本發(fā)明涉及一種乳酸的制備方法，更詳細(xì)地，涉及一種通過生化方法來生產(chǎn)d型乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸作為食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的原料被廣泛使用，并且作為生物塑料材料的多重乳酸的單體來使用[1)c.akerberg，k.hofvendahl，g.zacchi，b.hahn-hagerdal，appl.microbiol.biotechnol.1998，49，682-690；2)k.hofvendahl，b.hahn-hagerdal，enzymemicrob.technol.2000，26，87-107.]。最近，隨著對生物塑料的需求急劇增加，環(huán)保塑料備受矚目，其中，多重乳酸因具有生物降解性及作為脫石油高分子而格外受到矚目。通過使用多重乳酸作為原材料，可以制備汽車、家電、房屋及一次性塑料容器等生物降解性塑料，并且可以根據(jù)乳酸異構(gòu)體的比例來調(diào)節(jié)塑料的加工性和機(jī)械性強(qiáng)度。隨著多重乳酸的使用性的增加，對作為其單體的乳酸的合成方面也正在展開積極的研究。
乳酸可以通過化學(xué)方法和生物化學(xué)方法來制備。具代表性的化學(xué)方法為通過乳腈的水解反應(yīng)來制備乳酸[1)r.datta，s.p.tsai，p，bonsignore，s.h.moon，j.r.frank，femsmicrobiol.rev.1995，16，221-231；2)y.j.wee，j.n.kim，h.w.ryu，foodtechnolo.biotechnol.2006，44，163-172]。在堿催化劑的作用下通過氰化氫和乙醛的加成反應(yīng)，在10分鐘內(nèi)，以99％以上的轉(zhuǎn)換率來合成得到乳腈。合成的乳腈通過蒸餾來完成分離和提純過程后，通過使用硫酸催化劑的水解反應(yīng)來轉(zhuǎn)換成乳酸。此時(shí)，雖然轉(zhuǎn)換率為99％以上，但是生成的乳酸是外消旋乳酸，所述外消旋乳酸混合有相同量的下述兩種異構(gòu)體(d型乳酸和l型乳酸)。
另一種化學(xué)方法為使用將鐵或鈷等的金屬吸附于硅膠支撐體上的催化劑，在乙醛和一氧化碳，以及水的存在下制備乳酸的方法[s.k.bhattacharyya，s.k.palit，a.r.das，ind.eng.chem.prod.res.develop.1970，1，92-95.]。使用13g的催化劑，使5.5g的乙醛進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)后，雖然以44％的轉(zhuǎn)換率生成了乳酸，但是需要在高溫高壓條件(230℃，350氣壓)下進(jìn)行反應(yīng)，而且還需要使用價(jià)格昂貴的金屬催化劑作為催化劑，因此，在經(jīng)濟(jì)方面存在局限性。
化學(xué)方法雖然有反應(yīng)簡單、時(shí)間比較短等優(yōu)點(diǎn)，但是對于商業(yè)性的使用來說，在經(jīng)濟(jì)方面受到限制，并且作為生成物只能制備出混合有相同的量的兩個(gè)異構(gòu)體的外消旋乳酸。
生物化學(xué)方法為通過使用細(xì)菌或霉菌等的微生物的碳水化物的發(fā)酵過程來制備乳酸，其中，使用的碳水化物為蔗糖、乳糖、淀粉及糊精等，非常多樣。如果通過生物化學(xué)方法來制備乳酸，可以根據(jù)使用的微生物或碳水化物來分別得到純的d型乳酸和l型乳酸。[1)y.j.wee，j.n.kim，h.w.ryu，foodtechnol.biotechnol.2006，44，163-172]。
通常，制備乳酸時(shí)主要使用細(xì)菌發(fā)酵方法。在現(xiàn)有技術(shù)中，公開有利用由德氏乳酸桿菌ld0025(lactobacillusdelbrueckii)和ld0028生產(chǎn)的淀粉酶(α-amylase、β-amylase)及支鏈淀粉酶(pullulanase)等的酶的水解作用來使大米粉(ricepowder)發(fā)酵，從而生產(chǎn)高純度的d型乳酸的方法[k.fukushima，k.sogo，s.miura，y.kimura，macromol.biosci.2004，4，1021-1027]。另外，還公開有在l型乳酸脫氫酶基因(l-lactatedehydrogenasegene)消失的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)中導(dǎo)入解讀牛鏈球菌148(streptococcusbovis148)的α型淀粉酶(α-amylase)的質(zhì)粒，并通過光學(xué)方法來從玉米淀粉中制備純的d型乳酸的方法[k.okano，q.zhang，s.shinkawa，s.yoshida，t.tanaka，h.fukuda，a.kondo，appl.environ.microbiol.2009，75，462-467]。還報(bào)道有德氏乳酸桿菌nbrc3534(lactobacillusdelbrueckii)菌株將經(jīng)過蒸汽處理的甘蔗渣作為碳源來使用，從而制備大量的d型乳酸的方法[c.sasaki，r.okumura，a.asakawa，c.asada，y.nakamura，j.phys.conf.ser.2012，352-361]。
l型乳酸也可以像d型乳酸一樣通過使用多種菌株來制備出純的l型乳酸。報(bào)道有以廢糖蜜作為底物，通過使用糞腸球菌(enterococcusfaecalis)的發(fā)酵過程來制備具有高的光學(xué)純度的l型乳酸的方法[y.j.wee，j.n.kim，j.s.yun，h.w.ryu，enzymemicrob.technol.2004，35，568-573.]，還報(bào)道有通過使用牛鏈球菌148(streptococcusbovis148)的生淀粉的發(fā)酵過程來制備l型乳酸的方法[j.narita，s.nakahara，h.fukuda，a.kondo，j.biosci.bioeng.2004，97，423-425.]。另外，提出有不僅是使用細(xì)菌，而且還通過使用根霉菌(rhizopusspecies)中的米根霉(rhizopusoryzae)作為霉菌從葡萄糖中生產(chǎn)l型乳酸的方法。其通過調(diào)查營養(yǎng)成分對l型乳酸生產(chǎn)所帶來的效果，從而提出了用于大量生產(chǎn)l型乳酸所需的適當(dāng)?shù)臈l件。并且，還公開了開發(fā)纖維狀生物反應(yīng)器，并利用在棉塊兒上固定霉菌菌絲來進(jìn)行發(fā)酵的方法，并通過米根霉(rhizopusoryzae)來從葡萄糖和玉米淀粉中生產(chǎn)l型乳酸的方法[1)y.zhou，j.m.dominguez，n.cao，j.du，g.t.tsao，appl.biochem.biotechnol.1999，78，401-407；.2)a.tay，s.t.yang，biotechnol.bioeng.2002，80，1-12；3)y.kosakai，y.s.park，m.okabe，biotechnol.bioeng.1999，55，461-470]。最近，為了減少生產(chǎn)成本，開發(fā)了一種通過基因操作細(xì)菌來生產(chǎn)l-乳酸的方法，所述基因操作細(xì)菌為可利用價(jià)格便宜的甘油作為培養(yǎng)原料的細(xì)菌。[s.mazumdar，m.d.blankschien，j.m.clomburg，r.gonzalez，microb.cellfact.2013，12，1-7]。另外，報(bào)道有在鉛離子(二價(jià))催化劑的作用下，由自然中存在最多的生物質(zhì)-纖維素來合成乳酸的方法已獲得一部分成功的內(nèi)容[y.wang，w.deng，b.wang，q.zhang，x.wan，z.tang，y.wang，c.zhu，z.cao，g.wang，h.wan，naturecommun.，2013，7，doi:10.1038/ncomms3141]。
生物化學(xué)方法雖然有可以通過光學(xué)方法制備純的乳酸的優(yōu)點(diǎn)，但是反應(yīng)過程與化學(xué)方法相比較為復(fù)雜，并且還存在反應(yīng)時(shí)間長的問題。另外，使用的細(xì)菌或霉菌為厭氧性時(shí)，由于反應(yīng)過程對氧敏感，因此需要注意。并且，在反應(yīng)過程中，由于作為細(xì)菌的營養(yǎng)素而必需使用的酵母提取物或蛋白胨的價(jià)格昂貴，因此在經(jīng)濟(jì)方面存在局限性[a.w.schepers，j.thibault，c.lacroix，enzymemicrob.technol.2002，30，176-186.]。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為提供一種d型乳酸的制備工序，所述制備工序的反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)條件簡單，反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn)，并且可以以高的收率得到乳酸，而且能夠得到光學(xué)純度高的乳酸。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題為提供一種分析d-乳酸的含量的方法。
本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題為提供一種用于制備d型乳酸的酶。
技術(shù)方案
為了解決上述問題，本發(fā)明的特征為，在利用乙醛和氰化鹽來制備乳酸的反應(yīng)中，利用酶來使它們進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明中，所述酶的特征為，其可以使乙醛和氰化鹽進(jìn)行反應(yīng)而形成的乳腈的腈基進(jìn)行水解，即，所利用的酶為具有腈基水解能力的酶。
從理論上來說雖然不做限定，但是所述酶起到使乙醛和氰化鹽進(jìn)行反應(yīng)而生成的乳腈發(fā)生水解反應(yīng)的水解反應(yīng)催化劑的作用，并且所述氰化鹽可以為鈣、鈉或氫。
在本發(fā)明中，所述酶為具有腈基水解能力的酶，而且通過水解反應(yīng)，使得d-乳酸的生成量高于l-乳酸。
在本發(fā)明中，所述酶使得在生產(chǎn)的全部乳酸中的d-乳酸的比例優(yōu)選為60摩爾％以上，更優(yōu)選為65摩爾％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為70摩爾％以上，最優(yōu)選為80摩爾％以上。
在本發(fā)明中，所述酶可以為來源于微生物、植物或動(dòng)物的酶。術(shù)語酶不僅表示酶本身，還應(yīng)理解為其包括酶經(jīng)過表達(dá)的細(xì)胞、酶經(jīng)過表達(dá)的細(xì)胞的破碎物或由此純化分離得到的酶，以及其遺傳學(xué)上的處理物。作為一例，可以為通過重組dna技術(shù)，在大腸桿菌等的宿主中，利用生產(chǎn)酶的遺傳學(xué)上的生成物。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述酶可以通過對菌體的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離而獲得細(xì)胞體后，將細(xì)胞體破碎，然后通過離心分離來獲得上清液，然后對其進(jìn)行冷凍干燥而得到。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可以通過以下方法來獲得所述酶：利用反相色譜法對經(jīng)過提純的酶進(jìn)一步進(jìn)行提純，從而確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并基于該氨基酸序列來制備探針，然后從菌體的dna片段中克隆出編碼腈基水解酶的活性主體的dna。接著，通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)對其進(jìn)行擴(kuò)增來制備重組質(zhì)粒，并插入于大腸桿菌中，然后對該大腸桿菌等進(jìn)行培養(yǎng)，從而可以獲得所需的酶。
在本發(fā)明中，所述酶從yc6258(kccm43015)中提取，并且使用提取的酶，進(jìn)行了如下述反應(yīng)式1所示的乳腈(lactonitrile)的水解反應(yīng)，其中，所述yc6258為從鹽生植物糙葉薹草中分離的菌株?？梢栽谝惶靸?nèi)，以75％的分離收率來制備出d型異構(gòu)體的比例高的乳酸([α]26＝-1.14(在水中c＝1.0)，參考值：l型乳酸，[α]21-22＝+2.60(在水中c＝2.5))。
在本發(fā)明中，從辣椒溶桿菌(lysobactercapsici)yc5194t(kctc22007t＝dsm19286t)、martelellaendophyticayc6887t(kccm43011t＝nbrc109149t)或hoefleasuaedaeyc6898t(kacc14911t＝nbrc107700t)中提取所述其它酶。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度可以為25℃和40℃，優(yōu)選地，在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，新型酶在ph6、7、8下維持高的活性，優(yōu)選地，ph8時(shí)有利于乳酸的制備。
在本發(fā)明中，作為生成物的d型乳酸和l型乳酸具有化學(xué)式(1)的結(jié)構(gòu)，可以通過本反應(yīng)方法來調(diào)節(jié)d型乳酸和l型乳酸的比例，從而制備出生成物。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，通過使用透析膜，可以重復(fù)使用所述酶5次以上。
在一方面，本發(fā)明提供一種分析方法，所述分析方法是將包含d型乳酸和l型乳酸的乳酸混合物轉(zhuǎn)換成乳酸芐酯(benzyllactate)，并利用高效液相色譜儀(hplc)來進(jìn)行分析的。
在本發(fā)明中，根據(jù)如下述反應(yīng)式(2)來實(shí)施所述乳酸芐酯的合成。
在本發(fā)明中，d型乳酸芐酯和l型乳酸芐酯具有化學(xué)式(2)所示的結(jié)構(gòu)，并且通過使用手性柱的高效液相色譜儀(hplc)來分別計(jì)算d型乳酸芐酯和l型乳酸芐酯的面積比，并由此來計(jì)算出所制備的乳酸的光學(xué)純度。
有益效果
通過利用本發(fā)明的酶的乳酸的制備方法，可以在容易實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)條件下，通過簡單的反應(yīng)過程來制備d型異構(gòu)體為占優(yōu)勢的乳酸。
通過利用本發(fā)明的酶的乳酸的制備方法來調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間，從而能夠調(diào)節(jié)所制備的乳酸的d型異構(gòu)體和l型異構(gòu)體的比例。
通過本發(fā)明的酶的重復(fù)使用方法，在本反應(yīng)中，可以將酶重復(fù)使用最少5次以上，從而可以用低成本來制備乳酸。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中制備乳酸的流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.制備yc6258菌株和其它菌株的酶液的方法
在大量培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基(1g的蔗糖、2g的酵母提取物、5g的酪蛋白、4g的mgso4、2g/l的mgcl2)中，在28℃，120rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)新型菌株yc625872小時(shí)。以8000rpm對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離20分鐘，從而獲得細(xì)胞體，然后用ph6.5的50mm磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮。將懸浮液置于冰中，并在該狀態(tài)下進(jìn)行超聲波處理，從而將細(xì)胞破碎后，在12000rpm下進(jìn)行離心分離30分鐘，從而獲得上清液。對上清液進(jìn)行冷凍干燥處理，并在各反應(yīng)中使用。制備yc5194t、yc6887t、yc6898t的酶液的方法同上述的制備yc6258的方法。不同點(diǎn)在于，制備yc5194t、yc6887t、yc6898t時(shí)的培養(yǎng)基分別使用了50％的大豆肉湯(tryticsoybroth)、m10broth(10g的酵母提取物、4g的mgso4、2g的mgcl2、5g的nacl、1g的k2hpo4、10g/l的蔗糖)及海生菌肉湯(marinebroth)來進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例2.使用了新型酶的多種d型/l型比例的乳酸的制備
在100ml的圓底燒瓶中加入2.0m的氰化鉀水溶液(1.0當(dāng)量，50ml，ph8)，并加入新型酶yc6258(200-500mg)后，添加乙醛(100mmol)，并在常溫下攪拌。加入1當(dāng)量濃度的氯化氫溶液(2.5當(dāng)量)而使溶液酸化后，用異丙醚連續(xù)提取24小時(shí)后，去除有機(jī)溶劑，從而獲得液體生成物。根據(jù)圖1所示的[反應(yīng)式3]制備了乳酸。
為了確認(rèn)制備的乳酸的光學(xué)純度，進(jìn)行了[反應(yīng)式2]所示的乳酸芐酯的合成反應(yīng)。在4ml的玻璃瓶中加入制得的乳酸(1.0mmol)和甲醇(0.5ml)，并滴加1,8-二氮雜雙環(huán)十一碳-7-烯(1,8-diazabicycloundec-7-ene；dbu)(1.0當(dāng)量)后，在常溫下攪拌30分鐘。之后去除甲醇，并加入二甲基甲酰胺(dimethylformamide；dmf)(0.5ml)，然后滴加氯化芐(1當(dāng)量)后，在常溫下攪拌24小時(shí)。去除有機(jī)溶劑，然后用乙酸乙酯提取并濃縮后，利用乙酸乙酯和己烷(1:4體積比)，并通過柱色譜法來獲得液體生成物(134mg，74％收率)。使用高效液相色譜儀(hplc)來測定合成的乳酸芐酯的光學(xué)純度(分析條件；柱：chiralcel-od，展開溶劑：己烷/異丙醇＝98/2，流速＝1.0ml/分鐘，uv＝217nm，滯留時(shí)間：16.2分鐘(l型乳酸芐酯)，17.5分鐘(d型乳酸芐酯))。結(jié)果如下述表1中所示。
表1
本發(fā)明中的乳酸轉(zhuǎn)換率是通過由核磁共振(nmr)來測定的反應(yīng)物中所生成的乳腈與乳酸的面積比來計(jì)算得到的。分離收率是通過以下方式計(jì)算得到的。測定通過連續(xù)提取來提純后所得到的乳酸的重量，并根據(jù)所使用的乙醛的量的生成物的理論上的獲得量來計(jì)算出。
制得的乳酸的d型/l型乳酸的比例是通過以下方式計(jì)算得到的。將乳酸轉(zhuǎn)換成乳酸芐酯后，使用高效液相色譜儀來測定d型乳酸芐酯和l型乳酸芐酯的面積比，并通過考慮乳酸轉(zhuǎn)換率來計(jì)算得到。乳酸的光學(xué)純度是通過數(shù)學(xué)式((d型乳酸芐酯面積比-l型乳酸芐酯面積比)/(d型乳酸芐酯面積比+l型乳酸芐酯面積比)×100)來計(jì)算得到的。
通過改變使用的新型酶的量和反應(yīng)時(shí)間來測定生成的乳酸的光學(xué)純度。其結(jié)果為，乳酸轉(zhuǎn)換率越低，顯示出的生成的乳酸的光學(xué)純度越高。通過本方法，可以以41％的分離收率來生成最高具有84％的光學(xué)純度的d型乳酸，并且可以以最高75％的分離收率來生成具有40％的光學(xué)純度的d型乳酸。
在使用氰化鈉來代替氰化鉀時(shí)，在相同的反應(yīng)條件下，也以73％的分離收率生成了具有39％的光學(xué)純度的d-乳酸。
實(shí)施例3.使用了多種新型酶的乳酸的制備
在100ml的圓底燒瓶中加入2.0m的氰化鉀水溶液(1.0當(dāng)量，50ml，ph8)，并加入新型酶(500mg)后，添加乙醛(100mmol)，并在常溫下攪拌3小時(shí)。加入1當(dāng)量濃度的氯化氫溶液(2.5當(dāng)量)而使溶液酸化后，用異丙醚連續(xù)提取24小時(shí)后，去除有機(jī)溶劑，從而獲得液體生成物。結(jié)果如下述表2中所示。
表2
使用從多種菌株中提取的新型酶來進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果為，多種新型酶對本反應(yīng)的反應(yīng)性類似。通過進(jìn)行3小時(shí)的反應(yīng)，以51-57％的轉(zhuǎn)換率生成乳酸，并且對所生成的乳酸測定光學(xué)純度的結(jié)果為，顯示出了64-68％，并且生成了整體上d型異構(gòu)體占優(yōu)勢的乳酸。
實(shí)施例4.使用了透析膜的新型酶的重復(fù)使用
將新型酶(500mg)溶于蒸餾水(5ml)中后，將其加入到截留分子量(molecularweightcut-off)為10,000的透析膜中而制成“酶膜”后，裝進(jìn)100ml的燒杯中，并加入2.0m的氰化鉀水溶液(1.0當(dāng)量，45ml，ph8)和乙醛(100mmol)，并在常溫下攪拌24小時(shí)。加入1當(dāng)量濃度的氯化氫溶液(2.5當(dāng)量)而使溶液酸化后，用異丙醚連續(xù)提取24小時(shí)后，去除有機(jī)溶劑，從而獲得液體生成物。結(jié)果如下述表3中所示。
表3
用新型酶制備酶膜并重復(fù)使用的結(jié)果為，確認(rèn)了酶最少可重復(fù)使用5次以上。并且確認(rèn)到，還一定地維持了反應(yīng)的乳酸的轉(zhuǎn)換率和收率，并且還維持了所生成的乳酸的光學(xué)純度。
本發(fā)明并不限定于上述特定的實(shí)施例，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在不超出本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)，可對本發(fā)明進(jìn)行多種變形的實(shí)施例。因此，本發(fā)明的范圍并不局限于上述實(shí)施例，并且不僅通過后述的權(quán)利要求保護(hù)范圍而決定，而且應(yīng)由與該權(quán)利要求保護(hù)范圍等同的內(nèi)容所決定。