本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域,涉及植酸酶凝膠制劑,尤其涉及耐
高溫植酸酶凝膠制劑。
背景技術(shù):
我國是世界玉米種植大國,70%的玉米用于生產(chǎn)飼料。玉米中50%~80%的磷以植酸形式存在,但這種形式的磷不能被豬禽等單胃動(dòng)物消化利用,隨動(dòng)物糞便排泄后還會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境。植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)的一類酶的總稱,可以降解飼料中含量豐富的植酸,不但可以釋放出有利于動(dòng)物生長發(fā)育的無機(jī)磷,同時(shí)也可以釋放出與植酸結(jié)合的其它營養(yǎng)物質(zhì),有利于豬禽等單胃動(dòng)物更好地吸收利用,降低飼料成本,減少動(dòng)物糞便中磷的排泄量,減輕環(huán)境污染。因此,植酸酶是目前應(yīng)用較多且前景較好的一種綠色飼料添加劑。植酸酶在應(yīng)用中存在的主要問題是植酸酶的耐熱性欠佳,在存放時(shí)以及飼料加工過程中造成酶活性降低甚至失活,造成酶的浪費(fèi)以及使用成本的提高。在中國,顆粒飼料約占飼料總產(chǎn)量的70%,市場(chǎng)需求量巨大。通常,飼料的生產(chǎn)需要經(jīng)過高溫制粒過程,一般為75℃一80℃,植酸酶在這樣的溫度下很容易失去部分活力,甚至完全失活。所以獲得高熱穩(wěn)定性的植酸酶是近年來植酸酶工業(yè)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前,獲得耐高溫植酸酶可以有以下幾種方法:(1)改變植酸酶的分子結(jié)構(gòu),用化學(xué)方法將植酸酶分子用糖基修飾,能在一定程度上提高植酸酶的耐熱性。(2)利用生物技術(shù)和基因定點(diǎn)突變技術(shù),培育新的植酸酶菌株。利用化學(xué)或生物學(xué)方法獲得新的植酸酶品種,可以從根本上上提高植酸酶耐高溫性能,并且取得了一些研究成果,如cn10659256a、cn106434850a、cn10638890a、106323964a、cn106260584a、cn10601102a、cn10601101a、cn10601000a、cn106119223a.。但是由于植酸酶的耐熱機(jī)理仍不清楚,因此,植酸酶新品種的開發(fā)尚缺乏理論依據(jù)。另外,植酸酶新品種的開發(fā)具有投入大,時(shí)間長、篩選困難、風(fēng)險(xiǎn)高的弊端,不適合中國的國情,而且開發(fā)出的新品種由于工藝不成熟,很容易受到工藝條件的影響,產(chǎn)生變異,導(dǎo)致酶產(chǎn)品性能不穩(wěn)定,難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
酶的固定化是改善酶性能的另一種方法,它是用化學(xué)或物理方法將酶固定在載體上,改變酶的周圍環(huán)境,以降低溫度對(duì)酶的影響,提高耐熱性能。與開發(fā)植酸酶的新品種相比,固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)可以采用傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)酶產(chǎn)品,工藝成熟,產(chǎn)品性能穩(wěn)定,有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另外,固定化的酶,不僅能克服自由酶的缺點(diǎn),還能保留自由酶原有的活性,而且還易于與其它組份分離,重復(fù)使用率高。此外,選擇組成不同的載體,還可以賦予酶載體部分所具有的獨(dú)特性能。因此,固定化酶技術(shù)自20世紀(jì)60年代發(fā)展以來,已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn),是酶工業(yè)的核心內(nèi)容之一(《中國甜菜糖業(yè)》,2007(1),29-32)。)。
酶的固定化載體包括無機(jī)材料和有機(jī)高分子材料。cn106333084a將植酸酶固定在膨潤土上,以期減少高溫造粒對(duì)植酸酶的影響。周建琴(《中國釀造》,2012,31(9),110-114.)以聚乙烯醇為原料,以戊二醛為交聯(lián)劑,得到交聯(lián)球型聚乙烯醇,經(jīng)與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)得到固定化載體,用吸附法將植酸酶固定在載體上。王成波(《黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2014,14,5,99-102.)以殼聚糖為原料,以戊二醛為交聯(lián)劑,制得固定化載體,用吸附法將植酸酶固定在載體上。有機(jī)高分子材料原料種類多,合成方法多樣,并且有機(jī)高分子材料強(qiáng)度小,易于加工成型。因此固定化酶越來越多地使用有機(jī)高分子材料作為載體。
廖妙飛(重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文)以殼聚糖為原料,以戊二醛為交聯(lián)劑,以碳酸鈣為致孔劑,用反相懸浮法制備出交聯(lián)殼聚糖;以二環(huán)己基碳二亞胺為縮合劑制備交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂,然后用吸附法將植酸酶固定在載體上。固定化酶的最適ph范圍是5.5-6.5,最適溫度范圍35-45℃。唐三三(食品工業(yè)科技,2010(9),1-4.))以海藻酸鈉、明膠、瓊脂、卡拉膠、殼聚糖為原料,采用瓊脂包埋法制備固定化奶酪氨酸酶,固定化酶的性能得到明顯改善。
由于載體的原料和制備方法不同,酶的固定化過程通常有兩種方法。一種是吸附法,由于載體的制備條件復(fù)雜,反應(yīng)慢,需要高溫加熱,為了避免破壞酶的活性,一般先通過一系列反應(yīng)制備出固體載體,然后再將固體載體浸入到酶液中,將植酸酶吸附在載體上。第二種方法是包埋法。包埋法是將載體的原料或中間體配成溶液,和植酸酶混合在一起,在載體固化的同時(shí),將植酸分子包埋在載體中。吸附法的特點(diǎn)是載體的制備與酶的固定化過程分別進(jìn)行,對(duì)載體的原料和制備方法選擇范圍廣,不必?fù)?dān)心在載體制備過程中,酶的活性遭到破壞。吸附法的缺點(diǎn)是酶的吸附速度慢,由于受到濃度梯度的影響,酶的吸附量小,且大多數(shù)酶只吸附在載體表面,提高溫度或延長吸附時(shí)間又容易造成酶的失活和浪費(fèi)。吸附在載體表面的酶在貯存和加工過程中容易脫落,結(jié)果使固定化酶的有效含量降低,使用時(shí)需要增大固定化酶的用量才能達(dá)到有效濃度,實(shí)際上增加了酶的使用成本,造成酶的浪費(fèi),不利于植酸酶的推廣應(yīng)用。而包埋法在載體固化的同時(shí)就將植酸酶包裹在其中,因此,原位包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是將酶包裹在載體內(nèi)部,不易脫落,并且酶的載有量增加,能大大有效提高植酸酶和載體的利用率,是固定化植酸酶理想的方法。但是原位包埋法的特點(diǎn)是載體的制備和酶的固定化過程同時(shí)進(jìn)行,在載體制備過程中,酶的活性遭到破壞,因此,對(duì)載體的原料選擇和制備方法有較高的要求。
文獻(xiàn)報(bào)道了以可溶性大分子藻酸鈉、明膠、瓊脂、卡拉膠、殼聚糖等作為固定化載體材料,將其植酸溶解在水中,不需要進(jìn)一步反應(yīng),采用包埋法,直接干燥固化,就能得到固定化植酸酶。該方法以水溶性大分子為載體原料,為實(shí)現(xiàn)包埋法固定植酸酶創(chuàng)造了條件。但是這些大分子在水中的溶解性有限,不能完全溶解,因此,會(huì)造成植酸酶在固定化載體中分布不均勻,使用的時(shí)候會(huì)表現(xiàn)出性能不穩(wěn)定。另外,雖然明膠、瓊脂、卡拉膠等這些大分子都可以作為食品添加劑,但是,畢竟不是人和動(dòng)物生長的必需物質(zhì),長期食用,勢(shì)必會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康造成不良的影響。隨著人們對(duì)酶的固定化載體的深入研究,以及人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視,天然大分子在載體中的應(yīng)用越來越引起人們的關(guān)注。天然大分子如纖維素、淀粉廣泛存在于大自然中,是一種既價(jià)廉又取之不盡的可再生資源,它們安全無毒,可生物降解,具有良好的生物相容性、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。因此,近年來天然多糖成為國內(nèi)外研究最熱門的固定化材料之一,但是天然多糖含有大量羥基,分子間作用力強(qiáng),不溶于水,反應(yīng)性差,難以加工成型,因此,限制了它們?cè)诤芏囝I(lǐng)域的應(yīng)用。目前,我國開展天然多糖在酶固定化載體材料中的應(yīng)用還處于起步階段,尤其是其實(shí)際的生產(chǎn)、應(yīng)用基本上是空白。因此,開發(fā)出質(zhì)優(yōu)價(jià)廉耐高溫的植酸酶制劑,促進(jìn)它們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,是酶工業(yè)和食品工業(yè)的重要任務(wù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種安全無毒且耐高溫植酸酶凝膠制劑,且合成簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。
考慮到醛基淀粉優(yōu)良的溶解性以及活潑的反應(yīng)活性,為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明以醛基淀粉和交聯(lián)劑為原料制備酶的固定化載體,同時(shí)將植酸酶包裹在其中。
所述耐高溫植酸酶凝膠制劑通過如下方法制備而成:將醛基淀粉溶液和植酸酶溶于水中,混合均勻,加入植酸酶配成前體溶液。然后將交聯(lián)劑溶液加到前體溶液中,室溫下攪拌使各組分混合均勻。室溫下靜置,使其充分反應(yīng),即可得到果凍狀載有植酸酶的水凝膠。將得到的水凝膠經(jīng)過切粒、干燥,即可得到植酸酶凝膠制劑。可以將其制成片狀和顆粒狀或微球。
所述的醛基淀粉為:可溶性淀粉經(jīng)氧化反應(yīng)得到的醛基淀粉;
所述的醛基淀粉溶液為:將醛基淀粉溶于水形成的水溶液,其質(zhì)量濃度優(yōu)選5%-20%。
所述的交聯(lián)劑為:賴氨酸、殼聚糖中的一種或兩種。
所述的醛基淀粉與交聯(lián)劑的摩爾數(shù)比優(yōu)選1:2-8。
本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)本發(fā)明的原料安全無毒,價(jià)廉易得,可生物降解。
(2)本發(fā)明選用醛基淀粉,克服了普通淀粉溶解性差、反應(yīng)活性低的缺點(diǎn)。不僅增加了淀粉的水溶性,而且提高了淀粉的反應(yīng)活性,為實(shí)現(xiàn)原位包埋法固定化植酸酶提供了技術(shù)支持。
(3)本發(fā)明原位包埋法固定化植酸酶,條件溫和,反應(yīng)快速,載體的制備和酶的固定化過程不無需加熱和其它催化劑,反應(yīng)快速,現(xiàn)象明顯,反應(yīng)過程容易控制。
(4)本發(fā)明的原料均能溶于水,植酸酶能溶解在固定化載體的前體溶液中,反應(yīng)后得到不溶于水的果凍狀水凝膠,反應(yīng)前前體是透明的溶液,當(dāng)醛基淀粉和交聯(lián)劑反應(yīng)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后,整個(gè)體系變成成了一塊不溶于水的固體凝膠,溶液中的所有物質(zhì)包括水和植酸酶都被包埋在凝膠當(dāng)中,酶幾乎沒有流失,能全部包埋在固定化載體中,酶的包埋效果好,且植酸酶在固定化載體中分布均勻,使用時(shí)制劑性能穩(wěn)定,可以做到定量投料,避免造成酶和酶制劑的浪費(fèi),有利于酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
(5)載體的制備過程可以和酶的固定化過程同時(shí)進(jìn)行,在室溫下反應(yīng)快速,十幾分鐘即可完成,并且不會(huì)對(duì)酶造成破壞,真正實(shí)現(xiàn)原位包埋法制備植酸酶凝膠制劑。
(6)本發(fā)明利用改性醛基淀粉中的醛基和交聯(lián)劑中的氨基反應(yīng)形成亞胺基,這類化合物很穩(wěn)定,并且通常有較好的耐熱性,使得植酸酶被緊緊包埋在含亞胺基的凝膠載體內(nèi)部,因此,植酸酶的耐熱性得到明顯的改善。在實(shí)際應(yīng)用中,亞胺基團(tuán)在酸性溶液中容易分解,產(chǎn)生原來的醛基化合物(即醛基淀粉)和氨基化合物(即賴氨酸)。本發(fā)明植酸酶凝膠制劑在酸性條件下(即在胃液中)固定化載體中亞胺基發(fā)生分解,凝膠制劑的交聯(lián)結(jié)構(gòu)發(fā)生解離,被包埋的植酸酶迅速游離出來,參與胃中食物的消化作用,使得植酸酶得到充分利用,而且產(chǎn)生的醛基淀粉和賴氨酸可以被動(dòng)物消化吸收。
可以看出,本發(fā)明制備的植酸酶凝膠制劑,不僅能提高酶的耐熱性,還具有在胃液中控制釋放的特性,有利于動(dòng)物健康。而且制備方法簡(jiǎn)便快速、反應(yīng)條件溫和,對(duì)植酸酶無傷害、酸酶負(fù)載量高,達(dá)50%以上,用率高,可達(dá)100%。載體原料安全無毒、可生物降解、原料組成少、價(jià)格低廉、植酸酶凝膠制劑可加工成片、顆粒和微球,能滿足不同領(lǐng)域應(yīng)用的需要,有利于植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
附圖說明
圖1為本發(fā)明植酸酶凝膠制劑分別在模擬胃液和模擬腸液中對(duì)植酸酶的釋放率。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施進(jìn)行更詳細(xì)的描述,但所述實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1醛基淀粉的制備
取10g可溶性淀粉于250ml加入水,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的淀粉乳,加熱至80-85℃糊化30分鐘。然后降溫到45℃,邊攪拌邊加入硫酸銅溶液(cu2+的用量為淀粉質(zhì)量的0.02%)作為催化劑,緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水(雙氧水用量與淀粉用量的摩爾比為3:1),在45℃反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束產(chǎn)物用無水乙醇沉析,得到的固體產(chǎn)物,用乙醚洗滌,50℃干燥,即可得到醛基淀粉,密封保存,備用。
實(shí)施例2植酸酶凝膠制劑的制備
稱取2g醛基淀粉于20ml的小燒杯中,加入8g蒸餾水,另取賴氨酸1.75g和植酸酶3g加入2ml蒸餾水中,將兩溶液混合均勻。室溫下反應(yīng)十幾分鐘,反應(yīng)物固化,即得到柔軟的載有植酸酶的水凝膠。將載有植酸酶的水凝膠小心從反應(yīng)器中拿出來用刀片切成片狀或顆粒狀,室溫下自然干燥,變硬化,即可得到片狀和顆粒狀植酸酶凝膠制劑。酸酶負(fù)載量54.4%。
實(shí)施例3植酸酶凝膠制劑的制備
將2g醛基淀粉溶解于20ml蒸餾水中,加入5g植酸酶,配成前體溶液。稱取殼聚糖2.5g,配成溶液,加到前體溶液中,迅速攪拌使混合均勻。室溫下靜置,反應(yīng)十幾分鐘,即得到載有植酸酶的水凝膠。小心取出來,用刀切成片狀或顆粒狀。室溫下干燥硬化,即得片狀和顆粒狀植酸酶凝膠制劑。酸酶負(fù)載量57.1%。
對(duì)本發(fā)明植酸酶凝膠制劑的熱穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定(樣品在各種溫度下保溫1h后,測(cè)定酶的相對(duì)活力)。結(jié)果如表1。
表1植酸酶自由酶和植酸酶凝膠制劑的溫度穩(wěn)定性
表1說明:自由酶的最適溫度范圍45-55℃,本發(fā)明的植酸酶凝膠制劑,最適溫度范圍45-70℃,最適溫度范圍明顯變寬,并且80℃受熱1小時(shí),酶活力仍能保持85%以上,大大提高了植酸酶的熱穩(wěn)定性。
結(jié)合圖1,可以看出:本發(fā)明植酸酶凝膠制劑,不管在模擬胃液中,還是在模擬腸液中,都要先有一個(gè)吸水溶脹過程,然后才能將水溶性的植酸酶釋放出來,因此,前30分鐘兩種溶液中植酸酶的釋放率都不高。但是,當(dāng)達(dá)到溶脹平衡以后,胃液中植酸酶的釋放率快速增加。這是由于在胃液中,酸酶不僅僅隨著凝膠制劑的溶脹而釋放出來,胃液中,亞胺基團(tuán)解離,凝膠制劑的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞,使包埋在里面的植酸酶迅速釋放出來,很快就全部釋放,參與消化過程。