本發(fā)明涉及一種應(yīng)用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工藝，屬于功能糖醇合成技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海藻糖(trehalose)又名罩糖，是一種由葡萄糖分子以α，α-1，1-糖昔鍵相連而成的非還原性二糖，它廣泛地存在于微生物、蝦類、昆蟲、脊椎動(dòng)物以及植物等之中。海藻糖對(duì)于生物體及生物大分子、生物膜等都具有良好的非特異性保護(hù)作用，使得細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境條件(如高溫、冷凍、脫水、高滲透壓等)具有高效的抗逆性，因此被譽(yù)為"生命之糖"。此外，海藻糖還具有性質(zhì)穩(wěn)定、甜度低、人類吸收緩慢以及不形成齲齒的特點(diǎn)。因此，海藻糖被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域之中。

海藻糖的商品化制備始于20世紀(jì)40年代捷克用酒精從面包酵母中提取海藻糖?，F(xiàn)代的制備方法主要包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法。其中，化學(xué)合成法產(chǎn)率低，分離困難，難以工業(yè)化；微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化率較低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，使得海藻糖的提取、精制困難。酶轉(zhuǎn)化法是目前海藻糖生產(chǎn)的主要途徑，許多生物體內(nèi)部有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表達(dá)出來(lái)，利用這些酶與底物進(jìn)行催化反應(yīng)，可以大規(guī)模的生產(chǎn)海藻糖。1995年，日本首次實(shí)現(xiàn)了酶法制備海藻糖的大規(guī)模生產(chǎn)，使海藻糖的價(jià)格大幅下降。但是，海藻糖合酶屬于胞內(nèi)酶，酶法生產(chǎn)海藻糖過(guò)程中通常要破碎菌體，提取與純化海藻糖合成酶系，而在破碎及純化過(guò)程中容易造成酶的損失，這無(wú)疑加大了企業(yè)的生產(chǎn)成本。

利用全細(xì)胞催化合成海藻糖可以免去細(xì)胞破碎工序，提高酶的穩(wěn)定性和利用率，得到高純度的產(chǎn)物，從而降低生產(chǎn)成本。但是，由于微生物細(xì)胞膜的通透性屏障，使反應(yīng)底物和產(chǎn)物難以自由出入細(xì)胞，生物催化的效率明顯低于純酶催化反應(yīng)體系。解決這個(gè)技術(shù)問(wèn)題的關(guān)鍵是通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，增強(qiáng)胞內(nèi)酶的使用率，從而提高海藻糖在反應(yīng)體系中的濃度。

現(xiàn)有技術(shù)中，提高細(xì)胞通透性的處理方法主要包括以超聲法、凍融法為物理法；有機(jī)溶劑和表面活性劑等化學(xué)法。

物理法的技術(shù)原理為通過(guò)造成目標(biāo)細(xì)胞細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)性損傷未提高其通透性。例如，文獻(xiàn)通過(guò)凍干法來(lái)破壞細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)，可以有效增加細(xì)胞的通透性，提高酶的催化活力。(薛璐，馬鶯.透性化海藻糖合酶的研究[j].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，28(1)：16-18.)物理法提高通透性的技術(shù)缺陷為工業(yè)放大過(guò)程比較困難，實(shí)際生產(chǎn)中采用物理法提高通透性的技術(shù)有待設(shè)計(jì)與檢驗(yàn)。

化學(xué)法的技術(shù)原理為滲透劑透過(guò)細(xì)胞壁后與細(xì)胞膜的脂質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)破壞蛋白質(zhì)的氫鍵使之變性，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性，使細(xì)胞膜失去原有的對(duì)胞內(nèi)外物質(zhì)的傳遞調(diào)控能力?；瘜W(xué)法添加的試劑多為毒性極強(qiáng)的有機(jī)試劑，例如，甲苯，二甲基亞砜，十六炕基三甲基澳化鏡等等。因此，化學(xué)法中有毒試劑的殘留會(huì)給用于食材的海藻糖生產(chǎn)帶來(lái)極大的安全隱患，而且有機(jī)試劑的殘留也會(huì)給海藻糖的下游分離純化生產(chǎn)帶來(lái)極大壓力，不利于成本的降低。另外，化學(xué)法在增強(qiáng)細(xì)胞通透性的同時(shí)，還會(huì)造成酶的破壞。

自誘導(dǎo)(auto-induction)是最早由紐約厄普頓的布魯克黑文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的studier等提出的一種利用培養(yǎng)基中碳源轉(zhuǎn)換而誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的方法，即首先以葡萄糖為碳源支持大腸桿菌生長(zhǎng)至飽和，待葡萄糖消耗殆盡，培養(yǎng)基中另一種成分乳糖在lacy與lacz的基因產(chǎn)物透過(guò)酶(lactosepermease)和β-半乳糖苷酶(galactosidase)的協(xié)助下，乳糖穿過(guò)細(xì)胞膜并部分轉(zhuǎn)化為異乳糖開啟t7表達(dá)系統(tǒng)的方法。乳糖除了作為誘導(dǎo)物之外，其代謝產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操縱子的作用下也將轉(zhuǎn)化成葡萄糖)也可作為細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源。與傳統(tǒng)的iptg(異丙基白d硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)方法相比，在接種之后自誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程不需要對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而減少了在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)物的處理，極大地方便了高通量篩選。而且，以價(jià)格低廉、無(wú)毒的乳糖替代價(jià)格高昂的iptg可以大大地降低生產(chǎn)的成本，在重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)中有著重要的意義。

利用自誘導(dǎo)基培養(yǎng)發(fā)酵得到大腸桿菌細(xì)胞。在催化的過(guò)程中，無(wú)需經(jīng)過(guò)外源處理，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞在磷酸鹽緩沖體系下即可以進(jìn)行全細(xì)胞催化底物反應(yīng)。

本發(fā)明將磷酸鹽緩沖液配制麥芽糖溶液直接流加入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的發(fā)酵液中，偶聯(lián)發(fā)酵和酶催化，省去了處理發(fā)酵液的中間過(guò)程，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了部分副產(chǎn)物葡萄糖被菌體有效利用，提高了麥芽糖轉(zhuǎn)化率，完成了海藻糖的高效催化。目前，此種偶聯(lián)發(fā)酵和酶催化過(guò)程，有效利用副產(chǎn)物，提高底物轉(zhuǎn)化率的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用海藻糖合成酶催化合成海藻糖的新工藝。本發(fā)明的工藝不僅偶聯(lián)發(fā)酵和酶催化，省去了處理發(fā)酵液的中間過(guò)程，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本，而且實(shí)現(xiàn)了部分副產(chǎn)物葡萄糖被菌體有效利用，提高了麥芽糖轉(zhuǎn)化率，完成了海藻糖的高效催化，從而進(jìn)一步降低海藻糖的生產(chǎn)成本。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

將包含海藻糖合成酶基因的大腸桿菌基因工程菌接種至自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶，獲取發(fā)酵液；用磷酸鹽緩沖液配制麥芽糖溶液，將該溶液直接流加入發(fā)酵液中繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵和酶催化反應(yīng)偶聯(lián)進(jìn)行，得到富含海藻糖的液體，后分離干燥獲得海藻糖晶體。

具體的，本發(fā)明所述的工藝，包括如下步驟：

(1)將包含海藻糖合成酶基因的大腸桿菌基因工程菌接種至自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶，獲取發(fā)酵液；其中，所述大腸桿菌基因工程菌中包含的海藻糖合成酶基因來(lái)源于灰產(chǎn)色鏈霉菌streptomycesgriseochromogenes；

(2)待步驟(1)中的發(fā)酵液中菌體生長(zhǎng)接近穩(wěn)定時(shí)，將磷酸鹽緩沖液配置的麥芽糖底物直接流加到發(fā)酵液中，獲取混合液體；

(3)步驟(2)中的混合液體繼續(xù)發(fā)酵，并偶聯(lián)酶催化過(guò)程，后分離干燥獲得海藻糖晶體。

優(yōu)選的，上述步驟(2)中，用磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為10％麥芽糖溶液，將磷酸鹽緩沖液配置的麥芽糖溶液按發(fā)酵液：麥芽糖溶液＝1：1的體積比流加到發(fā)酵液中，獲取混合液體。

優(yōu)選的，上述步驟(3)中，催化反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速100-200rpm，反應(yīng)10-20h。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液配制方法為：a液：稱取nah2po4·2h2o6.24g，蒸餾水溶解，定容至1l，獲取0.04mol/lnah2po4；b液：稱取na2hpo4·12h2o14.32g，蒸餾水溶解，定容至1l，獲取0.04mol/lna2hpo4；a液與b液混合，調(diào)節(jié)ph至7.4，獲取0.04mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中，在將大腸桿菌基因工程菌接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基前，還包括活化步驟，具體為：

(1)采用劃線法于加氨芐的固體lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌，獲得大腸桿菌單菌落；挑取單菌落接種于加氨芐的lb液體培養(yǎng)基活化菌種，活化培養(yǎng)條件為37℃，200rpm，培養(yǎng)時(shí)間8-12h；

(2)取所述活化的菌種按接種量1.5％(v/v)接種到加氨芐的lb培養(yǎng)基繼續(xù)活化，活化培養(yǎng)條件為37℃，200rpm，培養(yǎng)時(shí)間8-12h。

取步驟(2)中活化的菌種按體積比1.5％(v/v)的接種量將菌種接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，誘導(dǎo)產(chǎn)酶至菌體生長(zhǎng)接近穩(wěn)定，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm，獲得發(fā)酵液。

優(yōu)選的，所述加氨芐的固體lb培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化納10g/l，氨芐抗生素0.1g/l，瓊脂20g/l；所述加氨芐的液體lb培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，氨芐抗生素0.1g/l。

所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：甘油5g/l、na2hpo46g/l、k2hpo43g/l、nh4cl1g/l、nacl0.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、大豆蛋白胨10g/l，氨芐抗生素0.1g/l。

現(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)酵和酶催化是兩個(gè)獨(dú)立的部分，中間過(guò)程復(fù)雜繁瑣，酶催化所得副產(chǎn)物葡萄糖也得不到有效利用，還增加了下游分離成本。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將磷酸鹽緩沖液配制麥芽糖溶液直接流加入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的發(fā)酵液中，發(fā)酵和酶催化可以偶聯(lián)進(jìn)行，省去了處理發(fā)酵液的中間過(guò)程，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了部分副產(chǎn)物葡萄糖被菌體有效利用，進(jìn)一步提高了麥芽糖轉(zhuǎn)化率，完成了海藻糖的高效催化。

通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)方案即可實(shí)現(xiàn)海藻糖合成效率的提高和生產(chǎn)成本的降低。發(fā)酵和酶催化偶聯(lián)，部分副產(chǎn)物葡萄糖被菌體有效利用，打破酶催化的可逆反應(yīng)的平衡，使得反應(yīng)進(jìn)一步向著產(chǎn)物生產(chǎn)的方向進(jìn)行被認(rèn)為是最直接的原因。

本發(fā)明的有益效果在于：

使用本發(fā)明的工藝，偶聯(lián)了自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵和酶催化過(guò)程，省去了處理發(fā)酵液的中間過(guò)程，簡(jiǎn)化了操作，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，是一種高效的催化工藝。

使用本發(fā)明的工藝來(lái)進(jìn)行催化合成海藻糖，部分葡萄糖副產(chǎn)物可以被菌體有效利用，減少了副產(chǎn)物的排放，降低了下游分離成本，提高了麥芽糖底物的轉(zhuǎn)化率，底物在30℃反應(yīng)16-20h底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90.1％，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，是一種簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)、綠色的催化過(guò)程。

使用本發(fā)明的工藝與物理法相比，操作方式簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，能夠進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)；與化學(xué)法相比，增加了生產(chǎn)過(guò)程的安全性，杜絕了毒物殘留，減小了海藻糖分離純化的壓力。

使用本發(fā)明的工藝對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)影響微乎其微，對(duì)環(huán)境綠色友好，不會(huì)造成環(huán)境污染。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例說(shuō)明菌種的來(lái)源。

本專利所用的菌種為包含來(lái)源于灰產(chǎn)色鏈霉菌streptomycesgriseochromogenes的海藻糖合成酶基因的大腸桿菌基因工程菌，其中大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建方式采用專利cn201210160403中所述的方法，對(duì)構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌編號(hào)為bl21-tre1(已在發(fā)明人的在先專利cn201310112536中公開)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例說(shuō)明偶聯(lián)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和酶催化過(guò)程，菌體有效利用部分葡萄糖副產(chǎn)物，高效合成海藻糖的具體合成步驟以及合成效果。

取實(shí)施例1中所獲得bl21-tre1菌株用于海藻糖合成催化。

具體步驟如下：

(1)采用劃線法于加氨芐的固體lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌獲得大腸桿菌單菌落。其中加氨芐的固體培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g/l，酵母5g/l，氯化鈉10g/l，氨芐抗生素0.1g/l，瓊脂20g/l。具體的操作過(guò)程為，按要求配制培養(yǎng)基，將配制好的培養(yǎng)基于121℃下滅菌30min，待冷卻后倒平板，采用劃線法接種，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲取大腸桿菌單菌落。

(2)挑取上述單菌落接種于加氨芐的lb液體培養(yǎng)基活化菌種活化培養(yǎng)條件為37℃，200rpm，培養(yǎng)時(shí)間8-12h。其中加氨芐的lb液體培養(yǎng)配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，氨芐抗生素0.1g/l。按照上述要求配制好培養(yǎng)基后，分裝于250ml搖瓶中，裝液量為50ml，將配制好的培養(yǎng)基于121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，于無(wú)菌條件挑取單菌落接種于搖瓶中活化菌種。

(3)取第(2)步中活化的菌種按接種量1.5％(v/v)接種到加氨芐的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)活化。其中加氨芐的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：甘油5g/l、na2hpo46g/l、k2hpo43g/l、nh4cl1g/l、nacl0.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、大豆蛋白胨10g/l，氨芐抗生素0.1g/l。按照上述要求配制好培養(yǎng)基后，分裝于250ml搖瓶中，裝液量為50ml，將配制好的培養(yǎng)基于121℃下滅菌30min，冷卻至室溫。

本實(shí)施例中，采取5l發(fā)酵罐來(lái)培養(yǎng)菌體。待滅菌結(jié)束冷卻至室溫后，取活化的菌種按接種量1.5％(v/v)接種到加氨芐的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵罐中。保持培養(yǎng)條件為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量為2vvm，誘導(dǎo)產(chǎn)酶，培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)接近穩(wěn)定。

(4)將磷酸鹽緩沖液配置的麥芽糖底物直接流加到發(fā)酵液中，獲取混合液體；

(5)步驟(4)中的混合液體繼續(xù)發(fā)酵，并偶聯(lián)酶催化過(guò)程，后分離干燥獲得海藻糖晶體。

磷酸鹽緩沖液配制的具體步驟為，a液：稱取nah2po4·2h2o6.24g，蒸餾水溶解，定容至1l，獲取0.04mol/lnah2po4；b液：稱取na2hpo4·12h2o14.32g，蒸餾水溶解，定容至1l，獲取0.04mol/lna2hpo4；a液與b液混合，調(diào)節(jié)ph至7.4，獲取0.04mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液。

用磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為10％麥芽糖溶液，按體積比為步驟(4)所述發(fā)酵液：麥芽糖溶液為1：1進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)條件為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100-200rpm，16-20h獲得富含海藻糖的混合溶液。

用高效液相色譜法測(cè)定體系中的海藻糖濃度，并計(jì)算海藻糖的轉(zhuǎn)化率，以此來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的催化活性。其中，色譜柱為alltimaamino100a5u柱(4.6mm×250mm)；流動(dòng)相為75％,乙腈/25％h2o。

(6)分離干燥獲得海藻糖純品。

經(jīng)過(guò)測(cè)算，結(jié)果顯示利用偶聯(lián)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵和酶催化催化合成海藻糖的方法，部分副產(chǎn)物葡萄糖被菌體有效利用，細(xì)胞對(duì)麥芽糖的的轉(zhuǎn)化率為90.1％。

通過(guò)此試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此偶聯(lián)方法操作步驟簡(jiǎn)易，生產(chǎn)時(shí)間短，副產(chǎn)物被有效利用，底物轉(zhuǎn)化率高。