如圖8所示，在50℃下處理60min,具有50﹪的β-glucosidase酶活;在50℃下處理90min,fpase酶能夠保持53﹪的酶活;在50℃下處理720min,cmcase酶依然具有54﹪的酶活力。由此認(rèn)為,該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

稻稈、麥稈隨時間變化的糖化曲線：精確稱取1g生物質(zhì)材料(干基)放入100ml的錐形瓶中，按5fpu/g的量添加纖維素酶到每個錐形瓶中，加入10ml磷酸鹽緩沖液(50mm,ph5.0),0.005%疊氮化鈉作為抑菌劑。50℃培養(yǎng)箱中以150r/min的轉(zhuǎn)速震蕩反應(yīng)48小時進(jìn)行酶解。如圖9所示，取發(fā)酵培養(yǎng)12天的粗酶液降解稻稈、麥稈產(chǎn)糖能力最強,分別達(dá)125.362mg/g,130.244mg/g底物。

經(jīng)優(yōu)化，當(dāng)農(nóng)林廢棄物為麩皮，接種量為2ml，水料比為1:2.5，初始ph6.0時,搖床28℃培養(yǎng)至第10d,cmcase和fpase酶活達(dá)到最大，分別為27.15iu/g和3.16iu/g;而培養(yǎng)至第12d，β-葡萄糖苷酶達(dá)到最高活性，為2.53iu/g。

樺褐孔菌菌株在較廣泛的ph條件下均可產(chǎn)cmcase、濾紙纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，特別是在堿性條件下仍具有產(chǎn)纖維素酶的能力。

該纖維素酶的最適ph為3.5,在ph3.0-5.0范圍內(nèi),纖維素酶(cmcase、fpase和β-glucosidase）能夠維持其60%以上的酶活；cmcase、fpase和β-glucosidase的最適反應(yīng)溫度分別為55℃，40℃和60℃；在50℃下處理60min，具有50﹪的β-glucosidase酶活；在50℃下處理90min，fpase酶能夠保持53%的酶活；在50℃下處理720min,cmcase酶依然具有54%的酶活力。由此認(rèn)為，該酶是酸性纖維素酶，且具有良好的熱穩(wěn)定性。對稻稈、麥稈的水解糖化效果顯著。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。