用于植物基因表達(dá)的終止子序列的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年07月23日的中國專利申請(qǐng)201280048439.0“用于植物基因表達(dá)的終止子序列”的分案申請(qǐng)。
相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
本專利申請(qǐng)要求提交于2011年8月2日的美國臨時(shí)申請(qǐng)no.61/514,055的權(quán)益，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。更具體地，其涉及用于調(diào)控植物基因表達(dá)的新型植物終止子序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物基因工程近來的進(jìn)步已打開了工程化植物以具有改善的特性或性狀的新的大門。這些轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中典型地具有重組dna構(gòu)建體，其具有可操作地連接至多個(gè)調(diào)控區(qū)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，所述調(diào)控區(qū)使轉(zhuǎn)基因準(zhǔn)確的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物中一些幫助調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件的例子為啟動(dòng)子、內(nèi)含子、終止子、增強(qiáng)子和沉默子。
植物基因工程已發(fā)展至將多種性狀引入商業(yè)上重要的植物中，也叫基因堆積。這是通過多基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的，其中多種基因被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生可表達(dá)復(fù)合表型或多種表型的轉(zhuǎn)基因植物。然而最優(yōu)化地調(diào)節(jié)或控制每種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是重要的。調(diào)控元件需要多種多樣的，以避免導(dǎo)入相同的轉(zhuǎn)基因植物重復(fù)序列，相同的轉(zhuǎn)基因植物重復(fù)序列與對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性的不可取的負(fù)面影響是相關(guān)聯(lián)的(peremarti等人(2010)plantmolbiol73：363-378；mette等人(1999)emboj18：241-248；mette等人(2000)emboj19：5194-5201；mourrain等人(2007)planta225：365-379、美國專利no.7632982、美國專利no.7491813、美國專利no.7674950、pct專利申請(qǐng)no.pct/us2009/046968)。因此，發(fā)現(xiàn)和表征能被用于在重要的農(nóng)作物物種中表達(dá)異源性核酸的新型調(diào)控元件是重要的。各種不同的調(diào)控區(qū)能夠被用于最優(yōu)化地控制每種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
調(diào)控序列位于編碼區(qū)的下游，所述編碼區(qū)包含用于轉(zhuǎn)錄終止和3′mrna加工的所需信號(hào)，并被稱為終止子序列。所述終止子序列在mrna加工、定位、穩(wěn)定性和翻譯中起關(guān)鍵作用(proudfoot，n，(2004)curr.op.cellbiol16：272-278；gilmartin，2005)。包含在終止子序列中的所述3′調(diào)控序列能夠影響基因的表達(dá)水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞中嵌合基因的優(yōu)化表達(dá)依賴于合適的3′序列的存在(ingelbrecht，i.l.w.等人(1989)plantcell1：671-680)。通過基因的滲漏終止子的通讀轉(zhuǎn)錄可導(dǎo)致從另一個(gè)基因的啟動(dòng)子的一個(gè)轉(zhuǎn)基因的無益轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的雙向、趨同轉(zhuǎn)錄也可由于分離的趨同基因的滲漏轉(zhuǎn)錄終止或來自基因組啟動(dòng)子而發(fā)生。趨同、重疊轉(zhuǎn)錄可降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)、或生成反義rna(bieri，s.等人(2002)molecularbreeding10：107-117)。這強(qiáng)調(diào)了發(fā)現(xiàn)新型和高效轉(zhuǎn)錄終止子的重要性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及用于調(diào)控植物基因表達(dá)的調(diào)控序列。具體地，本發(fā)明涉及終止子序列。本發(fā)明提供了包含終止子序列的重組dna構(gòu)建體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含：(a)如seqidno：1或seqidno：18所示的序列；(b)與seqidno：1或seqidno：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是包含分離的多核苷酸序列的重組構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸序列包含：(a)如seqidno：1或seqidno：18所示的序列；(b)與seqidno：1或seqidno：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。這個(gè)重組構(gòu)建體還可包含啟動(dòng)子和異源多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子和異源多核苷酸可操作地連接至分離的多核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將上文所述的重組dna構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞；(b)由(a)的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)由步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物和子代植物包含所述重組dna構(gòu)建體并且表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組dna構(gòu)建體的載體、病毒、細(xì)胞、微生物、植物、或種子，所述重組dna構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的終止子序列。
本發(fā)明涵蓋了包含上文所述的重組dna構(gòu)建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物、由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、t1和后續(xù)的世代。所述轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、組織、植株和種子可以包含至少一種所關(guān)注的重組dna構(gòu)建體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明所述終止子序列的植物或種子是單子葉植物或種子。在另一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明所述終止子序列的植物或種子是玉米植物或種子。
在另一個(gè)實(shí)施例中，任何表達(dá)異源多核苷酸的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞，例如，玉米植物細(xì)胞。
附圖說明和序列表
根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三個(gè)字母表示氨基酸，如nucleicacidsresearch13：3021-3030(1985)和biochemicaljournal219(no.2)：345-373(1984)所描述的iupac-iubmb標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循37c.f.r.§1.822所示的規(guī)定。
圖1顯示了php31801的圖譜、用于在擴(kuò)增后克隆sb-gkaf終止子的載體。
圖2顯示了php34074的圖譜、用于測試sb-gkaf終止子的載體。
圖3顯示了在瞬時(shí)測定中sb-gkaf終止子相對(duì)于pinii終止子的測試結(jié)果。其顯示了用php34074(sb-gkaf終止子)和php34005(pinii終止子)轉(zhuǎn)化的bms細(xì)胞中g(shù)us報(bào)告基因表達(dá)的定量分析。
圖4a和圖4b顯示了用sb-gkaf(php34074)和pinii(php34005)終止子構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的gaspeflint來源的玉米品系中g(shù)us報(bào)告基因表達(dá)的定量分析。圖4a顯示了在蛋白水平測定的gus報(bào)告基因表達(dá)，圖4b顯示了用qrt-pcr(定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))測定的gus報(bào)告基因表達(dá)。
圖5顯示了采用sb-gkaf終止子和pinii終止子下游的兩套引物，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的gaspeflint來源的玉米品系的qrt-pcr測定結(jié)果。
圖6a-6c顯示了克隆的sb-gkaf終止子(seqidno：1)和ncbigino：671655(seqidno：18)的1863至2322位核苷酸的比對(duì)。共有序列顯示于頂部，與共有序列完全匹配的殘基加框。
seqidno：1是459bpsb-gkaf終止子的序列。
seqidno：2和3是用于擴(kuò)增sb-gkaf終止子的正向和反向引物的序列。
seqidno：4是php31801的核苷酸序列，在pcr擴(kuò)增后用于克隆sb-gkaf終止子的載體。
seqidno：5是php34074的核苷酸序列，用于測試sb-gkaf終止子的載體。
seqidno：6是php34005的核苷酸序列，作為pinii終止子對(duì)照的測試載體。
如表2所述，seqidnos：7-9是在轉(zhuǎn)基因玉米植物中用于通過qrt-pcr測定gus表達(dá)的正向引物、反向引物和探針的序列。
如表3所述，seqidnos：10-17是在轉(zhuǎn)基因玉米植物中用于以qrt-pcr定量通讀轉(zhuǎn)錄通過sb-gkaf和pinii終止子的引物序列。
seqidno：18對(duì)應(yīng)于ncbigino：671655的1863至2322位核苷酸。
具體實(shí)施方式
本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵義包括多株此類植物，“細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的它們的等同物等等。
如本文所用：
術(shù)語“單子葉植物”和“單子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括禾本科植物。
術(shù)語“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括以下科：十字花科(brassicaceae)植物、豆科(leguminosae)植物、和茄科(solanaceae)植物。
術(shù)語“全長互補(bǔ)序列”和“全長的互補(bǔ)序列”本文互換使用，是指給定核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100％互補(bǔ)的。
“轉(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(諸如重組dna構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植株部分或植株，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。
“基因組”在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體dna，而且還包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(例如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器dna。
“植物”包括整個(gè)植株、植物器官、植物組織、植物繁殖體、種子和植物細(xì)胞以及相同的子代。植物細(xì)胞無限制地包括來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細(xì)胞。
“繁殖體”包括能夠繁殖新的植株的減數(shù)分裂和有絲分裂的全部產(chǎn)物，包括但不限于種子、孢子以及作為營養(yǎng)生殖的途徑的植物的部分，諸如球莖、塊莖、側(cè)枝、或纖匐枝。繁殖體還包括接枝，在其中植株的一部分被枝接至不同的植株(甚至是不同的物種的植株)的另外的部分以產(chǎn)生活的生物體。繁殖體還包括通過克隆或集合減數(shù)分裂產(chǎn)物、或允許減數(shù)分裂產(chǎn)物(天然地或在人工干預(yù)下)集合在一起以形成胚芽或受精卵，而產(chǎn)生的全部植株和種子。
“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。
“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如，異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作為重組dna構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。
基因改良種質(zhì)的商業(yè)開發(fā)也已經(jīng)進(jìn)展至向農(nóng)作物導(dǎo)入多個(gè)性狀的階段，其通常稱為基因堆疊法(genestackingapproach)。在該方法中，可將賦予不同所關(guān)注特性的多種基因?qū)胫参??；蚨询B可通過許多方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化以及具有不同轉(zhuǎn)基因的品系的雜交。
“轉(zhuǎn)基因植物”還包括對(duì)在其基因組中包含超過一種異源多核苷酸的植物。各異源多核苷酸均可賦予所述轉(zhuǎn)基因植物不同的性狀。
相對(duì)序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且指作為單鏈或雙鏈的rna或dna聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)可以用它們的單字母名稱指代如下：“a”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對(duì)應(yīng)rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“g”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脫氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥化和adp-核糖基化。
“信使rna(mrna)”指無內(nèi)含子并且可由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的rna。
“cdna”指與mrna模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mrna模板合成的dna。cdna可以是單鏈的或者可以用dna聚合成酶i的klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。
“編碼區(qū)”是指編碼蛋白質(zhì)或多肽的信使rna的部分(或另外的核酸分子如dna分子的對(duì)應(yīng)的部分)?！胺蔷幋a區(qū)”是指信使rna或其他核酸分子的不是編碼區(qū)的全部部分，包括但不限于例如，啟動(dòng)子區(qū)域、5′非翻譯區(qū)(“utr”)、3′utr、內(nèi)含子和終止子。術(shù)語“編碼區(qū)”和“編碼序列”本文中可互換使用。術(shù)語“非編碼區(qū)”和“非編碼序列”本文中可互換使用。
“表達(dá)序列標(biāo)簽”(“est”)是得自cdna文庫的dna序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。est通常由通過cdna插入序列的單個(gè)序列獲得。將完整的cdna插入序列稱為“全長插入序列”(“fis”)。“重疊群”序列是由選自但不限于由est、fis和pcr序列組成的基團(tuán)的兩種或更多種序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“cgs”)，該序列能得自fis或重疊群。
“成熟”蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前體”蛋白質(zhì)指mrna的翻譯初級(jí)產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。
“分離的”指物質(zhì)，例如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分去除。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
“重組體”是指例如通過化學(xué)合成或者通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合。
“重組體”也指已經(jīng)通過引入異源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對(duì)細(xì)胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些。
“重組dna構(gòu)建體”指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重組dna構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語“重組dna構(gòu)建體”和“重組構(gòu)建體”本文可互換使用。
術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用。
“調(diào)控序列”或“調(diào)控元件”可互換使用，并且指位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、中間或下游(3′非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識(shí)別序列。術(shù)語“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換使用。
“啟動(dòng)子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
“在植物中有功能的啟動(dòng)子”指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無論其是否來源于植物細(xì)胞。
“組織特異性啟動(dòng)子”和“組織優(yōu)選啟動(dòng)子”可以互換使用，并且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達(dá)，但是也可以在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
“發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動(dòng)子。
在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。
可誘導(dǎo)啟動(dòng)子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如通過化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操作地連接的dna序列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動(dòng)子的例子包括但不限于受光、熱、壓力、水澇或干旱、病原體、植物激素、創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動(dòng)子。
“增強(qiáng)子序列”是指能夠增加基因表達(dá)的序列。這些序列能夠位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游、內(nèi)含子內(nèi)、或下游。轉(zhuǎn)錄區(qū)域由外顯子和居間的內(nèi)含子組成，從啟動(dòng)子直至轉(zhuǎn)錄終止區(qū)?；虮磉_(dá)的增強(qiáng)能夠通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，包括但不限于提高轉(zhuǎn)錄效率、成熟mrna的穩(wěn)定化和翻譯的強(qiáng)化。
“內(nèi)含子”是基因的居間序列，其被轉(zhuǎn)錄至rna，然后在產(chǎn)生成熟mrna的過程中被切除。該術(shù)語也用于切除的rna序列?！巴怙@子”是被轉(zhuǎn)錄的基因序列的一部分，存在于得自該基因的成熟信使rna中，并且不是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的必需部分。
術(shù)語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動(dòng)子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接。
“表達(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成mrna或功能rna的轉(zhuǎn)錄)和/或mrna翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。
“過表達(dá)”是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中超過在來自相同實(shí)驗(yàn)的沉默分離(或非轉(zhuǎn)基因)生物中的水平的生產(chǎn)。
“表型”是指細(xì)胞或生物體的可檢測的特征。
術(shù)語“雜交的”或“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合(例如細(xì)胞、種子或植物)。該術(shù)語包括有性雜交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如當(dāng)花粉和胚珠來自相同植物時(shí))。術(shù)語“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
“有利等位基因”為位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的細(xì)胞壁消化性，或作為另外一種選擇，為允許具有降低的細(xì)胞壁消化性的植物的鑒定的等位基因，其中所述植物可從育種計(jì)劃或種植中被篩除(“反選擇”)。標(biāo)記的有利等位基因是與有利表型分離的標(biāo)記等位基因，或者作為另外一種選擇，與不利植物表型分離，從而提供鑒定植物的有益效果。
術(shù)語“導(dǎo)入”指將核酸(例如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中的手段。導(dǎo)入包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時(shí)提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組dna構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體dna)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mrna)。
“抑制dna構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時(shí)，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組dna構(gòu)建體。對(duì)該植物來說，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對(duì)靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mrna或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語“抑制”、“抑制性”以及“沉默”，包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不確定機(jī)理并且包括而且不限于反義、共抑制、病毒抑制、發(fā)夾抑制、莖環(huán)抑制、基于rnai的方法以及基于小rna的方法。
本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組dna和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文稱為“sambrook”)。
“轉(zhuǎn)錄終止子”、“終止序列”或“終止子”是指位于編碼序列下游的dna序列，包括編碼能夠影響mrna加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的聚腺苷酸化識(shí)別序列和其他序列。聚腺苷酸化信號(hào)通常其特征在于影響聚腺苷酸區(qū)域添加到mrna前體的3′末端。不同的3′非編碼序列的使用示例于ingelbrecht，i.l.等人，plantcell1：671-680(1989)中。具有“終止子活性”的多核苷酸序列指當(dāng)被可操作地連接至待表達(dá)的第二多核苷酸序列的3′端時(shí)，能夠終止從所述第二多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄的終止是通過rna聚合酶的rna合成被停止并且rna和所述酶均從dna模板上釋放的過程。
rna轉(zhuǎn)錄物的錯(cuò)誤終止能夠影響rna的穩(wěn)定性，并從而能夠影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可變性有時(shí)歸因于終止效率的可變性(bieri等人(2002)molecularbreeding10：107-117)。
本文可互換使用術(shù)語“sb-gkaf終止子”、“gkaf終止子”和“γ-高粱醇溶蛋白終止子”，每個(gè)是指編碼高粱(sorghumbicolor)γ-高粱醇溶蛋白基因的3′非翻譯區(qū)(3′utr)的序列和從所述3′utr下游約300bp的序列。在seqidno：1中給出了sb-gkaf終止子的序列。高粱(sorghumbicolor)γ-高粱醇溶蛋白基因編碼γ-谷醇溶蛋白，在ncbigino：671655中給出了該基因的序列。谷醇溶蛋白是許多谷類的主要儲(chǔ)存蛋白。高粱γ-高粱醇溶蛋白，其為高粱的γ-谷醇溶蛋白，占高粱胚乳中總谷醇溶蛋白的約2-5％，是由27kda的單條多肽組成的(defreitasfa等人(1994)molgengenetics245(2)：177-86)。
本發(fā)明包括本文所公開的終止子序列的功能性片段和變體。
終止子的“功能性片段”被定義為本文所公開的終止子序列的連續(xù)核苷酸的任何子集，其能夠?qū)嵤┡c本文所公開的全長終止子序列相同或基本上相似的功能。與本文所公開的全長終止子具有基本上相似功能的“功能性片段”，是指在很大程度上保持在全長終止子序列相同水平的終止轉(zhuǎn)錄能力的功能性片段。包含可操作地連接至本文所公開的終止子序列的“功能性片段”的異源性多核苷酸的重組構(gòu)建體，表現(xiàn)出與包含可操作地連接至全長終止子序列的異源性多核苷酸的對(duì)應(yīng)重組構(gòu)建體基本上相似的異源性多核苷酸表達(dá)水平。
如本文所用，“變體”是包含改變的終止子的序列或終止子的功能性片段的序列，其中原始序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被刪除、添加、和/或替換，同時(shí)基本上維持了終止子的功能。一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)能夠在終止子內(nèi)部被插入、刪除、或替換，而不會(huì)影響其活性。片段和變體能夠通過例如定點(diǎn)誘變和合成構(gòu)建的方法獲得。
這些終止子功能性片段可包含本文所公開的特定終止子核苷酸序列的至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或450個(gè)連續(xù)的核苷酸。此類片段可以通過使用限制性酶來裂解天然存在的本文所公開的終止子核苷酸序列；通過合成來自天然存在的終止子dna序列的核苷酸序列獲得；或可通過使用pcr技術(shù)而獲得。具體參見mullis等人，methodsenzymol.155：335-350(1987)和higuchi，r.inpcrtechnology：principles和applicationsfordnaamplifications；erlich，h.a.編輯；stocktonpressinc.：newyork，1989)。同樣，這些終止子片段的變體，例如產(chǎn)生自定點(diǎn)誘變的那些，包括在本發(fā)明的組合物之中。
如本文所用，術(shù)語“基本上類似于”和“基本上相當(dāng)?shù)摹笔侵负怂崞?，尤其是終止子序列，其中在一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基中的改變基本上不改變終止子終止轉(zhuǎn)錄的能力。這些術(shù)語還指本發(fā)明的核酸序列的修改形式，包括缺失和變異，所述修改形式是通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失或插入，其基本上不改變所產(chǎn)生的終止子相對(duì)于初始的未修改的終止子的功能特性。因此，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，本發(fā)明涵蓋的不僅僅是具體的示例性序列。
如對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的，任何受關(guān)注的異源性多核苷酸均能夠被可操作地連接至本發(fā)明所描述的終止子序列。能夠被可操作地連接至本發(fā)明所描述的終止子序列的受關(guān)注的多核苷酸的例子包括但不限于，包含調(diào)控元件諸如內(nèi)含子、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列，蛋白質(zhì)編碼區(qū)如疾病和抗昆蟲性基因、賦予營養(yǎng)價(jià)值的基因、賦予產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢的提高的基因、賦予雄性和/或雌性不育性的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因等等的多核苷酸。同樣地，本發(fā)明所描述的終止子序列能夠被用于終止任何控制基因表達(dá)的核酸的轉(zhuǎn)錄。能夠被用于控制基因表達(dá)的核酸的例子包括但不限于反義寡核苷酸、抑制性dna構(gòu)建體或編碼轉(zhuǎn)錄因子的核酸。
本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體(包括抑制dna構(gòu)建體)可包含至少一種調(diào)控序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本文所公開的調(diào)控序列可操作地連接至任何其它調(diào)控序列。
多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體中。可根據(jù)所需結(jié)果來選擇啟動(dòng)子，并且可包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子。
本文可互換使用術(shù)語“實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-timepcr)”、“定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativepcr)”、“定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativereal-timepcr)”和“qpcr”，代表用于定量樣品中的dna或rna的標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù)的變型。使用序列特異性引物和探針，測定特定dna或rna序列的相對(duì)數(shù)量或拷貝數(shù)。使用術(shù)語相對(duì)是因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)比較了不同基因相對(duì)于特定內(nèi)參基因的相對(duì)拷貝數(shù)。通過測量在pcr過程中的每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，量化升高。使用熒光水解探針，測量對(duì)于每個(gè)后續(xù)pcr循環(huán)增加的熒光以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量化。ct(循環(huán)閾值)被定義為對(duì)于熒光信號(hào)超過閾值(即超過背景水平)所需的循環(huán)數(shù)。來自具有更高拷貝數(shù)基因的dna/rna會(huì)在更少的pcr循環(huán)后出現(xiàn)；因此ct值越低，在特定樣品中存在的拷貝越多。為了定量rna，在qpcr或?qū)崟r(shí)pcr之前為反轉(zhuǎn)錄mrna至cdna的步驟。本文這被稱為“實(shí)時(shí)rt-pcr”或“定量rt-pcr”或“定量rt-pcr”或“qrt-pcr”。
pcr產(chǎn)物定量的taqman方法使用熒光報(bào)告基因探針。由于設(shè)計(jì)的探針是序列特異性的，并僅結(jié)合至特異性pcr產(chǎn)物上，因此這是更精確的。即使存在非特異性dna擴(kuò)增，探針特異性使定量成為可能。這使多重(定量)成為可能，其通過使用具有不同發(fā)射光譜的探針在同一試管中定量多個(gè)基因。通過taq聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性降解探針，除去淬滅劑，使得pcr產(chǎn)物被檢測到。
當(dāng)繪制在一個(gè)線性標(biāo)度時(shí)，所述熒光射線隨著pcr循環(huán)數(shù)增加而增加呈s型，具有指數(shù)期和平臺(tái)期。平臺(tái)期是由主混合物中的引物量而非核苷酸模板量確定的。通常垂直標(biāo)度是以對(duì)數(shù)形式繪制的，使得曲線圖與閾值的交集呈線性，更易于可視化。理論上，在指數(shù)期每個(gè)循環(huán)dna的量加倍，但這受到所用引物效率的影響。正對(duì)照使用內(nèi)參基因，例如，在所有細(xì)胞類型中相對(duì)豐富的“持家基因”，它的使用也使得樣品間的比較成為可能。通過將結(jié)果與通過已知濃度的dna/rna連續(xù)稀釋制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測定dna/rna的量。
本發(fā)明包括多核苷酸，所述多核苷酸包含：(i)基于clustalv(或clustalw)比對(duì)方法，在與seqidno：1或seqidno：18進(jìn)行比較時(shí)，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)基于clustalv(或clustalw)比對(duì)方法，在與seqidno：1或seqidno：18的功能性片段進(jìn)行比較時(shí)，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(iii)(i)或(ii)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中所述多核苷酸在植物細(xì)胞中作為終止子。
序列比對(duì)和同一性百分比計(jì)算可用設(shè)計(jì)用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于
作為另外一種選擇，可以使用clustalw比對(duì)方法。clustalw比對(duì)方法(描述于higgins和sharp，cabios.5：151-153(1989)；higgins，d.g.等人，comput.appl.biosci.8：189-191(1992))可見于
本發(fā)明的實(shí)施例包括：
本發(fā)明涉及終止子序列。本發(fā)明提供了包含終止子序列的重組dna構(gòu)建體。
本發(fā)明一個(gè)的實(shí)施例是分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列包含(a)如seqidno：1或seqidno：18所示的序列；(b)與seqidno：1或seqidno：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。在另一方面，本發(fā)明涉及重組dna構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子、至少一個(gè)異源核酸片段和本發(fā)明的任何終止子、或終止子元件的組合，其中所述啟動(dòng)子、至少一個(gè)異源核酸片段和終止子被可操作地連接起來。
在另一個(gè)實(shí)施例中，功能性片段可包含seqidno：1或seqidno：18的至少450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175或150個(gè)連續(xù)核苷酸。
通過將本發(fā)明的核酸片段，如seqidno：1或18中所示的終止子序列或如seqidno：1或18中所示的核苷酸序列的功能性片段，可操作地連接至異源核酸片段，可構(gòu)建重組dna構(gòu)建體。
另一個(gè)實(shí)施例是轉(zhuǎn)化細(xì)胞(或微生物)的方法，所述方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞(或微生物)。(本發(fā)明)也包括用這個(gè)方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(或微生物)。在特定實(shí)施例中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。所述微生物可為農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)，例如根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(agrobacteriumrhizogenes)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟：將上文所述的重組dna構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組dna構(gòu)建體并表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟：將上文所述的重組dna構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞；從上文所述的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及從轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物和子代植物包含所述重組dna構(gòu)建體并且表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，任何表達(dá)異源多核苷酸的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉的或雙子葉植物，例如，玉米或大豆植物細(xì)胞。植物細(xì)胞還可來自向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗或柳枝稷。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組dna構(gòu)建體的載體、病毒、細(xì)胞、微生物、植物、或種子，所述重組dna構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的終止子序列。
本發(fā)明包括包含上文所描述的重組dna構(gòu)建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物、從其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、t1和后續(xù)的世代。所述轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、組織、植株和種子可以包含所關(guān)注的至少一種重組dna構(gòu)建體。
在一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明所述的終止子序列的所述植物(或來源于所述植物的種子)是單子葉或雙子葉植物，例如，玉米或大豆植物。所述植物還可以是向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗或柳枝稷。所述植物可為近交植物或雜交植物。
實(shí)施例
本發(fā)明將在下面的實(shí)例中進(jìn)一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)例說明了本發(fā)明的實(shí)施例，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實(shí)例1
擴(kuò)增和克隆高粱(sorghumbicolor)γ-高粱醇溶蛋白終止子序列
根據(jù)高粱(sorghumbicolor)基因組序列數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物(seqidnos：2和3)用于擴(kuò)增來自高粱(sorghumbicolor)的γ-高粱醇溶蛋白基因(sb-gkaf)的終止子。下文給出了所述引物序列，帶下劃線的區(qū)域是與基因組模板不同源的：
tms2039(正向引物；seqidno：2)：
cagatctgatatcgatgggcccactaactatctatactgtaataat
gttgtatag
tms2040(反向引物；seqidno：3)：
cggaccgggtgaccaagcttaagcgaacatatgtccctc
使用這些引物通過pcr擴(kuò)增出504bp的產(chǎn)物，其包含465bpsb-gkaf終止子序列(seqidno：1)。產(chǎn)物被克隆至pgemteasy(promega)(php31801；圖1；seqidno：4)并確認(rèn)序列?？寺〉膕b-gkaf終止子包括165bp的預(yù)測的sb-gkaf的3′非翻譯區(qū)(utr)以及約300bp的下游序列。然后將擴(kuò)增的sb-gkaf終止子(seqidno：1)序列克隆至農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)轉(zhuǎn)化載體(php34074；圖2；seqidno：5)，其在不同方向具有下列表達(dá)盒：
sb-gkafterminator：gusint：bsvpro和
ubi-pro：ubiintron：mopat：piniiterm。
bsvpro是香蕉條紋病毒啟動(dòng)子，是強(qiáng)效組成型啟動(dòng)子。將以馬鈴薯pinii終止子(keil等人(1986)nucleicacidsres.14：5641-5650)代替了sb-gkaf終止子的構(gòu)建體用作對(duì)照(php34005；seqidno：6)。
實(shí)例2
瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以測試sb-gkaf終止子的功效
在重組構(gòu)建體中測試分離的sb-gkaf終止子序列(seqidno：1)有效充當(dāng)終止子起作用的能力。通過其終止轉(zhuǎn)錄的能力和通過其增加蛋白表達(dá)的能力測試其作為終止子的功效。由于不正確的終止子可導(dǎo)致mrna的3′末端的不正確加工，從而影響rna穩(wěn)定性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)終止子影響蛋白表達(dá)水平。已經(jīng)表明不同終止子可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率有至多100倍的變化(bieri等人，(2002)molecularbreeding10：107-117；an等人(1989)plantcell1：115-122；ingelbrecht等人(1989)，plantcell，1：671-680；ali和taylor(2001)plantmol.bio.，46：251-261)。從而我們對(duì)于sb-gkaf序列(seqidno：1)與熟知的pinii終止子相比增加蛋白表達(dá)的能力進(jìn)行了測試。使用實(shí)例1所述的農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)轉(zhuǎn)化載體php34074(seqidno：5)和php34005(seqidno：6)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化bms(墨西哥黑甜玉米，blackmexicansweet)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化5天后收獲細(xì)胞并用于量化gus活性(mug測定)。當(dāng)gus表達(dá)歸一化至mopat表達(dá)(圖3；表1)時(shí)，sb-gkaf構(gòu)建體(php34074；seqidno：5)表達(dá)比pinii構(gòu)建體(php34005，seqidno：6)高～35％。通過使得蛋白表達(dá)等于或高于pinii終止子的蛋白表達(dá)，這個(gè)信息表明分離的sb-gkaf序列(seqidno：1)有效地充當(dāng)終止子的能力。
表1
*被測量為：nmolesmu/mg總蛋白/小時(shí)/ppmpat
實(shí)例3
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化測定以測試sb-gkaf終止子活性
實(shí)例1中所述農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)轉(zhuǎn)化載體php34074(seqidno：5)和php34005(seqidno：6)，被用于實(shí)例2中所述的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化測定，也被用在gaspe-flint來源的玉米品系中進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以再生轉(zhuǎn)基因玉米植物。
從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物組織進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄酶-pcr(qrt-pcr)和gus測定，以測試分離的sb-gkaf終止子序列(seqidno：1)終止轉(zhuǎn)錄(防止轉(zhuǎn)錄通讀轉(zhuǎn)錄)的能力，并與具有pinii終止子的相比比較gus表達(dá)。
gus表達(dá)測定：
在蛋白以及轉(zhuǎn)錄水平測定轉(zhuǎn)基因植物中g(shù)us基因的表達(dá)。為在蛋白水平測定表達(dá)，對(duì)幼苗葉片材料進(jìn)行mug測定。為在轉(zhuǎn)錄水平測定表達(dá)，使用表2中所示引物進(jìn)行qrt-pcr。
表2
植株生長在溫室中，在發(fā)育的r1期采集葉片樣本用于表達(dá)分析。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體測試多個(gè)植株。分析每個(gè)植株gus基因的表達(dá)。在蛋白(圖4a)和轉(zhuǎn)錄(圖4b)水平，帶有sb-gkaf終止子的gus基因與pinii終止子有相同范圍的gus表達(dá)。
定量反轉(zhuǎn)錄酶pcr(qrt-pcr)以測定通讀轉(zhuǎn)錄通過sb-gkaf終止子：
用來自使用php34074和php34005生成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的葉片組織進(jìn)行qrt-pcr測定。測試每個(gè)植株通讀轉(zhuǎn)錄(通過pinii終止子和sb-gkaf終止子(seqidno：1))的存在。為了評(píng)估將指示這種轉(zhuǎn)錄正持續(xù)通過所述終止子的產(chǎn)物的存在，擴(kuò)增靶向被測試的所述終止子的下游(序列)。設(shè)計(jì)了被測試終止子下游(序列)的兩組引物。
-引物組term1距離終止子～100nt
-引物組term2.1距離終止子～500nt
對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體測試了多個(gè)植株。所述引物顯示于表3中。
表3
1終止子后引物組
2內(nèi)參基因
根據(jù)qrt-pcr結(jié)果將測試植株分為3類：
1.表現(xiàn)出完全終止作用的植株：其中所有g(shù)us轉(zhuǎn)錄本在其到達(dá)特異性引物組位置前被完全終止；
2.表現(xiàn)出高度終止作用的植株：其中g(shù)us轉(zhuǎn)錄本的大部分在其到達(dá)特異性引物組位置前被終止，也被稱為：
引物組term1-δct＞13
引物組term2.1-δct9；和
3.表現(xiàn)出很差終止作用的植株。
如從圖5可以看到，與pinii終止子相比sb-gkaf終止子被證實(shí)擁有“很差終止作用”的植株數(shù)量更少(圖5)。因此對(duì)于sb-gkaf終止子，針對(duì)通過終止子的轉(zhuǎn)錄本的存在的qrt-pcr分?jǐn)?shù)低于對(duì)于pinii終止子的。
序列表
<110>pioneerhi-bredinternationalinc.
abbitt,shane
jung,rudolf
<120>用于植物中基因表達(dá)的終止子序列
<130>bb1984pct
<150>us61/514055
<151>2011-08-02
<160>18
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>459
<212>dna
<213>高粱（sorghumbicolor）
<400>1
aactatctatactgtaataatgttgtatagccgccggatagctagctagtttagtcattc60
agcggcgatgggtaataataaagtgtcatccatccatcaccatgggtggcaacgtgagca120
atgacctgattgaacaaattgaaatgaaaagaagaaatatgttatatgtcaacgagattt180
cctcataatgccactgacaacgtgtgtccaagaaatgtatcagtgatacgtatattcaca240
atttttttatgacttatactcacaatttgtttttttactacttatactcacaatttgttg300
tgggtaccataacaatttcgatcgaatatatatcagaaagttgacgaaagtaagctcact360
caaaaagttaaatgggctgcggaagctgcgtcaggcccaagttttggctattctatccgg420
tatccacgattttgatggctgagggacatatgttcgctt459
<210>2
<211>55
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>2
cagatctgatatcgatgggcccactaactatctatactgtaataatgttgtatag55
<210>3
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>3
cggaccgggtgaccaagcttaagcgaacatatgtccctc39
<210>4
<211>3521
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>載體
<400>4
gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgat60
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agtgagcttactttcgtcaactttctgatatatattcgatcgaaattgttatggtaccca240
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tgctcacgttgccacccatggtgatggatggatgacactttattattacccatcgccgct480
gaatgactaaactagctagctatccggcggctatacaacattattacagtatagatagtt540
agtgggcccatcgatatcagatctgaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcga600
ccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacct660
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aattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagt780
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gtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcg900
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gaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggc1080
gtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagag1140
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gcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagt1560
taccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcgg1620
tggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcc1680
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cgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgatacc1980
gcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggc2040
cgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccg2100
ggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctac2160
aggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacg2220
atcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcc2280
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gcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactc2400
aaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaat2460
acgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttc2520
ttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccac2580
tcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa2640
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatact2700
catactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgg2760
atacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccg2820
aaaagtgccacctgatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgca2880
tcaggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcag2940
ctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagac3000
cgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtgga3060
ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatc3120
accctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagg3180
gagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaa3240
gaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaac3300
caccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctg3360
cgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaa3420
gggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgt3480
tgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactata3521
<210>5
<211>50910
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sb-gkaf終止子構(gòu)建體
<400>5
acgtgaccctagtcacttaggttaccagagctggtcacctttgtccaccaagatggaact60
gcggccgctcattaattaagtcaggcgcgcctctagttgaagacacgttcatgtcttcat120
cgtaagaagacactcagtagtcttcggccagaatggccatctggattcagcaggcctaga180
aggccatttaaatcctgaggatctggtcttcctaaggacccgggatatcgctatcaactt240
tgtatagaaaagttgggccgaattcgagctcggtacggccagaatggcccggaccgggtt300
accgaattcgagctcggtaccactagtaagcttaagcgaacatatgtccctcagccatca360
aaatcgtggataccggatagaatagccaaaacttgggcctgacgcagcttccgcagccca420
tttaactttttgagtgagcttactttcgtcaactttctgatatatattcgatcgaaattg480
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cccatcgccgctgaatgactaaactagctagctatccggcggctatacaacattattaca780
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tttgcggtcgcgagtgaagatccctttcttgttaccgccaacgcgcaatatgccttgcga960
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gacgcggtgatacatatccagccatgcacactgatactcttcactccacatgtcggtgta1080
cattgagtgcagcccggctaacgtatccacgccgtattcggtgatgataatcggctgatg1140
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gccgacagcagcagtttcatcaatcaccacgatgccatgttcatctgcccagtcgagcat1620
ctcttcagcgtaagggtaatgcgaggtacggtaggagttggccccaatccagtccattaa1680
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cactgccactgaccggatgccgacgcgaagcgggtagatatcacactctgtctggctttt1860
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cacttgcaaagtcccgctagtgccttgtccagttgcaaccacctgttgatccgcatcacg1980
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gagcattacgctgcgatggattccggcatagttaaagaaatcatggaagtaagactgctt2160
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gttgttcacacaaacggtgatacctgcacatcaacaaattttggtcatatattagaaaag2280
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tatatatatcaaaggtagaagcagaaacttacgtacacttttcccggcaataacatacgg2460
cgtgacatcggcttcaaatggcgtatagccgccctgatgctccatcacttcctgattatt2520
gacccacactttgccgtaatgagtgaccgcatcgaaacgcagcacgatacgctggcctgc2580
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ccacaggccgtcgagttttttgatttcacgggttggggtttctacaggacggaccatggt2820
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