本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及核酸、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻及其產(chǎn)品的方法、引物對(duì)、探針、試劑盒、基因芯片和它們的用途。
背景技術(shù)：
國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(internationalservicefortheacquisitionofagri-biotechapplications,isaaa)統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2014年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.815億公頃，比2013年的1.752億公頃增長(zhǎng)了3.6％；轉(zhuǎn)基因作物在1995年至2014年間產(chǎn)生了多種重大效益:采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使化學(xué)農(nóng)藥的使用率降低了37％，作物產(chǎn)量提高了22％，農(nóng)民利潤(rùn)增加了68％(中國(guó)生物工程雜志，2015，35(1):1-14)。水稻(oryzasatival.)作為世界上最重要的糧食作物之一，人們對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化和育種利用等方面進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。自第1批轉(zhuǎn)基因水稻植株1988年問世以來，含有各種優(yōu)良性狀，如抗蟲、抗除草劑、抗菌、抗病毒或營(yíng)養(yǎng)改良，的轉(zhuǎn)基因水稻相繼研發(fā)成功。但各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化生產(chǎn)態(tài)度謹(jǐn)慎，僅有1999年美國(guó)批準(zhǔn)了2個(gè)抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻品種ll62和ll06的商業(yè)化種植(environmentalassessmentforpetition98-329-01p.determinationofnonregulatedstatusforricegeneticallyengineeredforglufosinateherbicidetolerance,1999)，2004年伊朗開始規(guī)?；N植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻(globalstatusofcommercializedbiotech/gmcrops:2005.isaaabriefno34,2005)，2007年美國(guó)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)重組人乳鐵蛋白、溶菌酶、血清白蛋白3種基因的水稻在控制條件下種植(findingofnosignificantimpactanddecisionnotice.issuanceofpermitstogrowgeneticallyengineerriceproducingrecombinanthumanlactoferrin,lysozymeorserum albumin,2007)。我國(guó)在水稻轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域取得了一系列重大成果，很多轉(zhuǎn)基因水稻品種已被獲準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)，2009年轉(zhuǎn)bt基因抗螟蟲水稻“華恢1號(hào)”和“bt汕優(yōu)63”獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，標(biāo)志著我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻具備了商業(yè)化生產(chǎn)的基本條件；2014年底“華恢1號(hào)”和“bt汕優(yōu)63”的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書獲得延期，有效期至2019年。為了平衡貿(mào)易利益、滿足公眾關(guān)切、控制潛在風(fēng)險(xiǎn)、加強(qiáng)工商監(jiān)管，許多國(guó)家相繼建立了轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)和標(biāo)識(shí)制度。我國(guó)現(xiàn)行對(duì)于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的管理依據(jù)的是國(guó)務(wù)院2001年5月23日頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，以及農(nóng)業(yè)部2002年1月5日發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》3個(gè)配套規(guī)章。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)管理，保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的有效監(jiān)管和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度提出了嚴(yán)格要求。
轉(zhuǎn)基因植物中外源基因在染色體上插入位置的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，是區(qū)別不同轉(zhuǎn)化事件的唯一性標(biāo)識(shí)，是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測(cè)方法的重要技術(shù)資料。如：王恒波等(轉(zhuǎn)基因大豆gts40-3-2轉(zhuǎn)化事件特異性pcr檢測(cè).基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2010,(06):1177-83)建立了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆gts40-3-2的品系特異性pcr檢測(cè)方法。翟志芳等(轉(zhuǎn)基因玉米ly038轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測(cè).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2011,(03):577-82)采用修飾接頭連接pcr獲得了轉(zhuǎn)基因玉米ly038的外源基因與玉米基因組之間的5'端側(cè)翼序列，據(jù)此建立了轉(zhuǎn)基因玉米ly038轉(zhuǎn)化事件特異性定性檢測(cè)方法。就水稻而言，謝家建等建立了轉(zhuǎn)xa21基因抗病水稻抗優(yōu)97的特異性檢測(cè)方法(轉(zhuǎn)xa21基因水稻抗優(yōu)97特異性檢測(cè)方法的建立.中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì),中國(guó)湖南長(zhǎng)沙)，中國(guó)水稻所的王渭霞等擴(kuò)增出了轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)的旁側(cè)序列，發(fā)明了基于這一 旁側(cè)序列的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法并申請(qǐng)了專利(cn101824411a)。蘇長(zhǎng)青等測(cè)定了的轉(zhuǎn)cry1ab/cry1ac融合基因水稻品系“bt汕優(yōu)63”的外源插入dna全序列，建立了實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法(轉(zhuǎn)基因水稻bt汕優(yōu)63的整合結(jié)構(gòu)和品系特異性定量pcr方法.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2011,19(3),434-441)。2013年，董立明等獲得了轉(zhuǎn)bt-pta-bar基因玉米jl937的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，并建立了特異性檢測(cè)方法(轉(zhuǎn)bt-pta-bar基因玉米側(cè)翼序列分析及特異性檢測(cè)方法研究.玉米科學(xué),2013,1(3):30-34)；蔣利平等獲得了抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻b2a68的側(cè)翼序列，建立了特異性檢測(cè)方法并申請(qǐng)了專利(轉(zhuǎn)基因水稻b2a68事件特異性檢測(cè)方法的建立.雜交水稻,2013,28(5):60-67.專利申請(qǐng)cn201310068126.8)。
利用密碼子優(yōu)化的cry1ca#基因和bar基因共同轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系r893，可獲得抗除草劑、抗蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。既抗除草劑、又抗螟蟲的轉(zhuǎn)基因水稻不僅能減少農(nóng)藥的使用，并且能方便除草，在生產(chǎn)上具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明的發(fā)明人通過利用密碼子優(yōu)化的cry1ca#基因和bar基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻新品系b1c893(抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的獲得與鑒定.雜交水稻，2014，29(1):67-71.專利申請(qǐng)cn201310305677.1)。由于外源基因的插入具有隨機(jī)性，轉(zhuǎn)基因水稻新品系b1c893的外源基因在基因組中插入位置并不清楚，因此難以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻b1c893及其衍生品系的特異性檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻b1c893及其衍生品系的特異性檢測(cè)。
轉(zhuǎn)基因水稻新品系b1c893已經(jīng)在文獻(xiàn)中公開(抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的獲得與鑒定.雜交水稻,2014，29(1):67-71)，可以通過向中國(guó) 科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所來函索取的方式獲得。
水稻基因組大小一般認(rèn)為有4.3億bp。由于基因轉(zhuǎn)化過程中外源基因的插入具有隨機(jī)性，插入到水稻基因組某個(gè)固定位置的幾率理論上有4.3億分之一。但是，基因轉(zhuǎn)化是一個(gè)不可以人為控制的復(fù)雜生物學(xué)過程，具有很大的技術(shù)難度，水稻轉(zhuǎn)基因育種中獲得的轉(zhuǎn)化事件數(shù)量是有限的(一般不超過50個(gè))，不可能重復(fù)出現(xiàn)一個(gè)極小概率的事件，外源基因?qū)嶋H上沒有機(jī)會(huì)插入到水稻基因組的同一位置，每個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件都具有唯一性，隨之而來的外源基因序列與水稻基因組序列拼接而成的旁側(cè)序列也具有唯一性。因此，旁側(cè)序列的核酸是一種全新的核酸分子。本發(fā)明的發(fā)明人率先得到了轉(zhuǎn)基因水稻b1c893外源基因旁側(cè)序列的具體序列信息，由此建立的檢測(cè)方法是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893及含有該核酸衍生系的水稻及其產(chǎn)品的特異性方法。
一方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸包括右旁側(cè)序列核酸和/或左旁側(cè)序列核酸；所述右旁側(cè)序列核酸的序列為seqidno.1或seqidno.1的片段，其中，所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第814-825位的序列；優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第799-840位的序列，更優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第789-850位序列，更進(jìn)一步優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第779-860位的序列；所述左旁側(cè)序列核酸的序列為seqidno.9或seqidno.9的片段，所述seqidno.9的片段至少含有seqidno.9的第1877-1888位序列；優(yōu)選所述seqidno.9的片段至少含有seqidno.9的第1862-1903位的序列，更優(yōu)選所述seqidno.9的片段至少包括seqidno.9的第1852-1913位的序列，更進(jìn)一步優(yōu)選至少包括seqidno.9的第1842-1923位的序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種核酸，其中，該核酸的序列與如上所述 的核酸的序列互補(bǔ)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種引物，該引物為用作判斷轉(zhuǎn)基因水稻b1c893轉(zhuǎn)化事件及含有該轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)品的特異性引物，其中，該引物包括針對(duì)如上所述的核酸設(shè)計(jì)的特異性引物。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的方法，該水稻樣品為或來源為轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的衍生系，其中，該方法包括：(1)使用如上所述的引物對(duì)取自待測(cè)水稻或水稻產(chǎn)品的核酸樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(2)檢驗(yàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增子；其中，所述擴(kuò)增子的序列與如上所述的核酸序列相同則指示所述待測(cè)水稻為或來源為所述轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者為含有如上所述的核酸的衍生系；其中，所述擴(kuò)增子只有1個(gè)且序列與上述序列相同時(shí)，指示該樣品中外源基因是純合態(tài)；所述擴(kuò)增子有至少2個(gè)且其中1個(gè)的序列與上述序列相同、其中另1個(gè)的序列與ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列或其互補(bǔ)序列或它們的片段序列相同時(shí)指示該樣品中外源基因是雜合態(tài)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種探針，該探針為用作判斷轉(zhuǎn)基因水稻b1c893轉(zhuǎn)化事件及含有該轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)品的特異性核酸探針，其中，該探針包括針對(duì)如上所述的核酸設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；優(yōu)選地，所述特異性核酸探針包含seqidno.1的片段和/或seqidno.9的片段中至少11個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列；更優(yōu)選地，所述針對(duì)seqidno.1或其互補(bǔ)序列的、至少包含11個(gè)連續(xù)核苷酸的特異性核酸探針至少含有seqidno.1的第819-820位序列或其互補(bǔ)序列，所述針對(duì)seqidno.9或其互補(bǔ)序列的、至少包含11個(gè)連續(xù)核苷酸的特異性核酸探針至少含有seqidno.9的第1882-1883位序列或其互補(bǔ)序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的方法，該水稻樣品為或來源為轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的 轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的衍生系，其中，該方法包括：(1)使用如上所述的探針對(duì)取自待測(cè)水稻或水稻產(chǎn)品的核酸樣品進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)核酸雜交反應(yīng)；(2)檢驗(yàn)所述探針與所述樣品的結(jié)合；其中，探針與所述樣品的嚴(yán)謹(jǐn)結(jié)合指示所述待測(cè)水稻為或來源為所述轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者為含有如上所述的核酸的衍生系。
另一方面，本發(fā)明還提供了試劑盒和/或基因芯片，該試劑盒和/或基因芯片包括如上所述的引物和/或如上所述的探針。
再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的引物或/和如上所述的探針或/和如上所述的試劑盒和或基因芯片在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的水稻衍生系及其產(chǎn)品中的用途。
通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明成功地實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者由b1c893通過各種育種方法產(chǎn)生的含有該核酸片段的衍生系及其產(chǎn)品的檢測(cè)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。
具體實(shí)施方式
以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
一方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸包括右旁側(cè)序列核酸和/或左旁側(cè)序列核酸；所述右旁側(cè)序列核酸的序列為seqidno.1或seqidno.1的片段，其中，所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第814-825位的序列；優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第799-840位的序列，更優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第789-850位序列，更進(jìn)一步優(yōu)選所述seqidno.1的片段至少含有seqidno.1的第779-860位的序列；所述左旁側(cè)序列核酸的序列為seqidno. 9或seqidno.9的片段，所述seqidno.9的片段至少含有seqidno.9的第1877-1888位序列；優(yōu)選所述seqidno.9的片段至少含有seqidno.9的第1862-1903位的序列，更優(yōu)選所述seqidno.9的片段至少包括seqidno.9的第1852-1913位的序列，更進(jìn)一步優(yōu)選至少包括seqidno.9的第1842-1923位的序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種核酸，其中，該核酸的序列與如上所述的核酸的序列互補(bǔ)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種引物，該引物為用作判斷轉(zhuǎn)基因水稻b1c893轉(zhuǎn)化事件及含有該轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)品的特異性引物，其中，該引物包括針對(duì)如上所述的核酸設(shè)計(jì)的特異性引物。
其中，優(yōu)選地，所述特異性引物包括針對(duì)seqidno.1的第1-819位的區(qū)域設(shè)計(jì)的右側(cè)上游引物和針對(duì)seqidno.1的第820-2952位的區(qū)域設(shè)計(jì)的右側(cè)下游引物。
其中，更優(yōu)選地，所述右側(cè)上游引物如seqidno.12所示，所述右側(cè)下游引物如seqidno.13所示。
其中，對(duì)于所述右側(cè)特異性引物包括seqidno.12所示的右側(cè)上游引物和seqidno.13所示的右側(cè)下游引物的情況，優(yōu)選地，pcr擴(kuò)增的條件包括退火溫度為51-57℃。
其中，優(yōu)選地，所述特異性引物包括針對(duì)seqidno.9的第1-1882位的區(qū)域設(shè)計(jì)的左側(cè)上游引物和針對(duì)seqidno.9的第1883-2590位的區(qū)域設(shè)計(jì)的左側(cè)下游引物。
其中，更優(yōu)選地，所述左側(cè)上游引物如seqidno.14所示，所述左側(cè)下游引物如seqidno.15所示。
其中，對(duì)于所述左側(cè)特異性引物包括seqidno.14所示的左側(cè)上游引物和seqidno.15所示的左側(cè)下游引物的情況，優(yōu)選地，pcr擴(kuò)增的條件 包括退火溫度為54-62℃。
另一方面，本發(fā)明還提供了引物對(duì)，該引物對(duì)包括右側(cè)特異性引物對(duì)和/或左側(cè)特異性引物對(duì)；所述右側(cè)特異性引物對(duì)包括seqidno.12所示的右側(cè)上游引物和seqidno.13所示的右側(cè)下游引物；所述左側(cè)特異性引物對(duì)包括seqidno.14所示的左側(cè)上游引物和seqidno.15所示的左側(cè)下游引物。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的方法，該水稻樣品為或來源為轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的衍生系，其中，該方法包括：(1)使用如上所述的引物對(duì)取自待測(cè)水稻或水稻產(chǎn)品的核酸樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(2)檢驗(yàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增子；其中，所述擴(kuò)增子的序列與如上所述的核酸序列相同則指示所述待測(cè)水稻為或來源為所述轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者為含有如上所述的核酸的衍生系；其中，所述擴(kuò)增子只有1個(gè)且序列與上述序列相同時(shí)，指示該樣品中外源基因是純合態(tài)；所述擴(kuò)增子有至少2個(gè)且其中1個(gè)的序列與上述序列相同、其中另1個(gè)的序列與ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列或其互補(bǔ)序列或它們的片段序列相同時(shí)指示該樣品中外源基因是雜合態(tài)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種探針，該探針為用作判斷轉(zhuǎn)基因水稻b1c893轉(zhuǎn)化事件及含有該轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)品的特異性核酸探針，其中，該探針包括針對(duì)如上所述的核酸設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；優(yōu)選地，所述特異性核酸探針包含seqidno.1的片段和/或seqidno.9的片段中至少11個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列；更優(yōu)選地，所述針對(duì)seqidno.1或其互補(bǔ)序列的、至少包含11個(gè)連續(xù)核苷酸的特異性核酸探針至少含有seqidno.1的第819-820位序列或其互補(bǔ)序列，所述針對(duì)seqidno.9或其互補(bǔ)序列的、至少包含11個(gè)連續(xù)核苷酸的特異性核酸探針至少含有seqidno.9的第1882-1883位序列或其互補(bǔ)序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的方法，該水稻樣品為或來源為轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的衍生系，其中，該方法包括：(1)使用如上所述的探針對(duì)取自待測(cè)水稻或水稻產(chǎn)品的核酸樣品進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)核酸雜交反應(yīng)；(2)檢驗(yàn)所述探針與所述樣品的結(jié)合；其中，探針與所述樣品的嚴(yán)謹(jǐn)結(jié)合指示所述待測(cè)水稻為或來源為所述轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者為含有如上所述的核酸的衍生系。
另一方面，本發(fā)明還提供了試劑盒和/或基因芯片，該試劑盒和/或基因芯片包括如上所述的引物和/或如上所述的探針。
其中，所述試劑盒還可以包括陽性對(duì)照核酸，所述陽性對(duì)照核酸為如上所述的右旁側(cè)序列核酸和/或左旁側(cè)序列核酸或與它們序列互補(bǔ)的核酸。其中，所述試劑盒還可以包括dntps、pcr緩沖液和耐高溫dna聚合酶。
再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的引物或/和如上所述的探針或/和如上所述的試劑盒和/或基因芯片在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的水稻衍生系及其產(chǎn)品中的用途。
轉(zhuǎn)基因水稻b1c893所用載體中包括cry1ca#基因表達(dá)框序列和bar基因表達(dá)框序列。本發(fā)明采用常規(guī)方法提取植物基因組dna。利用hitail-pcr和ld-pcr的方法，擴(kuò)增、分離并延伸得到外源基因插入位點(diǎn)的右旁側(cè)序列，如seqidno.1所示，長(zhǎng)度2952bp。利用ld-pcr方法擴(kuò)增得到的外源基因插入位點(diǎn)的左旁側(cè)序列，如seqidno.9所示，長(zhǎng)度2590bp。
通過分析seqidno.1發(fā)現(xiàn)，其中第1至第819位序列與所用載體右邊界上游序列完全一致，說明是外源基因序列，第820至第2952位序列與已發(fā)表的水稻基因組第8號(hào)染色體上序列(ncbi登錄號(hào)：ap005406.3)的第17502至第19633位反向互補(bǔ)，說明是受體水稻r893自身的基因組序列。通過分析seqidno.9發(fā)現(xiàn)，其第1至第1882位序列與水稻第8號(hào)染色體 上的發(fā)表序列(ncbi登錄號(hào)為ap005406.3)反向互補(bǔ)，說明該段序列來源于受體r893的基因組序列，第1883至第2590位與載體左邊界及終止子、bar基因序列及35s啟動(dòng)子部分序列完全相同，說明該段序列來自外源基因。
根據(jù)t-dna右旁側(cè)序列(seqidno.1)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，其中一條引物根據(jù)seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)，即是按照t-dna右邊界上游區(qū)域序列設(shè)計(jì)，另一條引物根據(jù)第820至第2952位序列設(shè)計(jì)，即按照插入位點(diǎn)處的水稻基因組序列設(shè)計(jì)。即該引物對(duì)能特異性的擴(kuò)增出具有部分外源基因序列和水稻基因組第8號(hào)染色體上的ap005406.3序列的部分序列。優(yōu)選的，本發(fā)明采用的正向引物為rb-f，序列如seqidno.12所示(5'-tgagcttggatcagattgtcg-3')，反向引物為rb-r，序列如seqidno.13所示(5'-ttcctctacctgtaggctg-3')，利用該引物對(duì)進(jìn)行特異性pcr檢測(cè)，只有轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者具有seqidno.1序列的衍生品系能獲得長(zhǎng)度為376bp的特異條帶。引物對(duì)rb-f/rb-r對(duì)樣品中轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的成分的檢測(cè)限度達(dá)到0.1％。
根據(jù)t-dna左旁側(cè)序列(seqidno.9)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，其中一條引物根據(jù)seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)，即參照插入位點(diǎn)處的水稻基因組序列設(shè)計(jì)，另一條引物根據(jù)第1883至第2590位序列設(shè)計(jì)，即按照t-dna左邊界上游序列設(shè)計(jì)。優(yōu)選的，本發(fā)明采用的正向引物為lb2-f，序列如seqidno.14所示(5'-tttctttcagtttcaccaccca-3')，反向引物為lb2-r，序列如seqidno.15所示(5'-gcccgtcaccgagatttg-3')，利用該引物對(duì)進(jìn)行特異性pcr檢測(cè)，只有轉(zhuǎn)基因水稻b1c893或者具有seqidno.9序列的衍生品系能獲得長(zhǎng)度為536bp的特異條帶。引物對(duì)lb2-f/lb2-r對(duì)樣品中轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的成分的檢測(cè)限度達(dá)到0.1％。
本發(fā)明首次獲得了轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893的插入外源基因的左、右旁 側(cè)序列，并且利用這兩個(gè)旁側(cè)序列建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的品系特異性定性pcr檢測(cè)方法和核酸探針雜交檢測(cè)方法。本發(fā)明所建立的轉(zhuǎn)基因水稻b1c893特異性檢測(cè)方法可以進(jìn)一步應(yīng)用于特異性檢測(cè)試劑盒和基因芯片的開發(fā)，以對(duì)轉(zhuǎn)基因活體(植株、種子)、產(chǎn)品、提取物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)和純/雜合體判別，通過標(biāo)準(zhǔn)含量樣品的設(shè)置，還可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)和定量檢測(cè)試劑盒和基因芯片的開發(fā)。
以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件進(jìn)行，例如《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中所述的條件，或按照相應(yīng)生物學(xué)試劑所建議的條件。
實(shí)施例1：本實(shí)施例說明獲得右旁側(cè)序列的過程。
首先，通過hitail-pcr擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的部分右旁側(cè)序列，如seqidno.2所示，全長(zhǎng)1059bp。hitail-pcr所用特異性嵌套引物依據(jù)植物表達(dá)載體pc3300-cry1ca的t-dna序列右邊界(rb)上游lacz基因序列設(shè)計(jì)。植物表達(dá)載體pc3300-cry1ca的資料參考專利(專利文獻(xiàn)cn201310305677.1)。hitail-pcr方法參考文獻(xiàn)(high-efficiencythermalasymmetricinterlacedpcrforamplificationofunknownflankingsequences.2007,biotechniques,43(5):649-456)，其中：所述引物包括長(zhǎng)隨機(jī)引物lad1～lad4，通用引物ac1，特異性嵌套引物rb-0b、rb-1b和rb-2b(引物序列見表1)。hitail-pcr擴(kuò)增獲得1059bp長(zhǎng)的片段。
通過blast分析發(fā)現(xiàn)，seqidno.2中第1至第122位核苷酸序列與所用載體右邊界序列完全一致，第123至第1059位序列與水稻基因組第8號(hào)染色體上序列(ap005406.3)的第18694至第19633位反向互補(bǔ)。
其次，根據(jù)獲得的水稻基因組序列信息(ncbi登錄號(hào)ap005406.3)設(shè) 計(jì)引物對(duì)rbg-f/rbg-r，序列分別如seqidno.3(5'-tgacctgctaattatctctc-3')和seqidno.4所示(5'-gccagcaatgcacctgatgaa-3')，利用引物對(duì)rbg-f/rbg-r擴(kuò)增得到1259bp的右旁側(cè)受體基因組延伸序列，如seqidno.5所示，該序列與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)所公布的水稻基因組序列(ncbi登錄號(hào)ap005406.3)反向互補(bǔ)。
根據(jù)載體pc3300-cry1ca右邊界上游序列信息設(shè)計(jì)引物對(duì)rbv-f/rbv-r，序列分別如seqidno.6(5'-ttcgctggttggtgtccgttag-3')和seqidno.7(5'-gatccaagctcaagctgctctagc-3')所示；利用引物對(duì)rbv-f/rbv-r擴(kuò)增得到764bp的右旁側(cè)的載體延伸序列，如seqidno.8所示，該序列與載體pc3300-cry1ca右邊界上游的部分序列完全一致。
分析seqidno.2、seqidno.5和seqidno.8序列，發(fā)現(xiàn)seqidno.2分別與其它兩者有63bp和67bp的序列重復(fù)，將3次擴(kuò)增獲得的序列seqidno.2、seqidno.5和seqidno.8拼接得到右旁側(cè)序列seqidno.1，該序列全長(zhǎng)2952bp，包含第1至第819位的外源基因序列(載體序列)與第820至第2952位的水稻基因組序列。
本實(shí)施例的詳細(xì)操作如下：
ctab法(王關(guān)林等，植物基因工程，北京：科學(xué)出版社，2009)提取dna。取2.0μldna用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定dna濃度。
參照liu等(liuetal.,2007,biotechniques,43(5):649-456)的方法進(jìn)行hitail-pcr分離t-dna右旁側(cè)序列。hitail-pcr第1級(jí)反應(yīng)使用4條長(zhǎng)隨機(jī)引物(lad1～lad4)與特異性嵌套引物rb-0b組合，以轉(zhuǎn)基因水稻b1c893基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，非轉(zhuǎn)基因水稻r893作為對(duì)照。第1級(jí) pcr擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物稀釋40倍用作第2級(jí)tail-pcr反應(yīng)的模板，第2級(jí)反應(yīng)的引物組合為ac1/rb-1b。將第2級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍用作第3級(jí)反應(yīng)的模板，引物組合為ac1/rb-2b。第二級(jí)和第三級(jí)反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離。所用引物序列見表1，擴(kuò)增程序見表2。
表1：hitail-pcr所用引物
表2：hitail-pcr擴(kuò)增程序
利用hitail-pcr擴(kuò)增所獲得的序列(seqidno.2)設(shè)計(jì)引物rbg-f，參考水稻基因組序列(ncbi登錄號(hào)ap005406.3)設(shè)計(jì)引物rbg-r，引物序列如下表。根據(jù)載體pc3300-cry1ca右邊界上游序列信息設(shè)計(jì)引物對(duì)rbv-f/rbv-r，引物序列如下表。利用引物對(duì)rbg-f/rbg-r和引物對(duì)rbv-f/rbv-r分別pcr擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻b1c893，擴(kuò)增體系為：20μlpcr反應(yīng)體系中包括1×pcrbuffer，200μmdntps，1μm正向引物和1μm反向引物，0.5utaqdna聚合酶和20ngdna模板。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min；34個(gè)循環(huán)(94℃45s，退火30s，72℃1min)；72℃10min。
表3：用于右邊界序列延伸的引物
用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，切下相應(yīng)的特異性條帶，用大連寶生物凝膠回收試劑盒回收特異片段，并克隆到pmd19-tsimplevector，挑選陽性克隆送深圳華大基因公司測(cè)序。序列比較分析運(yùn)用ncbi的blast軟件進(jìn)行。
根據(jù)t-dna右邊界的載體序列設(shè)計(jì)的3個(gè)嵌套的特異性引物(rb-0b、rb-1b和rb-2b)跟隨機(jī)引物lad4組合時(shí)，在轉(zhuǎn)基因水稻b1c893中擴(kuò)增出特異性條帶。對(duì)隨機(jī)引物lad4擴(kuò)增出的第三級(jí)pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序得到1059bp的右邊界融合序列，序列如seqidno.2所示。該序列的特征為：第1至第122位與載體序列完全匹配，第123至第1059位為水稻基因組第8號(hào)染色體上的序列。利用rbg-f/rbg-r引物對(duì)擴(kuò)增得到1259bp序列，序列如seqidno.5所示，與水稻第8號(hào)染色體序列反向互補(bǔ)；利用引物對(duì)rbv-f/rbv-r擴(kuò)增得到764bp的序列，如seqidno.8所示，與載體pc3300-cry1ca右邊界上游序列完全一致。分析seqidno.2、 seqidno.5和seqidno.8序列，發(fā)現(xiàn)seqidno.2與兩者之分別間有63bp和67bp的序列重復(fù)。將seqidno.2、seqidno.5和seqidno.8的序列相拼接得到轉(zhuǎn)基因水稻b1c893右旁側(cè)序列，序列如seqidno.1所示，該序列的特征為：第1至第819位為插入水稻中的外源基因序列(載體序列)，第820至第2952位為水稻基因組序列，與已公布的水稻第8號(hào)染色體上序列反向互補(bǔ)。
實(shí)施例2：本實(shí)施例說明獲得左旁側(cè)序列的過程。
根據(jù)測(cè)序所得的右旁側(cè)序列以及已公布的水稻第8號(hào)染色體上的序列設(shè)計(jì)正向引物lb1-f，序列如seqidno.10所示(5'-ggcatgttcgttatcgacctctt-3')，根據(jù)載體pc3300-cry1ca序列設(shè)計(jì)反向引物lb1-r，序列如seqidno.11所示(5'-gtctgcaccatcgtcaaccacta-3')，用該引物對(duì)擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的左旁側(cè)序列，如seqidno.9所示，長(zhǎng)度為2590bp。通過分析seqidno.9發(fā)現(xiàn)，獲得的序列第1至第1882位與水稻基因組第8號(hào)染色體序列(ncbi登錄號(hào)ap005406.3)反向互補(bǔ)，第1883位至第2590位與載體pc3300-cry1ca的camv35s終止子部分序列完全相同。外源基因插入水稻第8號(hào)染色體第25981位，外源基因的插入使水稻基因組缺失45個(gè)堿基(水稻第8號(hào)染色體第25982-26026位(該序列的ncbi登錄號(hào)為ap014964.1)或ncbi登陸號(hào)為ap005406.3序列的19634-19678位)。根據(jù)外源基因插入位點(diǎn)的dna序列分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻b1c893中外源基因插入位點(diǎn)上游第140bp處存在轉(zhuǎn)錄區(qū)域(os08t0100300-01，http://ensembl.gramene.org/oryza_sativa/transcript/)，該轉(zhuǎn)錄區(qū)域不編碼蛋白質(zhì)，但是dna能翻譯成ncrna(non-codingrna，非編碼rna)；ncrna雖然不翻譯成蛋白質(zhì)，但對(duì)生物具有重要的調(diào)控功能；外源基因插入位點(diǎn)下 游第248bp處存在蛋白編碼區(qū)(os08t0100400-01，http://ensembl.gramene.org/oryza_sativa/transcript/)，該編碼區(qū)編碼蛋白為os08g0100400，該蛋白功能為鋅離子結(jié)合區(qū)(http://www.uniprot.org/uniprot/c7j5f7)。
本實(shí)施例的詳細(xì)操作如下：
dna提取采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行。
長(zhǎng)鏈pcr用于擴(kuò)增水稻基因組中的長(zhǎng)片段。本實(shí)例中用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻b1c893的外源插入載體的t-dna左旁側(cè)序列。引物序列見表4。ld-pcr擴(kuò)增體系為：20μlpcr反應(yīng)體系中包括1×pcrbuffer，200μmdntps，1μm正向引物lb1-f和1μm反向引物lb1-r，0.5utaqdna聚合酶和20ngdna模板。ld-pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min；94℃變性45s，56℃30s，72℃2min，34個(gè)循環(huán)；72℃10min。
表4：用于ld-pcr的引物
采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行pcr產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。
利用引物對(duì)lb1-f/lb1-r進(jìn)行l(wèi)d-pcr擴(kuò)增，獲得序列如seqidno.9所示，長(zhǎng)度2590bp。其中：第1至第1882位為水稻基因組序列，第1883位至第2590位為外源基因序列(載體序列)。
實(shí)施例3：本實(shí)施例說明基于右旁側(cè)序列和左旁側(cè)序列的b1c893轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法。
轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893的外源插入片段的右旁側(cè)序列的定性pcr檢測(cè)方法，其中，所述pcr反應(yīng)中的兩條引物組合為t-dna右邊界的旁側(cè)序列的特異性引物對(duì)：一條引物依據(jù)seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)，另一條引物依據(jù)seqidno.1中第820至第2952位序列設(shè)計(jì)。
具體地，所述特異性引物對(duì)如下：
正向引物rb-f，依據(jù)seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)，序列如seqidno.12所示(5'-tgagcttggatcagattgtcg-3')；
反向引物rb-r，依據(jù)seqidno.1中第819至第2952位序列設(shè)計(jì)，序列如seqidno.13所示(5'-ttcctctacctgtaggctg-3')；
利用上述引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893能獲得長(zhǎng)度為376bp的目的片段，其序列與seqidno.1的片段序列相同，非轉(zhuǎn)基因水稻及非該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻不能獲得大小、序列與目的片段相同的目的片段。
轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893的外源插入片段的左旁側(cè)序列的定性pcr檢測(cè)方法，其中：所述pcr反應(yīng)中的兩條引物組合為外源基因插入位點(diǎn)處左旁側(cè)序列的特異性引物對(duì)：一條引物依據(jù)seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)，即左旁側(cè)序列中的水稻基因組序列；另一條引物依據(jù)seqidno.9中第1883至第2590位序列設(shè)計(jì)，即左旁側(cè)序列中的外源基因序列。
具體地，所述特異性引物對(duì)如下：
正向引物lb2-f，依據(jù)seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)，序列如seqidno.14所示(5'-tttctttcagtttcaccaccca-3')；
反向引物lb2-r，依據(jù)seqidno.9第1883至第2590位序列設(shè)計(jì)，序列如seqidno.15所示(5'-gcccgtcaccgagatttg-3')；
利用上述引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893能獲得長(zhǎng)度為536bp的目的片段，其序列與seqidno.9的片段序列相同，非轉(zhuǎn)基因水稻及非該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻不能獲得大小、序列與目的片段相同的目的片段。
本實(shí)施例的詳細(xì)操作如下：
dna提取采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行。
根據(jù)實(shí)施例1和2中獲得的轉(zhuǎn)基因水稻的右旁側(cè)序列和左旁側(cè)序列，分別依據(jù)其水稻基因組序列部分和外源基因序列(載體序列)部分設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，引物序列見表5。pcr反應(yīng)體系為：20μlpcr反應(yīng)體系中包括1×pcrbuffer，200μmdntps，1μm特異引物對(duì)，0.5utaqdna聚合酶和20ngdna模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min；94℃30s，退火30s，72℃1min，34個(gè)循環(huán)；72℃10min。利用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物分析。
表5：轉(zhuǎn)基因水稻品系b1c893的t-dna左右邊界側(cè)的事件特異性檢測(cè)引物對(duì)
采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行pcr產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。
利用引物對(duì)rb-f/rb-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，僅在轉(zhuǎn)基因水稻b1c893中得到376bp的目的片段，而在其他轉(zhuǎn)基因水稻品系和對(duì)照品種中均未得到擴(kuò)增產(chǎn)物；引物對(duì)rb-f/rb-r適宜的退火溫度范圍為51-57℃。
利用引物對(duì)lb2-f/lb2-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，僅在轉(zhuǎn)基因水稻b1c893中得到長(zhǎng)度為536bp的特異條帶，而在其他轉(zhuǎn)基因水稻品系和對(duì)照品種中均未得到擴(kuò)增產(chǎn)物；引物對(duì)lb2-f/lb2-r適宜的退火溫度范圍為54-62℃。
其中，轉(zhuǎn)基因水稻品種b1c893作為檢測(cè)樣品(雜交水稻,2014,29(1):67-71)，轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧蠟閎rd88、b2a68、eb7001s、b88s(雜交水稻,2013,28(1):63-67)，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諡閞893(雜交水稻,2010,25(5):15-16)、7001s(安擻農(nóng)業(yè)科學(xué),1994,22(1):11-15)、吉梗88(吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,31(5):22-23)、d68(雜交水稻,1998,13(3):6-7)。上述水稻均已經(jīng)在各自的文獻(xiàn)中 公開，可以通過向中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所來函索取的方式獲得，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所保證從本發(fā)明的申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放上述水稻。
實(shí)施例4：本實(shí)施例用于說明基于左/右旁側(cè)序列的b1c893事件特異性檢測(cè)方法的檢出限或靈敏度。
取待測(cè)樣品提取和測(cè)定dna含量，按照一定的梯度或比例稀釋dna樣品；依據(jù)實(shí)施例3的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增；設(shè)置定量分子量標(biāo)記對(duì)固定體積的pcr擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行電泳，使用如imagelab3.0的軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行定量分析，依據(jù)不同泳道內(nèi)目標(biāo)條帶的相對(duì)亮度計(jì)算dna含量，計(jì)算檢出限。
本實(shí)施的詳細(xì)操作如下：
采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行dna提取。
將轉(zhuǎn)基因水稻b1c893基因組dna與非轉(zhuǎn)基因水稻r893基因組dna均稀釋至100ng/μl，并按照不同的比例混合配成轉(zhuǎn)基因水稻dna相對(duì)含量為100％、20％、5％、1％、0.5％、0.1％(v/v)的樣品。
根據(jù)實(shí)施例3的方法，基于左、右旁側(cè)序列的定性pcr靈敏度檢測(cè)，按優(yōu)化后的退火溫度對(duì)樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別測(cè)定特異性檢測(cè)引物對(duì)rb-f/rb-r和lb2-f/lb2-r的檢測(cè)限度。
利用引物對(duì)rb-f/rb-r和lb2-f/lb2-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，當(dāng)轉(zhuǎn)基因dna成分為0.1％時(shí)特異性引物對(duì)仍能分別檢測(cè)出376bp或536bp的特異性條帶，說明在常規(guī)pcr條件下轉(zhuǎn)基因品系b1c893特異性檢測(cè)引物最低檢測(cè)限度至少可達(dá)0.1％，完全能夠滿足歐盟要求轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量達(dá)到0.9％就要求標(biāo)識(shí)的檢測(cè)靈敏度要求。
實(shí)施例5：本實(shí)施例說明基于左、右旁側(cè)序列的多重pcr檢測(cè)方法。
依據(jù)seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，依據(jù)seqidno.1中第820至第2952位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，獲得右旁側(cè)序列的1個(gè)特異性引物對(duì)；依據(jù)seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，依據(jù)seqidno.9中第1883至第2590位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，獲得左旁側(cè)序列的1個(gè)特異性引物對(duì)；以這2個(gè)特異性引物對(duì)同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻基因組dna，同時(shí)獲得左、右邊界的2條目標(biāo)特異帶。
具體地，以特異性引物lb2-f、lb2-r、rb-f和rb-r對(duì)待測(cè)樣品dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻b1c893擴(kuò)增獲得536bp和376bp的2條目的片段，其它所有水稻不能獲得條帶或者不能獲得上述相同大小的目標(biāo)條帶。
實(shí)施例6
本實(shí)施例用于說明基于左、右旁側(cè)序列的3引物pcr法檢測(cè)b1c893或含有該轉(zhuǎn)化事件的水稻及其產(chǎn)品中外源基因的雜合性和純合性的方法。
依據(jù)右旁側(cè)序列seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，依據(jù)右旁側(cè)序列seqidno.1中第820至第2952位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物，依據(jù)左旁側(cè)序列seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)1個(gè)特異性引物。針對(duì)待測(cè)核酸樣品，用上述3類引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，其中，純合體得到序列為右旁側(cè)序列或右旁側(cè)序列的片段的單個(gè)擴(kuò)增子，雜合體得到1個(gè)序列為右旁側(cè)序列或右旁側(cè)序列的片段的擴(kuò)增子和1個(gè)來源于不含該轉(zhuǎn)化事件的核酸模板產(chǎn)生的擴(kuò)增子(序列如ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列或其互補(bǔ)序列的片段)，不含該轉(zhuǎn)化事件的核酸樣品得到1個(gè)來源于不含該轉(zhuǎn)化事件的模板產(chǎn)生的擴(kuò)增子(序列如ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列或其互補(bǔ)序列的片段)。
依據(jù)右旁側(cè)序列seqidno.1中第1至第819位序列設(shè)計(jì)的引物為seq idno.12所示序列的核酸，依據(jù)右旁側(cè)序列seqidno.1中第820至第2952位序列設(shè)計(jì)的引物為seqidno.13所示序列的核酸，依據(jù)左旁側(cè)序列seqidno.9中第1至第1882位序列設(shè)計(jì)的引物為seqidno.14所示序列的核酸。針對(duì)待測(cè)核酸樣品，用上述3條引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，其中，純合體得到序列為右旁側(cè)序列的片段的單個(gè)擴(kuò)增子，長(zhǎng)度376bp；雜合體得到1個(gè)序列為右旁側(cè)序列的片段、長(zhǎng)度為376bp的擴(kuò)增子和另外1個(gè)來源于序列如ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列的互補(bǔ)序列的片段，長(zhǎng)度為636bp；不含該轉(zhuǎn)化事件的核酸樣品得到1個(gè)序列如ncbi登錄號(hào)ap005406.3中所示序列的互補(bǔ)序列的片段，長(zhǎng)度為636bp。
依據(jù)上述原理，可以針對(duì)左旁側(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行三引物法檢測(cè)，還可以針對(duì)左或右旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行三引物法檢測(cè)，以判別純合態(tài)、雜合態(tài)和非該轉(zhuǎn)化事件的樣品。
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。