本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種核酸分子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：深部真菌感染(deepfungalinfection，dfi)是一種嚴(yán)重的感染性疾病，它是指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟，感染器官所引起的真菌性感染疾病。其中，白念珠菌是人類深部真菌感染最常見(jiàn)的病原菌之一。近年來(lái)，由于廣譜抗生素的長(zhǎng)期濫用、內(nèi)置醫(yī)療器械和器官移植等侵入性操作不斷增加，使白念珠菌感染的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，盡管研發(fā)了許多抗真菌藥物，但由于嚴(yán)重的毒副作用，以及真菌耐藥株不斷增加，使dfi的治療成為臨床面臨的棘手難題。高遷移率族蛋白b1(highmobilitygroupbox1，hmgb1)是一種含量豐富的非組蛋白結(jié)合蛋白，分子量約30kd。在1999年，wang等發(fā)現(xiàn)hmgb1可通過(guò)活化巨噬細(xì)胞，從胞內(nèi)主動(dòng)分泌釋放到胞外，不斷介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，是膿毒癥晚期炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。課題組前期的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)hmgb1在白念珠菌性膿毒癥中也發(fā)揮著重要作用，但其生物學(xué)機(jī)制尚不明確。microrna(mirnas)是一種高度保守的長(zhǎng)鏈非編碼小核糖核酸，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默或抑制靶基因的表達(dá)。目前已證實(shí)大量的mirnas作為一種新型的炎性反應(yīng)調(diào)控分子，對(duì)膿毒癥中多種炎癥因子的表達(dá)及釋放具有重要的調(diào)控。作用為膿毒癥晚期重要的炎性細(xì)胞因子hmgb1，其表達(dá)及釋放必然會(huì)受到相關(guān)mirnas調(diào)控。目前，大量mirnas對(duì)hmgb1調(diào)控作用的研究集中在細(xì)菌性膿毒癥方面，而在白念珠菌性膿毒癥中，尚缺乏研究。因此，研究白念珠菌性膿毒癥中調(diào)控hmgb1的mirnas具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種核酸分子的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，分析mirnas的表達(dá)譜變化，獲得調(diào)控hmgb1的mirnas，以探討mirnas在白念珠菌感染時(shí)對(duì)hmgb1的調(diào)控作用，為白念珠菌感染的治療提供新思路。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明將白念珠菌刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后，用mirna基因芯片篩選出222個(gè)差異表達(dá)的mirnas，在21個(gè)差異表達(dá)顯著的mirnas中(fc≥1.5，p＜0.05)，最終選擇mmu-mir-146b-5p進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：有6個(gè)mirnas生物信息學(xué)軟件(mirwalk、microt4、mirmap、mirnamap、pita和rna22)預(yù)測(cè)到hmgb1是mmu-mir-146b-5p的直接作用靶點(diǎn)之一。生物信息學(xué)網(wǎng)站mirbase發(fā)現(xiàn)mmu-mir-146b-5p(ugagaacugaauuccauaggcu)和hsa-mir-146b-5p序列完全一致，具有臨床研究的價(jià)值。另外，在白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后，mirnas基因芯片和qrt-pcr均顯示mmu-mir-146b-5p變化顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子，所述核酸分子具有：(ⅰ)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(ⅳ)與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)是在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而反應(yīng)中沒(méi)有交叉干擾。并且由于有超強(qiáng)的光信號(hào)和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于mirnas靶基因驗(yàn)證，可以精確靈敏地檢測(cè)出mirnas是否直接作用于靶基因。由于mirnas與靶基因的3'-utr區(qū)特異性結(jié)合，與靶基因完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)，形成沉默復(fù)合體或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)靶基因的表達(dá)起重要的負(fù)調(diào)控作用，最終導(dǎo)致與靶基因相關(guān)聯(lián)的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性降低。本發(fā)明用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出mmu-mir-146b-5p與靶基因hmgb13'-utr區(qū)特異的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含雙熒光素酶的wt-hmgb13'-utr區(qū)表達(dá)載體；并將hmgb13'-utr區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建mut-hmgb13'-utr區(qū)突變載體作為陰性對(duì)照。將空載體、wt-hmgb13'-utr表達(dá)載體和mut-hmgb13'-utr區(qū)突變載體分別與mmu-mir-146b-5p模擬物(mimic)和mimicnc共培養(yǎng)于293t細(xì)胞，結(jié)果顯示mmu-mir-146b-5p與wt-hmgb13'-utr區(qū)表達(dá)載體共培養(yǎng)組，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性較對(duì)照組明顯降低，表明mmu-mir-146b-5p能與hmgb13'-utr區(qū)特異性結(jié)合，并抑制hmgb1的表達(dá)，提示hmgb1是mmu-mir-146b-5p的直接作用靶點(diǎn)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子，所述核酸分子具有：(ⅰ)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(ⅳ)與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。hmgb1是一種含量豐富的非組蛋白核蛋白，分子量約30kd，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率快而得名。其普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，參與dna的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修飾，修復(fù)受損傷的dna以及調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性等作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，hmgb1作為一種晚期炎性細(xì)胞因子，在膿毒癥、膿毒性休克和多器官損傷中發(fā)揮重要作用。在細(xì)菌性膿毒癥中，內(nèi)毒素和tnf-α、il-1β和il-6等多種促炎因子激活單核/巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞后，hmgb1由細(xì)胞核分泌主動(dòng)到細(xì)胞外。同時(shí)，炎癥反應(yīng)促使多種細(xì)胞凋亡和壞死，使細(xì)胞胞膜完整性被破壞，導(dǎo)致胞核內(nèi)hmgb1被動(dòng)釋放至胞外，加重炎性反應(yīng)。由主動(dòng)和被動(dòng)方式釋放到細(xì)胞外的hmgb1，可進(jìn)一步誘導(dǎo)活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，激活下游的炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大；并且，hmgb1本身具有內(nèi)毒素樣致死效應(yīng)。因此，hmgb1是膿毒癥促炎性細(xì)胞因子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。dfi是一種由致病性真菌引起的膿毒癥。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)伴白念珠菌感染的嚴(yán)度膿毒癥患者外周血中hmgb1mrna和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于一般膿毒癥患者；侵襲性白念珠菌感染小鼠外周血、肝、肺和腎中hmgb1mrna和蛋白的表達(dá)水平亦顯著高于正常小鼠，表明hmgb1在白念珠菌感染所引起的膿毒癥中也具有重要作用。本發(fā)明采用白念珠菌刺激mmu-mir-146-5p轉(zhuǎn)染后的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞36h，qrt-pcr顯示mmu-mir-146b-5p轉(zhuǎn)染效果良好；qrt-pcr、westernblot和elisa結(jié)果顯示白念珠菌刺激36h后，巨噬細(xì)胞及上清中hmgb1mrna和蛋白的表達(dá)水平較normal組明顯增加；mmu-mir-146b-5pmimic組細(xì)胞及上清中mrna和蛋白的表達(dá)水平較mimicnc組明顯降低；mmu-mir-146b-5pinhibitor組結(jié)果與mmu-mir-146b-5pmimic組相反，表明mmu-mir-146b-5p能有效負(fù)調(diào)控白念珠菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞及上清中hmgb1mrna和蛋白的表達(dá)水平。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子，所述核酸分子具有：(ⅰ)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(ⅳ)與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。hmgb1不同于其它核蛋白，它與dna親和力較低，可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)核孔穿梭在細(xì)胞核與細(xì)胞漿之間。hmgb1通常靜息于細(xì)胞核中，lps、炎性細(xì)胞因子和胞外的hmgb1刺激單核/巨噬細(xì)胞后，乙?；饔煤吞禺愋苑置诘娜苊阁w使hmgb1主動(dòng)由細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)，隨后通過(guò)囊泡介導(dǎo)的方式分泌到細(xì)胞外，發(fā)揮炎性細(xì)胞因子的作用。因此，hmgb1由細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞外的過(guò)程，是其發(fā)揮促炎反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明采用白念珠菌刺激mirnas轉(zhuǎn)染的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，westernblot結(jié)果顯示，在刺激前巨噬細(xì)胞胞漿中hmgb1蛋白含量較少，胞核中hmgb1蛋白含量較多；白念珠菌刺激36h后，胞漿中hmgb1蛋白含量顯著增多，胞核內(nèi)hmgb1蛋白含量減少；mmu-mir-146b-5pmimic組中胞漿hmgb1蛋白水平顯著低于mimicnc組，胞核內(nèi)hmgb1蛋白含量明顯高于mimicnc組；mmu-mir-146b-5pinhibitor組中胞漿hmgb1蛋白含量明顯高于inhibitornc組，胞核hmgb1蛋白含量明顯低于inhibitornc組，實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)，mmu-mir-146b-5p對(duì)細(xì)胞中hmgb1蛋白由胞核到胞漿的轉(zhuǎn)位具有重要的負(fù)調(diào)控作用。激光共聚焦顯微鏡從形體學(xué)觀察到白念珠菌刺激前，綠色熒光主要集中在細(xì)胞核中，胞漿含量較少；白念珠菌刺激36h后，細(xì)胞漿與細(xì)胞核中均可見(jiàn)強(qiáng)綠色熒光；mmu-mir-146b-5pmimic組綠色熒光主要集中在胞核中，胞漿內(nèi)綠色熒光明顯弱于mimicnc組；mmu-mir-146b-5pinhibitor組結(jié)果與mmu-mir-146b-5pmimic組相反。westernblot與激光共聚焦結(jié)果一致，以上結(jié)果均提示mmu-mir-146b-5p能有效負(fù)調(diào)控白念珠菌誘導(dǎo)的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)hmgb1蛋白由胞核到胞漿的轉(zhuǎn)位，從而抑制hmgb1分泌到細(xì)胞外發(fā)揮炎性細(xì)胞因子的作用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子，所述核酸分子具有：(ⅰ)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(ⅳ)與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。本發(fā)明還提供了一種核酸分子在制備白念珠菌感染的治療藥物中的應(yīng)用，所述核酸分子具有：(ⅰ)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(ⅳ)與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子選自rna、dna或核酸類似物分子。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)或(ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述核酸分子具有與(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。綜上所述，本發(fā)明初步驗(yàn)證了白念珠菌感染時(shí)mmu-mir-146b-5的表達(dá)水平明顯下調(diào)；mmu-mir-146b-5可直接調(diào)控靶基因hmgb1，并且有效抑制hmgb1的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)位情況，表明mmu-mir-146b-5對(duì)hmgb1的負(fù)調(diào)控作用為研究白念珠菌感染機(jī)制提供新的思路，為白念珠菌感染的治療提供新的靶點(diǎn)。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示mmu-mir-146b-5p在hmgb13'-utr區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)；圖2示hmgb13'-utr表達(dá)載體及突變載體測(cè)序結(jié)果；其中，圖2(a)示wt-hmgb13'-utr；圖2(b)示mut-hmgb13'-utr；圖3示mmu-mir-146b-5p對(duì)hmgb13'-utr熒光素酶報(bào)告基因活性影響；圖4示mmu-mir-146b-5p表達(dá)水平；圖5示小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中hmgb1mrna的表達(dá)水平；圖6示小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中hmgb1總蛋白表達(dá)水平；圖7示小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞上清中hmgb1含量；圖8示小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞胞漿胞核內(nèi)hmgb1蛋白的表達(dá)水平；圖9示小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)hmgb1激光共聚焦。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種核酸分子的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用軟件spss17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析評(píng)估數(shù)據(jù)間的差異，再進(jìn)行newman-keuls檢驗(yàn)，p＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明提供的核酸分子的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。表1實(shí)驗(yàn)主要試劑dna回收試劑盒天根生化科技有限公司fitc標(biāo)記二抗杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司lipofectamine3000美國(guó)invitrogen公司oligorna序列美國(guó)invitrogen公司pfudnapolymerase美國(guó)賽默飛公司qrt-pcr反應(yīng)試劑盒北京百泰克公司t4dna連接酶美國(guó)賽默飛公司top10感受態(tài)細(xì)胞北京康為世紀(jì)科技有限公司核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒江蘇凱基生物技術(shù)有限公司抗hmgb1兔多克隆抗體美國(guó)abcam公司雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒美國(guó)promega公司質(zhì)粒提取試劑盒美國(guó)axygen公司重組人高遷移率族蛋白b1美國(guó)novoprotein公司表2實(shí)驗(yàn)主要儀器沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：用雙蒸水200ml溶解沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基干粉12.4g，121℃高壓蒸汽中滅菌15min。4％多聚甲醛：稱取4g多聚甲醛粉末，加入60mlph7.4的pbs液中，混勻，加熱至60～80℃，溶解冷卻，雙蒸水定容至100ml，調(diào)ph值至7.2～7.4。0.1％triton-x100：取100μltriton-x100加入100mlpbs液，混勻，4℃保存。pbst：吸取500μltween20加至1000mlpbs液，混勻，4℃保存。包被液：秤取1.59gnaco3和2.93gnahco3，雙蒸水定容至1000ml，混勻，4℃保存。下面結(jié)合實(shí)施案例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1mmu-mir-146b-5p直接調(diào)控靶基因hmgb1①生物信息學(xué)預(yù)測(cè)mmu-mir-146b-5p與hmgb13'-utr區(qū)結(jié)合位點(diǎn)：根據(jù)生物信息學(xué)軟件mirwalk、diana-microt、miranda、mirsystem、mirdb、mirmap、mirnasmap、pictar、pita、rna22、rnahybrid和targetscan預(yù)測(cè)與hmgb1基因的3'-utr區(qū)作用的mirnas。②質(zhì)粒構(gòu)建目的基因hmgb13'-utr區(qū)序列：通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi，取得含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)(gttctc，1327-1332位核苷酸)的小鼠hmgb13'-utr區(qū)序列，合成cdna為模板，命名為wt-hmgb13'-utr，序列如seqidno.13所示。點(diǎn)突變hmgb13'-utr區(qū)序列：將mmu-mir-146b-5p預(yù)測(cè)的靶基因hmgb13'-utr區(qū)結(jié)合位點(diǎn)(gttctc，1327-1332位核苷酸)進(jìn)行點(diǎn)突變(gtagac)，命名為mut-hmgb13'-utr，突變序列如seqidno.14所示。酶切：純化后產(chǎn)物和載體用限制性內(nèi)切酶sacι和sa1ι進(jìn)行酶切，37℃孵育2h。反應(yīng)體系如下：載體與目的片段的連接：(1)反應(yīng)體系：(2)反應(yīng)條件：16℃反應(yīng)30min。轉(zhuǎn)化：(1)將需轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物加至含top10感受態(tài)細(xì)胞中(100μl感受態(tài)細(xì)胞需要50ngdna)，混勻，冰浴30min；(2)42℃循環(huán)水中，熱激90s，快速移至冰浴3min；(3)每管加200μlsoc液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)(37℃、220rpm和45min)；(4)將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)至lb培養(yǎng)基上(含amp)；(5)倒置平板，37℃孵箱中培養(yǎng)15h。抽提質(zhì)粒(1)挑取4個(gè)單獨(dú)菌落，置于含5μlamp的lb培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)20h；(2)取1.5ml菌液(od值為2～4)，4500rpm離心90s，收集約3ml沉淀；(3)取250μl懸浮液加入3ml細(xì)菌沉淀液，吹打混勻；(4)加入250μl裂解液，顛倒混勻；(5)加入350μl結(jié)合液，顛倒混勻；(6)于室溫，14000g離心10min，收集上清；(7)加入750μl洗滌液，于室溫，14000g離心1min，去上清，收集沉淀；(8)加入50μl洗脫液，靜置2min；(9)于室溫，14000g離心1min，去上清，收集沉淀。測(cè)序鑒定：將質(zhì)粒送到上海英濰捷基有限公司測(cè)序。③雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前24h，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293t細(xì)胞接種于48孔板，培養(yǎng)于37℃，5％co2孵箱中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在70～80％；(2)將1μllipofectakmine3000稀釋到25μlopti-mem中，0.2μg質(zhì)粒稀釋到25μlopti-mem中，7.5pmolmmu-mir146b-5mimic或normal稀釋到25μlopti-mem中，分別室溫靜置5min，再將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑、oligorna和質(zhì)?；靹蚝螅覝仂o置20min；(3)每孔去除50μl培養(yǎng)基，加入已制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物50μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃中孵育6h；(4)換200μl新鮮培養(yǎng)基至每孔，37℃中孵育48h。熒光素酶檢測(cè)(1)每孔加細(xì)胞裂解液200μl，室溫靜置10min；(2)于4℃，10000g離心5min，取裂解上清；(3)96孔發(fā)光板中加入20μl裂解上清，再加100μl螢火蟲(chóng)熒光素酶工作液，混勻，上機(jī)檢測(cè)發(fā)光值；(4)加海腎熒光素酶工作液100μl，混勻，上機(jī)檢測(cè)發(fā)光值。結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件mirwalk、microt4、mirmap、mirnamap、pita和rna22分析顯示，hmgb1基因的3'-utr區(qū)1327-1332位核苷酸與mmu-mir-146b-5p種子區(qū)的6個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)(圖1)。hmgb13'-utr區(qū)表達(dá)載體及突變載體測(cè)序：由于dna雙鏈?zhǔn)歉鶕?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則而形成(a＝t，c＝g)，測(cè)序結(jié)果可顯示為合成序列的互補(bǔ)序列。構(gòu)建含hmgb1預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)(gttctc)3'-utr區(qū)的wt-hmgb13'-utr表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果為結(jié)合位點(diǎn)(gttctc)的互補(bǔ)序列(gagaac)(圖2a)；將hmgb13'-utr區(qū)結(jié)合位點(diǎn)(gttctc)點(diǎn)突變?yōu)?gtagac)，構(gòu)建mut-hmgb13'-utr區(qū)突變載體，測(cè)序結(jié)果為突變序列(gtagac)的互補(bǔ)序列(gtctac)(圖2b)。雙熒光素酶報(bào)告基因：qrt-pcr結(jié)果顯示，在empty(mimicnc，mmu-mir-146b-5pmimic)、wt-hmgb13'-utr(mimicnc，mmu-mir-146b-5pmimic)和mut-hmgb13'-utr(mimicnc，mmu-mir-146b-5pmimic)組中熒光素酶信號(hào)值分別為：(1.00±0.056，0.97±0.086)、(0.98±0.098，0.59±0.073)和(0.99±0.096，0.98±0.043)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，mmu-mir-146b-5pmimic使wt-hmgb13'-utr型質(zhì)?；钚韵陆导s40％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pmimic對(duì)mut-hmgb13'-utr型質(zhì)粒的活性無(wú)明顯改變(圖3)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mmu-mir-146b-5p可直接調(diào)控靶基因hmgb1。實(shí)施例2mmu-mir-146b-5p抑制靶基因hmgb1的表達(dá)水平①mmu-mir-146b-5p的轉(zhuǎn)染配制oligorna:oligorna序列均購(gòu)于上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司，序列如表3所示：表3細(xì)胞處理及分組:白念珠菌刺激轉(zhuǎn)染mimicnc、mmu-mir-146b-5pmimic、inhibitornc和mmu-mir-146b-5pinhibitor的巨噬細(xì)胞36h，分成normal、c.albicans、mimicnc、mmu-mir-146b-5pmimic、inhibitornc和mmu-mir-146b-5pinhibitor組，收集樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。mmu-mir-146b-5p的轉(zhuǎn)染:(1)將提取的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞按3×106/孔接種于6孔板，每孔加2ml完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)孵育12h；(2)轉(zhuǎn)染前，pbs液洗2遍，加opti-mem1ml/孔；(3)試劑a配制：超凈臺(tái)中，取15μllipofectamine3000加入125μlopti-mem中，混勻后靜置5min；(4)試劑b配制：取38μloligorna(濃度為20pmol/μl)，加至opti-mem125μl中，混勻后靜置5min(避光)；(5)將試劑a與試劑b混勻，室溫靜置5min(避光)；(6)將上一步所得試劑分別加至含1mlopti-mem的巨噬細(xì)胞中，混勻，放入培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)孵育6h(避光)；(7)棄上清，加入2ml完全培養(yǎng)基孵育36h；(8)白念珠菌刺激36h，收集樣本并用qrt-pcr驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。mmu-mir-146b-5p抑制靶基因hmgb1mrna的表達(dá)水平qrt-pcr分析hmgb1序列如seqidno.15所示。引物設(shè)計(jì)：mmu-mir-146b-5p引物及內(nèi)參照u6序列詳見(jiàn)表4，小鼠引物hmgb1和內(nèi)參照gadph，由華大基因公司設(shè)計(jì)合成，序列如表5所示：表4表5逆轉(zhuǎn)錄cdna(1)取2μl隨機(jī)引物、1μl總rna加入9μl雙蒸水中，混勻，70℃水浴箱溫育10min，冰浴2min；(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：30℃10min42℃1h70℃15minqrt-pcr(1)反應(yīng)體系(2)反應(yīng)條件③mmu-mir-146b-5p抑制靶基因hmgb1總蛋白的表達(dá)水平westernblot蛋白印跡分析細(xì)胞總蛋白提?。合占?xì)胞樣本；取1.5μl100mmpmsf加入150μlripa裂解液中，配制成終濃度為1mm的裂解液，充分裂解細(xì)胞，4℃14,000rpm離心15min取上清為總蛋白；-80℃保存。westernblot實(shí)驗(yàn)步驟(1)配下層膠：配制12％sds-page分離膠(8ml)：混勻后立即灌入玻璃板夾層(預(yù)留上層膠所需空間)，加1ml異丙醇，室溫垂直靜置30min；(2)配上層膠：傾出異丙醇，濾紙吸凈殘液，配制sds-page上層膠(3ml)：混勻后迅速灌入上層膠，插入梳子，室溫垂直靜置30min；上層膠凝固后取出梳子，用電泳裝置固定凝膠，取適量tris-甘氨酸電泳緩沖液加至上，內(nèi)，外槽；(3)上樣：每孔加樣品20μl(蛋白量總為30μg)，5μl預(yù)染蛋白做參照；(4)跑膠：電泳儀起始電壓為80v，當(dāng)染料分離至下層膠后，電壓調(diào)整為120v，以預(yù)染蛋白為參照，蛋白分子充分分開(kāi)即可終止；(5)轉(zhuǎn)膜：取出凝膠，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白分子量大小切膠；剪下pvdf膜及濾紙，將pvdf膜浸泡于甲醇中，同濾紙一起置于電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min；將泡沫、三張濾紙、凝膠、pvdf膜、三張濾紙和泡沫從負(fù)極到正極疊于塑料支架之間，置于充滿電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽中，恒流電泳35min(4℃，360ma)；(6)封閉：將pvdf膜放入含有5％bsa的tbst緩沖液，室溫緩慢搖動(dòng)2h；(7)孵一抗：將pvdf膜轉(zhuǎn)移至一抗工作液，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜；(8)孵二抗：用tbst緩沖液洗滌pvdf膜(10min×3次)，放入二抗工作液中，室溫緩慢搖動(dòng)1h；取出pvdf膜，用tbst緩沖液洗滌(10min×3次)；(9)ecl顯影：新鮮配制ecl顯色劑，顯色成像。④elisa間接法檢測(cè)上清中hmgb1表達(dá)(1)用無(wú)菌雙蒸水稀釋重組人hmgb1蛋白至100μg/ml，5μl/管分裝并保存于-70℃；(2)用497μl包被液稀釋5μl重組人hmgb1蛋白(濃度為1μg/ml)，每次取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品250μl加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液250μl，混勻并配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度梯度依次為0ng/ml、15.625ng/ml、31.25ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1μg/ml；(3)用框架固定酶標(biāo)包被板，100μl包被液加入空白孔，分別取100μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本(未稀釋)加入其余各孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次，濕盒4℃過(guò)夜；(4)去包被液，pbst液清洗(1min×3次)；(5)取200μl含3％bsa的pbst液加入每孔，37℃孵育2h；(6)棄廢液，pbst液清洗(1min×3次)；(7)用pbst液稀釋hmgb1抗體(1∶1500)，取100μl含hmgb1抗體的工作液加入每孔，37℃孵育2h；(8)棄廢液，pbst液清洗(1min×3次)；(9)用pbst液稀釋二抗(1∶10000)，取100μl二抗工作液加入每孔，37℃孵育1h；(10)棄廢液，pbst液清洗(1min×3次)；(11)取100μltmb液加入每孔，室溫靜置10～20min(避光)；(12)取100μl終止液加入每孔，在5min內(nèi)，用酶標(biāo)儀的a450波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度；(13)根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品od值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞上清中hmgb1濃度。結(jié)果驗(yàn)證mmu-mir-146b-5p轉(zhuǎn)染效率：qrt-pcr結(jié)果顯示，normal、c.albicans、mimicnc、mmu-mir-146b-5pmimic、inhibitornc和mmu-mir-146b-5pinhibitor組中mmu-mir-146b-5p表達(dá)水平分別為：1.00±0.048、0.75±0.057、0.78±0.069、66.54±5.32、0.73±0.058和0.59±0.61。c.albicans組細(xì)胞中mmu-mir-146b-5p的表達(dá)水平較normal組明顯降低(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pmimic組mmu-mir-146b-5p表達(dá)水平較mimicnc組顯著增加(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pinhibitor表達(dá)水平較inhibitornc組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)表明mmu-mir-146b-5pmimic和inhibitor轉(zhuǎn)染效果良好，表達(dá)效果顯著(圖4)。mmu-mir-146b-5p負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞中hmgb1mrna的表達(dá)水平：qrt-pcr結(jié)果顯示，normal、c.albicans、mimicnc、mmu-mir-146b-5pmimic、inhibitornc和mmu-mir-146b-5pinhibitor組細(xì)胞中hmgb1mrna表達(dá)水平分別為：1.00±0.059、1.5±0.051、1.58±0.12、1.25±0.068、1.54±0.047和1.77±0.11。c.albicans組細(xì)胞中hmgb1mrna水平較normal組顯著增加(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pmimic組hmgb1mrna水平較mimicnc組明顯減低(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pinhibitor組較inhibitornc組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌感染后，mmu-mir-146b-5p可有效負(fù)調(diào)控小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中hmgb1mrna的表達(dá)水平(圖5)。mmu-mir-146b-5p可負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞中hmgb1總蛋白的表達(dá)水平westernblot結(jié)果顯示，c.albicans組細(xì)胞中hmgb1總蛋白表達(dá)水平較normal組明顯增加；mmu-mir-146b-5pmimic組總蛋白表達(dá)水平較mimicnc組明顯降低；mmu-mir-146b-5pinhibitor組總蛋白表達(dá)水平較inhibitornc組明顯增加，實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌感染后，mmu-mir-146b-5p可有效負(fù)調(diào)控小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中hmgb1總蛋白的表達(dá)水平(圖6)。mmu-mir-146b-5p可負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞上清中hmgb1的含量：elisa結(jié)果顯示，normal、c.albicans、mimicnc、mmu-mir-146b-5pmimic、inhibitornc和mmu-mir-146b-5pinhibitor組上清中hmgb1的表達(dá)水平分別為：14.98±1.63、154.56±5.95、160.52±7.75、100.92±4.13、143.63±7.08和180.71±12.69。c.albicans組上清中hmgb1含量較normal組顯著增加(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pmimic轉(zhuǎn)染組上清中hmgb1含量較mimicnc組明顯降低(p＜0.05)；mmu-mir-146b-5pinhibitor組上清中hmgb1含量較inhibitornc組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌感染后，mmu-mir-146b-5p可有效負(fù)調(diào)控小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞上清中hmgb1蛋白的表達(dá)水平(圖7)。實(shí)施例3mmu-mir-146b-5p可抑制巨噬細(xì)胞中hmgb1的轉(zhuǎn)位細(xì)胞胞漿蛋白與胞核蛋白提取：按照江蘇凱基胞漿與胞核蛋白提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，采用bca法進(jìn)行蛋白定量，分裝并保存于-80℃。westernblot實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例2。細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡：(1)將巨噬細(xì)胞按5×105/孔接種于含有玻片的24孔板中，加1ml完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中孵育12h；(2)將oligorna轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中培育36h，滅活白念珠菌刺激36h；(3)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用pbs液洗滌(1min×3次)；(4)加1ml4％多聚甲醛入每孔，室溫固定30min；(5)pbs液洗滌(1min×3次)；(6)加500μl0.3％tritonx-100入每孔，室溫破膜15min；(7)pbs液洗滌(1min×3次)；(8)加山羊封閉血清500μl/孔，封閉90min；(9)回收封閉液，勿洗，加入200μl一抗入每孔(hmgb1，1∶1000；nf-κb，1∶30)，濕盒4℃過(guò)夜；(10)回收一抗，pbs液洗滌(1min×3次)；(11)加入200μl綠色熒光二抗入每孔(1∶100，dylight488標(biāo)記)，常溫下孵育1h(一抗為hmgb1)；濕盒4℃過(guò)夜(一抗為nf-κb)；(12)回收二抗，pbs液洗滌(1min×3次)；(13)加200μldapi入每孔(1∶40000)，室溫孵育15min；(14)pbs液洗滌(1min×3次)；(15)用防熒光淬滅的封片劑封片；(16)用激光共聚焦顯微鏡觀察成像。結(jié)果：巨噬細(xì)胞胞漿胞核hmgb1蛋白的表達(dá)水平：westernblot結(jié)果顯示，在刺激前巨噬細(xì)胞胞漿中hmgb1蛋白含量較少，胞核中hmgb1蛋白含量較多；白念珠菌刺激36h后，胞漿中hmgb1蛋白含量顯著增多，胞核內(nèi)hmgb1蛋白含量減少；mmu-mir-146b-5pmimic組中胞漿hmgb1蛋白水平顯著低于mimicnc組，胞核內(nèi)hmgb1蛋白含量明顯高于mimicnc組；mmu-mir-146b-5pinhibitor組中胞漿hmgb1蛋白含量明顯高于inhibitornc組，胞核hmgb1蛋白含量明顯低于inhibitornc組，實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)，mmu-mir-146b-5p對(duì)細(xì)胞中hmgb1蛋白由胞核到胞漿的轉(zhuǎn)位具有重要的負(fù)調(diào)控作用(圖8)。巨噬細(xì)胞胞內(nèi)hmgb1的活性及分布：激光共聚焦結(jié)果顯示，刺激前hmgb1熒光主要位于胞核，呈強(qiáng)綠色熒光，胞漿表達(dá)不顯著；白念珠菌刺激36h后，胞核與胞漿中均可見(jiàn)強(qiáng)綠色熒光；mmu-mir-146b-5pmimic組中胞核hmgb1綠色熒光明顯高于mimicnc組，胞漿綠色熒光顯著低于mimicnc組；mmu-mir-146b-5pinhibitor組中胞核綠色熒光顯著低于inhibitornc組，胞漿中綠色熒光明顯高于inhibitornc組，實(shí)驗(yàn)表明，白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后，mmu-mir-146b-5p對(duì)細(xì)胞中hmgb1蛋白由胞核到胞漿的轉(zhuǎn)位具有重要的負(fù)調(diào)控作用(圖9)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院<120>一種核酸分子的應(yīng)用<130>mp1710844<160>17<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>rna<213>mmu-mir-146b-5pmimic<400>1ugagaacugaauuccauaggcu22<210>2<211>22<212>rna<213>mmu-mir-146b-5pmimic<400>2ccuauggaauucaguucucauu22<210>3<211>22<212>rna<213>mmu-mir-146b-5p<400>3agccuauggaauucaguucuca22<210>4<211>21<212>dna<213>mimicnc<400>4uucuccgaacgugucacgutt21<210>5<211>21<212>dna<213>mimicnc<400>5acgugacacguucggagaatt21<210>6<211>23<212>rna<213>inhibitornc<400>6ucauucguacaugucuaacgcca23<210>7<211>20<212>dna<213>mmu-mir-146b-5p正向引物<400>7gcggtgagaactgaattcca20<210>8<211>21<212>dna<213>mmu-mir-146b-5p反向引物<400>8cagtgcagggtccgaggtatt21<210>9<211>24<212>dna<213>hmgb1正向引物<400>9acccggatgcttctgtcaacttct24<210>10<211>24<212>dna<213>hmgb1反向引物<400>10gccttgtcagcctttgccatatct24<210>11<211>20<212>dna<213>gapdh正向引物<400>11catggccttccgtgttccta20<210>12<211>17<212>dna<213>gapdh反向引物<400>12gcggcacgtcagatcca17<210>13<211>400<212>dna<213>wt-hmgb13'-utr<400>13catttaaaatgaagggtatattttcctatactgtggtttgtccctttatgaatcagatac60aagaggataaactttgcatattagtaccatttgtccaatacatttgctttttctttataa120aacccaaactcattcattaatcaggtttaatctgcttagtttagggaacaatttggcaat180tttgtggatttttttttgagattatcgttctcttaaagtgccagtgttttaaatagcgtt240cttgtaatttcacgcgcttttgtgatggagtgctgttatataattttgacttgggttctt300tacatttgcgttgttaatgtaatttgaggaggaatactgaacatgagtcctggatgatac360taataaactaataattacagaggttttaaatattagttaa400<210>14<211>400<212>dna<213>mut-hmgb13'-utr<400>14catttaaaatgaagggtatattttcctatactgtggtttgtccctttatgaatcagatac60aagaggataaactttgcatattagtaccatttgtccaatacatttgctttttctttataa120aacccaaactcattcattaatcaggtttaatctgcttagtttagggaacaatttggcaat180tttgtggatttttttttgagattatcgtagacttaaagtgccagtgttttaaatagcgtt240cttgtaatttcacgcgcttttgtgatggagtgctgttatataattttgacttgggttctt300tacatttgcgttgttaatgtaatttgaggaggaatactgaacatgagtcctggatgatac360taataaactaataattacagaggttttaaatattagttaa400<210>15<211>3035<212>dna<213>hmgb1<400>15gaatcaatcctgcccgcgcgcgcgccagggcaccccaacttttcacgggcccggtttggg60agacaaacaaacaaaaaaaaagacaaaaaaaaaaaaaaagaagagagcgtgcccgacacc120cccgtggtggcggaggaggcggcggcaggagtggcttttgtccctcatccttgtttactc180ggagaaacttcagaccggacgtgtttagtcagagcagaaacgcatctcggggccaaagcg240ataggaaactgcggcctctccgggccccggcccagcgccgcctccgcccgcccgcccgag300caaagtttgatgcgaacacggcgtgctctaagagctggaaaatcaactaaacatgggcaa360aggagatcctaaaaagccgagaggcaaaatgtcctcatatgcattctttgtgcaaacttg420ccgggaggagcacaagaagaagcacccggatgcttctgtcaacttctcagagttctccaa480gaagtgctcagagaggtggaagaccatgtctgctaaagaaaaggggaaatttgaagatat540ggcaaaggctgacaaggctcgttatgaaagagaaatgaaaacctacatcccccccaaagg600ggagaccaaaaagaagttcaaggaccccaatgcacccaagaggcctccttcggccttctt660cttgttctgttctgagtaccgccccaaaatcaaaggcgagcatcctggcttatccattgg720tgatgttgcaaagaaactaggagagatgtggaacaacactgcagcagatgacaagcagcc780ctatgagaagaaagctgccaagctgaaggagaagtatgagaaggatattgctgcctacag840agctaaaggaaaacctgatgcagcgaaaaagggggtggtcaaggctgaaaagagcaagaa900aaagaaggaagaggaagatgatgaggaggatgaagaggatgaggaagaggaggaagaaga960ggaagacgaagatgaagaagaagatgatgatgatgaataagttggttctagcgcagtttt1020tttttcttgtctataaagcatttaacccccctgtacacaactcactccttttaaagaaaa1080aaattgaaatgtaaggctgtgtaagatttgtttttaaactgtacagtgtctttttttgta1140tagttaacacactaccgaatgtgtctttagatagccctgtcctggtggtattttcaatag1200ccactaaccttgcctggtacagtctgggggttgtaaattggcatggaaatttaaagcagg1260ttcttgttggtgcacagcacaaattagttatatatggggacagtagtttggttttttgtt1320tttttttttttttcttttggttttctttttgggttttatttttttcatcttcagttgtct1380ctgatgcagcttatacgaagataattgttgttctgttaactgaataccactctgtaattg1440caaaaaaaaaattgcggctgttttgttgacattctgaatgcttctaagtaaatacaattt1500tttttattagtattgttgtccttttcataggtctgaaagttttcttctcaaggggaagct1560agtcttttgctttgcccattttgggtcacatggattattagtgtgttatctttcatctag1620ttagctggaagagagcttttgtccacatgccctgccattgtggtagggtaacattttcat1680ccatagttgaagaatctcctaaatcgtgatagttggataagagatattatataacctact1740tggcaaagcaaggagtgatcaatactgtcacaccgtgggactattaggatcaagcaatct1800gaacgtctgtccttgaaggactgatagaaaagtaccttctaatccttacacgaggactct1860cctttaaccgccattactgtgtaatgacagttatattttgcagtttcccctactaaagaa1920gacctgagaatgtatccccaaaagtgtgagcttaaaatacaagactgctgtactatttgt1980tgaccttagtcccagcgaaggctatcacaagaacgctggctgtaaagcctttgcccttct2040atctagatatggattgctcaggaaacttgactgtttaaaggtatttttaattacttgagc2100cagcttttaaaattatgccacatttaaaatgaagggtatattttcctatactgtggtttg2160tccctttatgaatcagatacaagaggataaactttgcatattagtaccatttgtccaata2220catttgctttttctttataaaacccaaactcattcattaatcaggtttaatctgcttagt2280ttagggaacaatttggcaattttgtggatttttttttgagattatcgttctcttaaagtg2340ccagtgttttaaatagcgttcttgtaatttcacgcgcttttgtgatggagtgctgttata2400taattttgacttgggttctttacatttgcgttgttaatgtaatttgaggaggaatactga2460acatgagtcctggatgatactaataaactaataattacagaggttttaaatattagttaa2520atgactttcacttaagaatttaagcttttggtcacactttataatagtgccttatagtat2580aaacaactgaaaggctctttcccattaacaacccttgatgctggggccagtgagatagtg2640ggtaaaaaggcagttggctgccaaccctgacaaccgatggcaaaaggagggaaccagctt2700ccaaaatgctttgaccaaatgctccctccattcatgaacacagttttaaaatgttaaata2760ggctagagggcagtaaaaacaggtttttttatcgagcatccctaatctatacatatgagg2820agccataatctgaatgttaagtgaaaagcgaggttggtcttaaagattgcacgtgtgttc2880ttaagcctgtagaggacctccgcaggccgtaatggtctcgattaccaacttaagaacaag2940tgactggcttggaaacttgtactgttgctttagaactaccattgtggacatctgttgtta3000gtaagtgatccatttaaaagtgaactctgcctcaa3035<210>16<211>17<212>dna<213>u6正向引物<400>16ctcgcttcggcagcaca17<210>17<211>20<212>dna<213>u6反向引物<400>17aacgcttcacgaatttgcgt20當(dāng)前第1頁(yè)12