本發(fā)明涉及冠狀病毒反向遺傳技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速構(gòu)建禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株的方法。

背景技術(shù)：

禽傳染性支氣管炎(avianinfectiousbronchitis,ib)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一，它是由禽傳染性支氣管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,ibv)引起的一種高度接觸性傳染病，以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)下降、腎臟病變及胃腸道病變?yōu)橹饕卣?。ibv在全球流行，并且由于不同ibv毒株在致病性和組織嗜性上差異大，血清型極其復(fù)雜，不同的血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，加上新的變異株不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致ibv的防控非常困難。

ib的病原ibv屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬中的γ屬冠狀病毒的成員。病毒粒子略呈球形，有的呈多形性，直徑約為80-120nm?；蚪M為不分節(jié)段的單股正鏈rna，與核衣殼蛋白(nucleocapsid,n)結(jié)合形成螺旋狀的核衣殼；其外包裹一層由膜蛋白(membrane,m)構(gòu)成的囊膜；小分子蛋白(envelope,e)鑲嵌于囊膜中；由s1和s2兩個(gè)亞基組成的梨狀的纖突蛋白(spike,s)在囊膜中鉚定并伸展形成突起。ibv的基因組rna全長27000nt左右，編碼結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白和一些附屬蛋白。

反向遺傳操作技術(shù)(reversegenetics)，即病毒的全長感染性cdna克隆技術(shù)，包括病毒基因組全長cdna克隆構(gòu)建技術(shù)和由cdna轉(zhuǎn)錄病毒rna的感染性轉(zhuǎn)錄本制備技術(shù)，能在病毒dna水平上對其進(jìn)行人工操作，解決了rna病毒基因組難以操作的難題?；跇?gòu)建病毒基因組全長cdna感染性克隆的反向遺傳方法成為研究冠狀病毒分子生物學(xué)的一個(gè)有效的工具。借助感染性克隆在體外對冠狀病毒的基因組進(jìn)行基因敲除、定點(diǎn)誘變等人工操作，可深入了解病毒生命活動(dòng)過程中各種基因的調(diào)控作用，以及病毒的致病機(jī)理。

但是目前仍然存在一些問題阻礙了冠狀病毒全長感染性cdna克隆的構(gòu)建，例如冠狀病毒的基因組是目前已知的rna病毒中最大的(27-32kb)，常規(guī)技術(shù)很難操作、一些復(fù)制酶基因cdna克隆在細(xì)菌中具有不穩(wěn)定性、在體外得到的轉(zhuǎn)錄本具有異質(zhì)性等。獲得基因組cdna全長片段克隆是病毒拯救技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大多數(shù)研究者均采取分段克隆的策略，為了避免病毒序列在細(xì)菌中的不穩(wěn)定問題，研究者通常擴(kuò)增小片段(2k-3k)，通過小片段連接成大片段(5k-7k)，制備大量的大片段模板，最后將大片段通過酶切連接的方法得到全長cdna克隆。

如《雞傳染性支氣管炎病毒h120疫苗株全長cdna感染性克隆的構(gòu)建術(shù)》公開了一種構(gòu)建ibv感染性克隆的方法，具體公開：利用酶切連接獲得病毒基因組全長cdna，通過t7rna聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成病毒基因組rna，轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞并進(jìn)行病毒拯救。但該方法酶切位點(diǎn)選取限制較多，而且體外將多個(gè)大片段進(jìn)行連接效率較低，獲得病毒基因組全長cdna非常困難。此外利用添加的t7啟動(dòng)子，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得的轉(zhuǎn)錄本具有異質(zhì)性，病毒拯救效率較低。整個(gè)過程不僅操作步驟麻煩，而且耗時(shí)較長，成功率不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在建立一種快速構(gòu)建禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中冠狀病毒部分復(fù)制酶基因cdna克隆在細(xì)菌中不能穩(wěn)定保存的問題，克服了傳統(tǒng)的酶切連接效率較低的問題，克服了體外轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄本異質(zhì)性的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種快速構(gòu)建禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株的方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列以及bac載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)n對含有同源臂的引物，以禽傳染性支氣管炎病毒rna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，分別擴(kuò)增出基因組序列的n個(gè)片段，命名為f1、f2、…fn-1、fn，n為偶數(shù)，n≥4，其中f2～fn-1的首尾部分序列與相鄰片段重復(fù)；利用體外同源重組技術(shù)，分別將上述擴(kuò)增片段克隆到bac載體上，獲得亞克隆載體pbac-f1、pbac-f2、...pbac-fn-1、pbac-fn；

(2)以含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的cmv序列，利用體外同源重組技術(shù)，將其融合到pbac-f1基因組序列的5’端，獲得亞克隆載體pbac-f1；

(3)克隆丁型肝炎核酶序列和牛生長激素聚腺苷酸化信號(hào)序列，融合pcr獲得hb序列；以所述hb序列為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的hb序列，利用體外同源重組技術(shù)，將hb序列融合到pbac-fn基因組序列的3’端，獲得亞克隆載體pbac-fn；

(4)將pbac-f1、pbac-f2、...pbac-fn-1、pbac-fn依次兩兩配對，每對中，取其中一個(gè)亞克隆載體作為模板，擴(kuò)增出含有同源臂的目的片段，利用體外同源重組技術(shù)，將目的片段融合到另一個(gè)亞克隆載體上，獲得相鄰兩片段融合的亞克隆載體pbac-f1f2、…pbac-fn-1fn；

(5)再按照步驟(4)的方法，將相鄰的兩個(gè)亞克隆載體進(jìn)行融合，重復(fù)若干次，獲得包含禽傳染性支氣管炎病毒基因組全長cdna的克隆載體pbac-ibv；

(6)將克隆載體pbac-ibv轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)、收集培養(yǎng)基及細(xì)胞混合物，反復(fù)凍融，獲得p0代拯救毒；

(7)將p0代拯救毒接種spf雞胚，傳代、獲得所述禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株

本發(fā)明采用分段克隆方式，將大片段的基因組序列進(jìn)行拆分，由于相鄰片段之間具有重復(fù)序列，利用同源重組，將相鄰片段進(jìn)行拼接，完成基因組全序列的克隆，該方法操作簡單，陽性克隆率高。

另外，本發(fā)明采用bac載體進(jìn)行ibv的拯救，bac載體具有大容量、低拷貝并且復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性高的優(yōu)點(diǎn)，能夠保證ibv的大片段基因組序列在細(xì)菌中穩(wěn)定保存。作為優(yōu)選，所述bac載體為pbelobac11。

本發(fā)明采用細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的轉(zhuǎn)錄本，并完成病毒包裝。因此，在基因組cdna序列5’端前添加巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，cmv)啟動(dòng)子序列。本發(fā)明在克隆載體基因組序列的3’端添加hdvr序列，發(fā)揮剪切功能，獲得精確的3’末端，大大提高了病毒的拯救效率。

由于病毒基因組5’utr和3’utr較難擴(kuò)增，因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)引物單獨(dú)對這兩個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增。作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述f1包括5’utr區(qū)段和基因編碼段f1’，所述pbac-f1分兩步構(gòu)建，包括：

(a)以禽傳染性支氣管炎病毒rna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的基因編碼段f1’，利用體外同源重組技術(shù)，將其克隆到bac載體上，獲得重組載體pbac-f1’；

(b)以禽傳染性支氣管炎病毒rna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的5’utr區(qū)段，利用體外同源重組技術(shù)，將其融合到重組載體pbac-f1’基因編碼段f1’的5’端處，獲得pbac-f1。

步驟(1)中，所述fn包括3’utr區(qū)段和基因編碼段fn’，所述pbac-fn分兩步構(gòu)建，包括：

(ⅰ)以禽傳染性支氣管炎病毒rna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的基因編碼段fn’，利用體外同源重組技術(shù)，將其克隆到bac載體上，獲得重組載體pbac-fn’；

(ⅱ)以禽傳染性支氣管炎病毒rna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，擴(kuò)增得到含有同源臂的3’utr區(qū)段，利用體外同源重組技術(shù)，將其融合到重組載體pbac-fn’基因編碼段fn’的3’端處，獲得pbac-fn。

步驟(ⅱ)中，擴(kuò)增采用的下游引物除了含有同源臂，其5’端還含有30個(gè)t的poly(t)序列。

為了方便后續(xù)病毒拯救株的篩選鑒定，本發(fā)明在基因序列上引入定點(diǎn)突變。步驟(1)中，選擇pbac-f1、pbac-f2、...pbac-fn-1、pbac-fn中任意一個(gè)亞克隆載體為模板，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，進(jìn)行點(diǎn)突變pcr，獲得具有拯救標(biāo)記的亞克隆載體。

作為優(yōu)選，步驟(6)中，所述細(xì)胞為bhk-21細(xì)胞。

作為優(yōu)選，步驟(7)中，傳代為盲傳3～5代。

具體地，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建雞傳染性支氣管炎病毒ibvh120反向遺傳株的方法，包括：

(1)將ibvh120基因組編碼區(qū)域分四段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有同源臂的片段，將四片段分別與經(jīng)限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi酶切的載體bac同源重組，初步完成四片段亞克隆載體的構(gòu)建。

對第一個(gè)亞克隆載體上bamhi酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變(a5472c)并作為拯救標(biāo)記，其引物為：上游引物：5’-tattgttggctccagtgttgttactaca-3’，下游引物為：5’-aacactggagccaacaatagctttctta-3’。

基因組5’utr和3’utr單獨(dú)擴(kuò)增，將第一個(gè)亞克隆載體和第四個(gè)亞克隆載體分別用bamhi和xhoi限制酶酶切后制備線性化載體，分別與pcr擴(kuò)增的5’utr和3’utr同源重組。

由此，獲得覆蓋基因組全長的四片段亞克隆載體，分別為pbac-f1、pbac-f2、pbac-f3、pbac-f4。

(2)擴(kuò)增含有同源臂的cmv序列，將第一個(gè)亞克隆載體pbac-f1用bamhi限制酶酶切后制備線性化載體，運(yùn)用同源重組的方法將cmv序列添加到第一個(gè)亞克隆載體基因組序列之前，獲得改造的亞克隆載體pbac-f1。

擴(kuò)增hdvr、bgh序列，將兩個(gè)基因經(jīng)融合pcr得到hb序列，設(shè)計(jì)含有同源臂的引物，擴(kuò)增含有同源臂的hb序列，將第四個(gè)亞克隆載體pbac-f4用xhoi限制酶酶切后制備線性化載體，運(yùn)用同源重組的方法將hb序列添加到第四個(gè)亞克隆載體基因組序列之后，獲得改造的亞克隆載體pbac-f4。

由此，完成四片段亞克隆載體的改造。

(3)首先擴(kuò)增含有同源臂的f2、f4片段，將第一個(gè)亞克隆載體pbac-f1和第三個(gè)亞克隆載體pbac-f3分別用xhoi限制酶酶切后制備線性化載體；然后利用同源重組策略，將f2片段融合到第一個(gè)亞克隆載體f1片段之后，將f4片段融合到第三個(gè)亞克隆載體f3片段之后；將四片段中相鄰兩片段兩兩融合，完成兩個(gè)半分子亞克隆載體的構(gòu)建，分別為pbac-f1f2、pbac-f3f4。

(4)擴(kuò)增含有同源臂的f34片段，將含有f12片段的半分子亞克隆載體pbac-f1f2用xhoi限制酶酶切后制備線性化載體；利用同源重組的策略，將f34片段融合到f12片段之后；將兩個(gè)半分子片段融合，最終獲得ibvh120基因組全長克隆重組質(zhì)粒。

(5)將步驟(4)構(gòu)建的含有h120病毒基因組全長cdna克隆重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收獲培養(yǎng)基及細(xì)胞混合物，反復(fù)凍融3次，命名為r-h120-a5472cp0代拯救毒。將p0代拯救毒無菌過濾后接種10日齡spf雞胚，3天后收獲雞胚尿囊液，盲傳3代，最終獲得雞傳染性支氣管炎病毒h120反向遺傳疫苗株r-h120-a5472c。

本發(fā)明采用的雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株h120可以為商品化疫苗株。

本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的雞傳染性支氣管炎病毒h120反向遺傳疫苗株r-h120-a5472c。本發(fā)明研究證明，該疫苗株具有良好的雞胚傳代穩(wěn)定性；接種spf雞胚表現(xiàn)出感染ibv的典型癥狀，發(fā)育遲緩、矮小、蜷縮。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明以bac載體為骨架，運(yùn)用體外同源重組技術(shù)，快速完成包含禽傳染性支氣管炎病毒基因組全長cdna克隆的構(gòu)建，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的轉(zhuǎn)錄本，并完成病毒包裝，將細(xì)胞與培養(yǎng)基的混合液接種spf雞胚并傳代，獲得禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳疫苗株。該構(gòu)建方法操作簡單，陽性克隆率高，而且獲得的反向遺傳疫苗株具有傳代穩(wěn)定性，為體外研究病毒的致病機(jī)理、開發(fā)新型疫苗等提供了有效的工具。

(2)本發(fā)明將含有病毒基因組全長cdna的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用5’添加的cmv啟動(dòng)子，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，利用3’添加的hdvr序列，發(fā)揮剪切功能，獲得精確的3’末端，大大提高了病毒的拯救效率。

(3)本發(fā)明的構(gòu)建方法同樣適用于其他種屬冠狀病毒的拯救，為冠狀病毒的研究提供了一個(gè)切實(shí)有效的工具，對于加快冠狀病毒的致病機(jī)理以及疫苗的開發(fā)具有重要的意義。

附圖說明

圖1為基于bac載體的ibvh120cdna全長質(zhì)粒構(gòu)建策略。分析ibvh120基因組全長序列，計(jì)劃采用分段克隆的方式，將全基因組分為四個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增并最終獲得病毒基因組全長cdna，并在基因組cdna序列5’utr前添加cmv啟動(dòng)子序列；3’utr序列末端添加含有30個(gè)a的poly(a)結(jié)構(gòu)；poly(a)結(jié)構(gòu)后添加hdvr序列和bgh序列即為hb序列；將病毒基因組上的bamhi酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變(5472位的a突變?yōu)閏)并作為拯救標(biāo)記。基因組全長cdna序列插入到pbelobac11質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中的bamhi和xhoi位點(diǎn)之間。

圖2為ibvh120基因組cdna分四片段pcr擴(kuò)增結(jié)果。

圖3為基于bac載體的ibvh120cdna全長質(zhì)粒構(gòu)建步驟。首先將病毒基因組cdna四片段定向克隆到復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高的低拷貝載體pbelobac11上，初步完成四片段亞克隆載體的構(gòu)建。然后對第一個(gè)亞克隆載體上bamhi酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變(a5472c)并作為拯救標(biāo)記；將病毒基因組5’utr、3’utr單獨(dú)擴(kuò)增后分別融合到第一個(gè)和第四個(gè)亞克隆載體上，完成覆蓋全長的四片段亞克隆載體的構(gòu)建。然后擴(kuò)增含有同源臂的cmv序列并融合到第一個(gè)亞克隆載體基因組序列之前；擴(kuò)增含有同源臂的hb序列并融合到第四個(gè)亞克隆載體基因組序列之后，完成四片段亞克隆載體改造。在獲得覆蓋全長四片段亞克隆載體的基礎(chǔ)上，將四片段中相鄰兩片段兩兩融合，完成兩個(gè)半分子亞克隆載體的構(gòu)建。最后利用同源重組的策略，將兩個(gè)半分子片段融合，完成包含病毒基因組全長cdna克隆載體的構(gòu)建。

圖4為包含ibvh120基因組全長cdna重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果，其中m：λ-hindⅲdigestdnamarker；1，2：pbac-ibv-h120fl，pbelobac11質(zhì)粒分別用bamhi和xhoi雙酶切。

圖5為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞。

圖6為拯救病毒感染雞胚的病變。

圖7為ibvh120拯救毒拯救標(biāo)記鑒定結(jié)果，其中a為rt-pcr擴(kuò)增拯救后傳代毒拯救標(biāo)記片段的凝膠電泳圖，b為測序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明所用雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株h120由本實(shí)驗(yàn)室毒種庫保存；使用的傳代細(xì)胞bhk-21由本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫保存。

克隆載體pbelobac11和大腸桿菌dh10b株均為浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院黃耀偉教授惠贈(zèng)。

rna抽提試劑、pcr高保真酶、同源重組試劑盒、定點(diǎn)突變試劑盒購自vazyme公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自thermo公司，限制性內(nèi)切酶bamhi、xhoi購自takara公司，轉(zhuǎn)染試劑jetprime購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列測定由鉑尚生物技術(shù)有限公完成。

一、ibvh120基因組全長cdna構(gòu)建策略：

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存并測定的ibv疫苗株h120基因組全序列，利用primerpremier5.0進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，計(jì)劃將全基因組分為四個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增并最終獲得基因組全長cdna，在基因組cdna序列5’utr前添加巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，cmv)啟動(dòng)子序列；3’utr序列末端添加含有30個(gè)a的poly(a)結(jié)構(gòu)；poly(a)結(jié)構(gòu)后添加丁型肝炎核酶(hepatitisdeltavirusribozyme,hdvr)序列和牛生長激素聚腺苷酸化信號(hào)序列(bovinegrowthhormonepolyadenylationsignal,bgh)，兩個(gè)序列合并，簡稱為hb序列；將病毒基因組bamhi酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變(5472位的a突變?yōu)閏)并作為拯救標(biāo)記。整個(gè)全基因組序列插入到pbelobac11質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中的bamhi和xhoi酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建策略見圖1。

ibvh120基因組全長cdna構(gòu)建包括以下四步驟：

1、ibvh120cdna四片段亞克隆載體的構(gòu)建與鑒定：

根據(jù)病毒基因組序列中所含有的特異酶切位點(diǎn)分析結(jié)果，將病毒全基因組分為四個(gè)片段，設(shè)計(jì)含有同源臂的引物，以病毒基因組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板，按照確立的pcr反應(yīng)條件用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增長片段f1、f2、f3和f4，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示與預(yù)期大小一致見圖2。

利用pcr擴(kuò)增序列與線性化載體上的同源臂，用同源重組法將各片段克隆到復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高的低拷貝載體pbelobac11上，完成四片段亞克隆載體pbelobac11-f1、pbelobac11-f2、pbelobac11-f3和pbelobac11-f4的構(gòu)建。對第一個(gè)亞克隆載體pbelobac11-f1上bamhi酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變(5472位的a突變?yōu)閏)并作為拯救標(biāo)記。

對于較難擴(kuò)增的5’utr、3’utr片段，設(shè)計(jì)含有同源臂的引物單獨(dú)擴(kuò)增，同時(shí)將pbelobac11-f1和pbelobac11-f4載體分別用bamhi和xhoi限制酶酶切用來制備線性化載體，運(yùn)用同源重組的方法將5’utr融合到pbelobac11-f1載體上，將3’utr融合到pbelobac11-f4載體上，完成亞克隆載體pbelobac11-f1和pbelobac11-f4的構(gòu)建。

構(gòu)建策略見圖3，引物設(shè)計(jì)如表1。測序結(jié)果表明成功獲得了覆蓋h120基因組全長cdna的四片段亞克隆載體。

表1f1、f2、f3和f4片段擴(kuò)增和bamhi酶切位點(diǎn)突變以及5’utr和3’utr擴(kuò)增引物

注：“agctcggtacccggggatcc”等其他引物中的類似序列為同源臂序列。

2、ibvh120cdna四片段亞克隆載體的改造與鑒定：

從pcdna3.0上擴(kuò)增含有同源臂的cmv啟動(dòng)子序列，運(yùn)用同源重組的方法添加到第一個(gè)亞克隆載體基因組序列之前，構(gòu)建載體pbelobac11-f1(cmv)。

含有84個(gè)核苷酸的hdvr序列通過設(shè)計(jì)兩條含有重疊序列的引物退火結(jié)合，并以此為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。從pcdna3.0上擴(kuò)增含有同源臂的bgh序列，將hdvr和bgh兩個(gè)基因經(jīng)融合pcr得到hb序列。擴(kuò)增含有同源臂的hb序列，運(yùn)用同源重組的方法將其添加到第四個(gè)亞克隆載體基因組序列之后，構(gòu)建載體pbelobac11-f4(hb)。

載體改造策略見圖3，引物設(shè)計(jì)如表2。測序結(jié)果表明成功對四片段亞克隆載體進(jìn)行了改造。

表2cmv、bgh、hdvr序列pcr擴(kuò)增

3、ibvh120cdna半分子亞克隆載體的構(gòu)建：

半分子亞克隆載體構(gòu)建在獲得覆蓋全長四片段亞克隆載體并完成必要元件的添加與改造的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增f2片段，與pbelobac11-f1(cmv)用xhoi酶切后得到的線性化載體同源重組反應(yīng)；擴(kuò)增f4(hb)片段，與pbelobac11-f3用xhoi酶切后得到的線性化載體同源重組反應(yīng)，將四片段中相鄰兩片段兩兩融合，完成兩個(gè)半分子亞克隆載體pbelobac11-f12(cmv)、pbelobac11-f34(hb)的構(gòu)建，構(gòu)建策略見圖3，引物設(shè)計(jì)如表3。測序結(jié)果表明成功完成了包含h120基因組全長cdna的兩個(gè)半分子亞克隆載體的構(gòu)建。

表3f2和f4(hb)片段pcr擴(kuò)增引物

4、ibvh120基因組全長cdna克隆載體的構(gòu)建：

全長克隆載體構(gòu)建在獲得兩個(gè)半分子亞克隆載體的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增f34(hb)片段，與pbelobac11-f12(cmv)用xhoi酶切后得到的線性化載體同源重組反應(yīng)，利用同源重組的策略，將兩個(gè)半分子片段融合，最終獲得冠狀病毒基因組cdna全長克隆載體，構(gòu)建策略見圖3，引物設(shè)計(jì)如表4。重組全長質(zhì)粒命名為pbac-ibv-h120fl，對重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi雙酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶數(shù)量與各條帶大小與預(yù)期一致，見圖4。測序結(jié)果表明成功完成了包含h120基因組全長cdna克隆載體的構(gòu)建。

表4f34(hb)片段擴(kuò)增引物

二、h120基因組cdna全長的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞與接種雞胚：

將重組質(zhì)粒pbac-ibv-h120fl直接轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照組相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)輕微圓縮和老化現(xiàn)象，見圖5。收獲培養(yǎng)基及細(xì)胞混合物，反復(fù)凍融3次，取上清并命名為r-h120-a5472cp0代拯救毒。

將p0代拯救毒無菌過濾后接種10日齡spf雞胚，3天后收獲雞胚尿囊液，盲傳3代，在雞胚傳代過程中發(fā)現(xiàn)每代中均有雞胚死亡現(xiàn)象。在接種了h120拯救株的第三代spf雞胚表現(xiàn)出ibv感染的典型侏儒胚病變，即胚體發(fā)育遲緩、矮小、蜷縮，見圖6。

三、拯救病毒拯救標(biāo)記的鑒定：

為了排除野生型毒株污染的問題，我們將p0代拯救毒和接種雞胚盲傳三代收獲的雞胚尿囊液(f1-f3)抽提rna，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到病毒cdna。根據(jù)ibvh120的序列，在引入的拯救標(biāo)記前后設(shè)計(jì)引物，上游引物為：aaaagcgccagtctactaccc，下游引物為：ggaccacataaagaaccctca，擴(kuò)增病毒基因組5211～5831bp之間的大小為621bp的片段，均獲得與目的基因大小一致的條帶，但是p0代條帶較弱，見圖7。將擴(kuò)增的片段構(gòu)建到pmd-18t載體上并進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增的產(chǎn)物均含有引入的沉默突變(a突變?yōu)閏)，見圖7，表明我們獲得了正確的反向遺傳株r-h120-a5472c，而非野生型毒株污染。

四、拯救病毒生物學(xué)特性鑒定：

將拯救毒在雞胚中盲傳5代后，測感染雞胚尿囊液中的eid50，同時(shí)與在雞胚中盲傳相同代次野生毒比較。發(fā)現(xiàn)拯救毒的eid50與野生毒的eid50非常接近。用real-timepcr檢測也發(fā)現(xiàn)拯救毒與野生毒m基因的拷貝數(shù)相似。表明拯救毒與野生毒具有類似的生長特性。

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)

<120>一種快速構(gòu)建禽傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株的方法

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