專利名稱：：抑制人bFGF基因表達(dá)增殖的siRNA序列及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，特別是一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列及其表達(dá)栽體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多肽生長(zhǎng)因子也稱細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，是生物機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等具有多種功能的信號(hào)因子，很多腫瘤可以分泌生長(zhǎng)因子，通過(guò)自分泌和旁分泌的方式刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，所以從某種意義上講，細(xì)胞的癌變是以某種方式干擾或破壞了生長(zhǎng)因子的正常信號(hào)通路，使細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化從有序狀態(tài)變?yōu)槭Э貭顟B(tài)。而這些多肽生長(zhǎng)因子均具備癌基因的生物學(xué)特性，可以稱為前癌基因。生長(zhǎng)因子類基因中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的生物學(xué)作用顯著，它是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的代表成員，其作用較其它成員強(qiáng)十倍或數(shù)十倍?，F(xiàn)已探明該基因與膠質(zhì)瘤的血管生成，與膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖關(guān)系密切，并有可,能抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。國(guó)內(nèi)'外研究證實(shí)，bFGF反義寡核苷酸可以在體外抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但該技術(shù)也存在轉(zhuǎn)染效率低，作用時(shí)間短的不足，使其抑瘤作用受到限制，.另外，人工合成寡核苷酸的費(fèi)用昂貴，也使該技術(shù)的應(yīng)用遇到技術(shù)困難。近年的研究發(fā)現(xiàn)，一些小的雙鏈RNA(double-strandedRM，dsRNA)可以高效、特異地促使體內(nèi)特定基因mRNA降解，誘使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，這種技術(shù)即RMi。在RNAi作用的起始階段中外源性或內(nèi)源性的雙鏈RM被Dicer酶切割為19~21bp的小分子干擾RNA片段(smal1interferingRNAs，siRNAs);隨后siRNA與核酶復(fù)令物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC);RISC激活后通過(guò)石威基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割mRM，從而部分或完全抑制目的基因的表達(dá)。另一方面，細(xì)胞在RNA依賴性RNA聚合酶作用'下，可以siRNA為引物、以mRNA為模板，合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，從而使mRNA也變成了dsRNA,然后在Dicer酶的作用下再次,皮裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞°內(nèi).的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。從RNAi的作用機(jī)制中可見(jiàn)，這種基因表達(dá)調(diào)控方法屬于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)并具有明顯優(yōu)勢(shì)RNAi基因抑制效果確切，應(yīng)用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上、甚至可以達(dá)到基因敲除的效果；其次，RMi抑制具有嚴(yán)格的序列特異性，治療的針對(duì)性強(qiáng)，因而應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)抑制同一基因的多個(gè)靶點(diǎn)或多個(gè)不同基因而不致相互干擾；同時(shí)，RNAi的作用具有級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)和高穿透性更適合惡性J中瘤的實(shí)-瞼研究；此外，RNAi序列識(shí)別的特異性即或?qū)τ梢吧忘c(diǎn)突變形成的癌基因也能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果而對(duì)野生型基因沒(méi)有影響。在對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)腫瘤細(xì)胞中均存在著RNAi的機(jī)制，化學(xué)合成、質(zhì)粒/病毒或其他方式介導(dǎo)的RNAi可以有效地抑制內(nèi)源性'RNA的表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是為了解決膠質(zhì)瘤等腫瘤基因治療問(wèn)題，以RNA干擾機(jī)制為基礎(chǔ)，通過(guò)人工合成或表達(dá)質(zhì)粒序列轉(zhuǎn)錄形成的bFGF小雙鏈RM(siRNA)可以靶向作用于bFGF基因的mRNA,從而阻斷其翻譯過(guò)程，達(dá)到使bFGF基因表達(dá)降低的結(jié)果，而提供一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列和表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，從GenBank中獲得bFGFmRNA的全長(zhǎng)序列，根據(jù)siRNA乾序列選擇的基本原則，針對(duì)bFGF基因設(shè)計(jì)了4條長(zhǎng)度為19個(gè)核苷酸的siRNA(見(jiàn)表1)(由上海吉瑪公司合成)。通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)(實(shí)施例l)，4條siRNA中bFGF-siRM-4的抑制效果最好。將bFGF-siRNA-4序列設(shè)計(jì)shRNA正義鏈和反義鏈，以loop環(huán)相連，稱為shRNA。合成每條shRM的DM模板的兩條單鏈，兩條單鏈DM退火即為DM雙鏈才莫板(shDNASense:'5'-CACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTG-3'Antisense:5'-GATCCAAAAAACGAACTGGGCAGTATAAACTCTCTTGAAGTTTATACTGCCCAGTTCGC-3');再克隆至含U6啟動(dòng)子的pGenesil-1質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shbFGF,并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。酶切結(jié)果證明構(gòu)建的>shRNA已插入載體，經(jīng)測(cè)序證明與設(shè)計(jì)的序列相同(實(shí)施例2)。然后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pGPU6/GFP/Neo-shbFGF轉(zhuǎn)染入高表達(dá)bFGF的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中。根據(jù)綠色焚光蛋白表達(dá)情況檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)應(yīng)用'MTT法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖活性的變化。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞mRNA表達(dá)的變化。用AnnexinV-FITC/PI雙色標(biāo)記的流式細(xì)胞儀法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)^^的凋亡狀態(tài)。因此，本發(fā)明提供一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列，其具有特異性抑制腫瘤細(xì)胞的作用，其堿基序列及作用部位如下5'-CGAACUGGGCAGUAUAAACdtdt-3'5'-GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3'作用于人bFGFmRNA的第857至868位。所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列，其是采用合成的方式形成3'端有2-4個(gè)dt修飾的siRNA。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體，其具有特異性抑制人bFGF基因表達(dá)，特異性抑制人腫瘤細(xì)胞的作用。所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體，其DNA序列中真核質(zhì)粒載體是pGenesil-l，或pcDNA3.0,或pcDNA3.1，或pRK5，或pLuescriptSK所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體，該表達(dá)載體是腺病毒，或腺相關(guān)病毒。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。結(jié)果表明pGPU6/GFP/Neo-shbFGF可通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)作用成功轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shbFGF后的細(xì)胞代謝受抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。MTT吸收值在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)下降，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了不同濃度pGPU6/GFP/Neo-shbFGF的細(xì)胞mRNA表達(dá)均受抑制。流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)表明bFGF-siRNA組在24小時(shí)和48小時(shí)早期凋亡與晚期凋亡都較正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯增多。這樣，本發(fā)明設(shè)計(jì)出針對(duì)bFGF的siRNA和其質(zhì)粒表達(dá)載體，能夠有效抑制bFGF的基因表達(dá)，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明提供的bFGF-siRM及其質(zhì)粒表達(dá)載體可以特異性、高效地抑制人bFGF基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的目的。該siRNA及其質(zhì)粒表達(dá)栽體可用于制備高效、快速、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物。'圖1A是bFGF-siRM轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48小時(shí)PCR擴(kuò)增bFGF基因電泳圖1B是bFGF-siRM轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48小時(shí)PCR擴(kuò)增p-actin基因電泳圖2A是bFGF-siRM轉(zhuǎn)麵U251細(xì)胞后72小時(shí)PCR擴(kuò)增bFGF基因電泳圖；圖2B是bFGF-siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后72小時(shí)PCR擴(kuò)增P-actin基因電泳圖3A是正常對(duì)照組轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48小時(shí)后bFGF的表達(dá)(x200);圖3B是si,-4組轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48小時(shí)后bFGF的表達(dá)(x200);圖4是質(zhì)粒重組栽體的酶切鑒定；圖5A是siRM-4轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后24小時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)情況；圖5B是siRM-4轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48小時(shí)綠色焚光蛋白表達(dá)情況；圖6是bFGF-siRNA轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)MTT吸收值；圖7A是48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組Annexin-V/PI雙染bFGF-siRNA轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)J!包凋亡情況；圖7B是48小時(shí)陰性對(duì)照組Annexin-V/PI雙染bFGF-siRNA轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；圖8是pGPU6/GFP/;Veo質(zhì)粒載體圖i普；圖9是bFGF-siRNA堿基序列圖。，圖中圖1AM:Marker;lanel:正常對(duì)照組；lane2:陰性對(duì)照組；lane3:siRNA-ljlane4:siRM-2jlane5:siRNA-lane6:siRNA-4j圖1B顯示M:Marker;lanel:正常對(duì)照組；lane2:陰性對(duì)照組；lane3:siRNA-:^lane4:siRM-lane5:siRNA-35lane6:si濕-4j圖2A顯示M:Marker;lanel:正常對(duì)照組；lane2:陰性對(duì)照組；lane3:siRNA-ljlane4:siRNA-2jlane5:siRNA-3jlane6:siRNA-圖2B顯示M:Marker;lanel:正常對(duì)照組；lane2:陰性對(duì)照組；lane3:siRNA-l;lane4:siRNA-2;lane5:siRM-3;lane6:siRNA-4.'圖4中顯示M:Lamda/Eco130I;1-6:EcoRI酶切；8-13:BamHI酶切。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例一千擾人bFGF基因表達(dá)的siRM序列設(shè)計(jì)和篩選1.siRNA序列設(shè)計(jì)利用NCBIGenbank檢索bFGFmRM的全長(zhǎng)序列，參照siRM設(shè)計(jì)原則，并運(yùn)用RMstructure軟件模擬耙mRM的二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡量避免自身結(jié)合的莖區(qū)，選擇配對(duì)區(qū)域較少的序列，如線區(qū)和環(huán)區(qū)。篩選出4個(gè)19個(gè)核苷酸的序列，并將它們帶入BLAST基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除了和其他編碼序列/EST同源。并將其分別命名為bFGF-siRNA-l、bFGF-siRNA-2、bFGF-siRM-3、bFGF-si謹(jǐn)一4(見(jiàn)表1)(由上海吉瑪公司合成)。參見(jiàn)圖9。_表1干擾人bFGF基因表達(dá)的siRNA序列_ii^序列Sense:5'-CAUCAAGCUACAACUUCAATT-3'Antisense:5'-UUGAAGUUGUAGCUUGAUGUTT-3'Sense:5'-AACCGUUACCUGGCUAUGATT-3'Antisense:5'-UCAUAGCCAGGUAACGGUUATT-3'Sense:5'-AUGUGUUACGGAUGAGUGUTT陽(yáng)3'Antisense:5'-ACACUCAUCCGUAACACAUTT-3'Sense:5'陽(yáng)CGAACUGGGCAGUAUAAACTT-3'Antisense:5'-GUUUAUACUGCCCAGUUCGTT-3'Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Antisense:5'-ACGUGACAAGUUCGGAGAATT-3'2.篩選出抑制效果最好的siRNA序列2.1材料與方法2.1.1轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectaminTM2000說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟，利用月旨質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染于U251細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分為六組，分別為siRM-l、s認(rèn)A-2、siRNA-3和siRNA-4、陰性對(duì)照siRNA和正常對(duì)照組。siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度為4(ig/L。2.1.2采用RT-PCR方法檢測(cè)bFGFmRNA表達(dá)水平采用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，-7(TC保存，備用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)，提取總RNA并定量，各實(shí)驗(yàn)組取同等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后PCR擴(kuò)增bFGF基因及p-actin基因，bFGF引物為上游序列為5'-CACCATGGCAGCCGGCAGCATCA-3'，下游序列為5"-TCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3'，擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為485bp。p-actin引物為上游序列為5'-CCTCGCCTTTGCCGATC-3、下游序列為5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為626bp(引物由北京賽百盛合成)。PCR反應(yīng)體系為20ml，包括CDM5jli1,10xBuffer2u1，25mmol/LMgC121.2/a1，2.5mmol/LdNTP2ni1，TaqDNA聚合酶O.2上下游引物(5ymol/L)各lpi,三蒸水加至20ml混均。擴(kuò)增反應(yīng)由DNAthermalcycler(GeneamPCRSystem2400)完成，bFGF的擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性5min;94。C變性45s、6(TC退火60s、72。C延伸60s，循環(huán)32次；終延伸72。C10min。P-actin的擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性5min;94。C變性30s、57。C退火30s、72。C延伸90s,循環(huán)25次;終延伸72。C10min。bFGF-siRNA-lbFGF-siRNA-2bFGF-siRNA-3bFGF-siRNA-4陰性對(duì)照組siRNA7PCR產(chǎn)物用1xTBE電泳緩沖液的2"/。(w/v)瓊脂糖凝膠(含O.5/ag/ml的溴化乙錠)電泳。運(yùn)用Gel-proAnalyzerversion4.5軟件分析電泳結(jié)果，各基西條帶的含量以IOD值來(lái)表示，IOD(峰面積卜OD(光密度值)xpix(面積)，根據(jù)bFGF基因與actin基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物IOD的比值估算目的基因的相對(duì)含量。2.1.3免疫組化檢測(cè)bFGF的蛋白表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞以2.Ox105/mL的密度接種于載玻片上，接種24h后，轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)按照免疫組化染色ABC法按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，進(jìn)行免疫組化染色。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積即為免疫組化的結(jié)果。2.1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，以5xl04/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組、脂質(zhì)體組和正常對(duì)照組在接種24h后，轉(zhuǎn)染并繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，進(jìn)行MTT檢測(cè)，，酶標(biāo)4義測(cè)定550nm波長(zhǎng)下的OD值。2.1.5AnnexinV-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞按4xl05/ml的量接種于6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，24h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRM每種處理重復(fù)三次。轉(zhuǎn)染48h和72h后，收集細(xì)胞，并按常規(guī)處理細(xì)胞。加入5u1AnnexinV-FITC和/或5u1PI,混勻，4。C避光孵育15分鐘，1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀(BD公司)測(cè)定。3.結(jié)果3.1RT-PCR檢測(cè)siRNA對(duì)bFGFmRNA表達(dá)的抑制由電泳圖可看出48小時(shí)和72小時(shí)正常對(duì)照組、R^性對(duì)照組以及siRNA各組的bFGFmRNA表達(dá)量不同，見(jiàn)圖1和圖2。圖像掃描分析結(jié)果，見(jiàn)表2。表2bFGFRT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖像掃描分析結(jié)果組別例數(shù)IOD,/10Dh"in平均值正常對(duì)照組30.9725陰性對(duì)照組30.9522轉(zhuǎn)染后24小bFGF-siRNA-l30.8653時(shí)bFGF-siRNA-230.7788bFGF-siRNA-330.6902bFGF-s濯A-430.5770正常對(duì)照組30.9478陰性對(duì)照組30.8850轉(zhuǎn)染后48小bFGF-si腿-130.8127時(shí)bFGF-si腿-230.7972bFGF-siRNA-330.7723bFGF-siRNA-430.52923.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)siRNA對(duì)bFGF蛋白表達(dá)的抑制情況檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)bFGF在U251細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，見(jiàn)圖3。從圖3A中可見(jiàn)bFGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性胞漿呈棕色，bFGF-siRNA-4組(圖3B)蛋白表達(dá)陰性胞漿呈無(wú)色。免疫組化評(píng)分為正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組均為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，bFGF-siRNA-1、bFGF-siRNA-2、bFGF-siRM-3和bFGF-siRM-4分別為弱陽(yáng)性(+)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)、陰性(-)和陰性(-)。3.3不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染48及72小時(shí)后，進(jìn)行MTT測(cè)定。三個(gè)不同時(shí)段的MTT吸收值見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，在48及72小時(shí)，實(shí)^^組MTT吸收值與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表3轉(zhuǎn)染48和72小時(shí)后MTT吸收值組別例數(shù)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)正常對(duì)照組101.192±0.1260.947±0.075陰性對(duì)照組100.520±0.0450.810±0.102bFGF-siRNA-4組100.404±0.073*0.568±0.069*注*與正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，P〈0.05。3.4bFGF-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響bFGFsiRNA-4轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U25148小時(shí)后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡狀況。正常對(duì)照組、脂質(zhì)體組及賣驗(yàn)組(bFGF-siRNA-4)的早期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞比例平均為0.78%、6.83%、14.85%,晚期凋亡所占總細(xì)胞比例平均為0.11%、1.39%、8.12%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明bFGF-siRNA-4是理想的bFGF小分子干擾RNA序列，將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞能夠抑制該基因的mRNA和蛋白的表達(dá)并能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性。實(shí)施例二bFGFsiRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建l.寡核苷酸的合成將實(shí)施例1篩選出的bFGF-siRNA-4序列設(shè)計(jì)shRNA正義鏈和反義鏈，shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5，.端添加了CACC，與Bbsl酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5，端添加了GATC,與BamHI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；如果siRNA的第一個(gè)堿基不是G，則在CACC后補(bǔ)加一個(gè)G。ShDNAsequence:Ssnss:TRANSCRIPTSGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTT2.shRNA模板的退火將DMoligo分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100uM。糾目應(yīng)的正義鏈和反義鏈oligo溶液，按照如下配比配置退火反應(yīng)體系。ReagentVolume(ul)10XshDNAAnnealing~Buffersensestrand(100uM)antisensestrand(100uM)_ddH20_Total50在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理95C5min;(95-n)C20sec，n為當(dāng)前循環(huán)數(shù)，共70個(gè)循環(huán)。退火處理后得到濃度為10的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋500倍，終濃度為20nM,用于連接反應(yīng)。3.pGPU6/GFP/Neo載體的線性化:取2ugpGPU6/GFP/Neo載體(圖8)，按照如下體系進(jìn)行酶切處理ReagentVolume(ul)10XBufferG5版I22pGPU6/GFP/Neo2ugddH20To50ulTotal5037C酶切1小時(shí)，瓊脂糖電泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0(TaKaRa)回收，電泳檢測(cè)估算濃度，稀釋濃度至50ng/ul。4.pGPU6/GFP/Neo-shbFGF質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建555354.1按照如下體系進(jìn)行載體的連接反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>22Clhr,transformtoJM109competentcells.4.2挑取單菌落，接種到含50ug/mlKanamycin的LB培養(yǎng)集中。4.3使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用勘/hHI，fcdlI分別酶切鑒定(圖4)。陽(yáng)性重組載體應(yīng)該可以被勘感I切開(kāi)，而不能被&dlI切開(kāi)。酶切結(jié)果表明，所有質(zhì)粒表達(dá)載體均為陽(yáng)性重組載體，選擇克隆sribFGF-a，進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果如下shbFGF-a序列正確。GGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgtgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgtgccgtcctccttgagtcgatgcccttcagctcgatgcgtcacagggtgtcgccctcgactcactcggcgcggtctgtagtgcgtcgtct6gagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgcatggcggacctgagagtcctgctgctcatgtggtcggtagccgcctgaagacat實(shí)施例三bFGF-siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體抑制膠質(zhì)瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究將實(shí)施例2構(gòu)建的bFGF-siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shbFGF轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤的U251細(xì)胞后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)染、RT-PCR、免疫組化、MTTAnnexinV-FITC等實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1略)1.bFGFsiRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)，觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中脂質(zhì)體用量為10"1，質(zhì)粒用量為4ug時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。(見(jiàn)圖5)2.bFGFsiRM質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性的測(cè)定轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)的MTT吸收值，結(jié)果(見(jiàn)表4，圖6):表4pGPU6/GFP/Neo-shRNA轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)MTT吸收值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注陰性對(duì)照組脂質(zhì)體/陰性質(zhì)粒為10lil/4ug;;siRNA組脂質(zhì)體/bFGF質(zhì)粒為10ul/4ug;'4.bFGFsiRNA質(zhì)粒表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的測(cè)定轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡，Annexin-V/PI雙染法。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)一驗(yàn)組的早期凋亡比例分別為O.31、0.26、0.23，晚期凋亡比例分別為6.96、3.01、3.03，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不大；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡比例分別為0.70、4.32、8.17(見(jiàn)圖7),晚期凋亡比例分別為4.64、4.05、6.54,表明實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48小時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中誘導(dǎo)早期凋亡效果較顯著，對(duì)晚期凋亡也有一定的誘導(dǎo)作用。SEQUENCELISTING<110>天津市第一中心醫(yī)院<120>抑制人bFGF基因表達(dá)增殖的siRNA序列及其表達(dá)載體和應(yīng)用<130>1<160>1<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>38<212>RNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<220><221>RNA<222>(1)..(38)<223><400>1cgaacugggcaguauaaacguuuauacugcccaguucg38<210>2<211〉1128<212>DNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<220><221>2<222〉(1)..(1128)<223><400>1gggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagat60aattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaa120gtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatat180gcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacg240aaacaccgcgaactgggcagtataaacttcaagagagtttatactgcccagttcgttttt300tggatccactagttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttcccttt360agtgagggttaattgcgcgttaagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaat420gcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgetttatttgtaaccat480tataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttca540gggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctga600ttatgatcagttatctagatccggtggatctgagtccggacttgtacagctcgtccatgc660cgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgt720tggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacgg780ggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcct840cgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatga900tatagacgttgtggctgtgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgtgccgtcctcc960ttgagtcgatgcccttcagctcgatgcgtcacagggtgtcgccctcgactcactcggcgc1020ggtctgtagtgcgtcgtctggagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgcatggcg1080gacctgagagtcctgctgctcatgtggtcggtagccgcctgaagacat1128權(quán)利要求1.一種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列，其具有特異性抑制腫瘤細(xì)胞的作用，其堿基序列及作用部位如下5′-CGAACUGGGCAGUAUAAACdtdt-3′<p>5′-GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3′<p>作用于人bFGFmRNA的第857至868位。2.如4又利要求1所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRM序列，其是采用合成的方式形成3'端有2-4個(gè)dt修飾的siRM。3.—種抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體，其具有特異性抑制人bFGF基因表達(dá)，特異性抑制人腫瘤細(xì)胞的作用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增瑋的siRNA表達(dá)載體，其特征在于DNA序列中真核質(zhì)粒栽體是pGenesil-1，或pcDNA3.0，或pcDNA3.1,或pRK5，或pLuescriptSK。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體是腺病毒，或腺相關(guān)病毒。6.權(quán)利要求1所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA序列在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求3所述抑制人bFGF基因表達(dá)和增殖的siRNA表達(dá)載體在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制人bFGF基因表達(dá)的siRNA序列和表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)。本發(fā)明是將bFGF-siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，可以靶向作用于bFGF基因的mRNA，從而阻斷其翻譯過(guò)程，有效地沉默bFGF基因，能夠有效抑制bFGF的基因表達(dá)，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明可用于制備高效、快速、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物。文檔編號(hào)A61P35/00GK101575602SQ20081005300公開(kāi)日2009年11月11日申請(qǐng)日期2008年5月6日優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日發(fā)明者馮學(xué)泉,飚張,徐新女,王淑杰,王金環(huán)申請(qǐng)人:天津市第一中心醫(yī)院