本發(fā)明專利屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。涉及一種簡(jiǎn)單高效的通用型總rna提取試劑盒及方法。此試劑盒及方法適用于從植物、動(dòng)物、微生物、血液等多數(shù)生物樣本以及植物根、莖、葉、花、果實(shí)不同組織部位提取高純度、高完整性、高產(chǎn)量的總rna，并且提取的總rna可以直接用于反轉(zhuǎn)錄及其他下游的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。

背景技術(shù)：

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)的不斷涌現(xiàn)，生物學(xué)研究已經(jīng)跨入后基因組時(shí)代，轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為一個(gè)率先發(fā)展起來的技術(shù)開始在生物學(xué)前沿研究中得到了廣泛的應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)，是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從rna水平研究基因表達(dá)的情況。轉(zhuǎn)錄組即一個(gè)活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有rna的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。從生物材料中獲得高質(zhì)量的rna不僅是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的前提，也是后續(xù)rt-pcr、northern雜交、cdna文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，提取總rna的方法有trizol提取法、苯酚法、異硫氰酸胍法和ctab法。但是由于rna酶的廣泛存在和難以滅活的頑固本性，使得rna的抽提純化和后續(xù)工作特別困難。雖然trizol試劑和各類rna抽提純化試劑盒的廣泛應(yīng)用使得rna抽提和純化不再特別困難，但是這些提取方法普遍存在提取耗時(shí)、提取純度不高、提取產(chǎn)量低或提取失敗等各種問題。到目前為止，涉及rna提取的工作仍然是分子生物學(xué)研究中最難以克服的難題。其中，植物材料總rna的提取更是一個(gè)有待解決的分子生物學(xué)上的難題。這是因?yàn)橹参锊牧嫌绕涫侵参锏墓麑?shí)中存在大量的多酚和多糖化合物，它們和植物中的rna結(jié)合形成一種復(fù)合物，從而嚴(yán)重影響到rna的提取質(zhì)量和產(chǎn)量。曾有報(bào)道指出有些rna的提取方法可運(yùn)用于富含多酚和多糖的材料，包括使用pvp和乙醇沉淀，鹽酸胍，異丙醇等。但是，我們用這些方法在提取植物果實(shí)的rna時(shí)，仍不能得到滿意的結(jié)果。因此迫切需要一種簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)且通用性較好的適用于總rna的提取方法。我們通過多次實(shí)驗(yàn)，最終研制出酚-異硫氰酸胍結(jié)合硅基質(zhì)柱的方法的試劑盒，使用本試劑盒不僅成功地從植物各種組織包括果實(shí)中提取到了高質(zhì)量的總rna，而且還可以從抗凝全血等多種材料中提取高純度高質(zhì)量的總rna。提取的總rna經(jīng)過檢測(cè)顯示，完整性和純度可以滿足進(jìn)一步rt-pcr的實(shí)驗(yàn)要求以及相關(guān)的下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明專利目的之一是提供一種應(yīng)用于植物總rna提取的試劑盒及方法；

本發(fā)明專利目的之二是提供一種應(yīng)用于富含多糖多酚等雜質(zhì)的植物總rna提取試劑盒及方法；

本發(fā)明專利目的之三是提供一種應(yīng)用于植物根、莖、葉、花、果實(shí)不同部位的總rna提取試劑盒；

本發(fā)明專利目的之四是提供一種應(yīng)用于動(dòng)物組織總rna提取試劑盒及方法；

本發(fā)明專利目的之五是提供一種應(yīng)用于微生物(主要包括酵母菌和細(xì)菌)總rna提取試劑盒及方法；

本發(fā)明專利目的之六是提供一種應(yīng)用于抗凝全血總rna提取試劑盒及方法；

本發(fā)明專利的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

細(xì)胞中的rna大多與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。因此，提取rna的一個(gè)重要步驟就是除去與之結(jié)合的蛋白質(zhì)。高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如異硫氰酸胍、鹽酸胍等)的裂解方法，是抽提rna的首選?？俽na的抽提最重要的是快速裂解細(xì)胞，釋放出rna。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，繼而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的rna酶，確保了rna的完整性。本試劑盒主要采用了高濃度的異硫氰酸胍作為蛋白質(zhì)變性劑。除此之外，我們還使用了其他的蛋白質(zhì)變性劑，目前經(jīng)常使用的離子型蛋白質(zhì)變性劑主要有十二烷基硫酸鈉(sds)和十二烷基肌氨酸鈉(sls)，在提取rna的過程中為了抑制生物材料自身體內(nèi)rna的降解，一般都采用低溫進(jìn)行提取，但是由于sds在低溫不能溶解于緩沖液體系而不能充分發(fā)揮作用，因此一般選擇可在低溫溶解而且對(duì)蛋白質(zhì)變性作用較弱的sls作為離子型去垢劑使用可以大大提高蛋白質(zhì)的提取效率，使用濃度一般不能高于2％。因此，我們?cè)诒驹噭┖衦na裂解rap1中添加了0.2％十二烷基肌氨酸鈉(sls)作為加強(qiáng)性的蛋白質(zhì)變性劑。酸性苯酚可促使rna進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣rna與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和dna分離開。水相層(無色)主要為rna，有機(jī)層(黃色)主要為dna何蛋白質(zhì)。本試劑盒采用了總量為50％的水飽和酚作為rna分離劑。高濃度的醋酸鈉促進(jìn)核酸的聚集以及與硅基質(zhì)柱的結(jié)合，在明顯增加rna結(jié)合量的同時(shí)大大降低了生產(chǎn)成本。進(jìn)一步，本發(fā)明專利產(chǎn)品提供了一種薄型的并可最大限度吸附rna的硅基質(zhì)吸附柱。我們制作的rna硅基質(zhì)吸附柱是采用新型的硅基質(zhì)材料制成薄型rna吸附柱，在高鹽、低ph緩沖系統(tǒng)下可以高效、專一地吸附rna；在低鹽、高ph值緩沖液體系中釋放rna，在幾分鐘之內(nèi)即可回收rna。具有快速、方便、避免有機(jī)溶劑的污染等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且因?yàn)槭潜⌒臀街軌蚝?jiǎn)便地最大限度的去除rna提取過程中存在的色素油脂等雜質(zhì)。從而得到純度很高的總rna。

綜上所述，針對(duì)現(xiàn)有的總rna提取所存在的各種缺陷，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，并經(jīng)過長(zhǎng)期，反復(fù)多次試驗(yàn)，提供了獨(dú)特的并可最大限度抑制rna酶活性并浸提出生物樣本組織中的總rna的提取緩沖液體系(即rap1)及薄型并可最大限度吸附rna的硅基質(zhì)吸附柱。基于以上技術(shù)方案研制出的通用型總rna提取試劑盒，提取的rna總量平均≥10μg，od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求。此外，本試劑盒操作非常簡(jiǎn)單方便快速，30分鐘即可從生物樣本中成功提取高質(zhì)量的總rna。

參考文獻(xiàn)

張曉麗代紅軍植物rna提取方法的研究進(jìn)展《北方園藝》2014年08期

附圖說明

圖1、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取不同植物種類大麥葉片、玉米葉片、水稻葉片(日本腈)、高粱葉片、大豆葉片、泡桐葉片、番茄葉片、蒲公英葉片、綠蘿葉片總rna后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道1：m代表dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶對(duì)應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：大麥葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道3：玉米葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道4：水稻葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道5：高粱葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道6：大豆葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道7：泡桐葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道8：番茄葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道9：蒲公英葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道10：綠蘿葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

圖2、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取的植物不同部位水稻根、水稻莖、蒲公英花、番茄果實(shí)的rna的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道1：m代表dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶對(duì)應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：水稻根提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道3：水稻莖提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道4：水稻葉片提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道5：蒲公英花提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道6：番茄果實(shí)提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

圖3、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取的動(dòng)物組織牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝組織、小鼠肺組織、大鼠胰腺組織、大鼠腮腺、豬肉、羊肉的rna的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道1：m代表rna分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶對(duì)應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：牦牛肺組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道3：牦牛肝組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道4：小鼠肝組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道5：小鼠肺組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道6：大鼠胰腺組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道7：大鼠腮腺組織提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道8：豬肉提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道9：羊肉提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

圖4、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取的微生物的總rna的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道1：m代表rna分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶對(duì)應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：大腸桿菌1提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道3：大腸桿菌2提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道4：酵母菌1提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道5：酵母菌2提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

圖5、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取的抗凝全血總rna的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道1：m代表rna分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶對(duì)應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：抗凝全血1提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

泳道3：抗凝全血2提取的總rna瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

表1、使用本公司研發(fā)的簡(jiǎn)單高效通用型rna提取試劑盒提取的全部總rna濃度檢測(cè)表；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明專利，本發(fā)明專利的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明專利構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明專利的范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均屬于本發(fā)明專利的保護(hù)范圍內(nèi)。

1、實(shí)驗(yàn)材料：大麥葉片、玉米葉片、水稻葉片(日本腈)、高粱葉片、大豆葉片、泡桐葉片、番茄葉片、蒲公英葉片、綠蘿葉片、水稻根、水稻莖、蒲公英花、番茄果實(shí)、牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝組織、小鼠肺組織、大鼠胰腺組織、大鼠腮腺、豬肉、羊肉、小鼠抗凝全血、酵母菌、細(xì)菌

2、實(shí)驗(yàn)試劑

水飽和酚：美國amresco公司

dna分子量標(biāo)準(zhǔn)：寶生物工程(大連)有限公司

西班牙瓊脂糖biowestagarose：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司

冰醋酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

gelgreen熒光染料：美國biotium公司

tris鹽：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司

鹽酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

異硫氰酸胍：美國amresco公司

醋酸鈉：美國amresco公司

硅基質(zhì)膜：杭州萊楓生物科技有限公司

無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

edta-na2(乙二胺四乙酸二鈉)：美國mpbiomedicals公司

氯化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

十二烷基肌氨酸鈉(sls)：美國amresco公司

焦碳酸二乙酸(depc)：美國amresco公司

3、主要實(shí)驗(yàn)儀器：

小型臺(tái)式高速離心機(jī)：美國sigma公司

nanoq^tm微型分光光度計(jì)：博奧生物有限公司

凝膠成像系統(tǒng)：美國biorad公司

水平電泳槽：北京百晶生物技術(shù)有限公司

4、主要試劑的配制

rap1緩沖液：50％飽和酚，2～4.5m異硫氰酸胍，0.2％十二烷基肌氨酸鈉(sls)，0.2mnaac(ph5.2)。

rapw漂洗液：70～80％無水乙醇。

rna洗脫緩沖液：0.1％depc濃度的去離子水37℃孵育過夜后，121℃條件下滅菌20分鐘。

實(shí)施例1

1、實(shí)驗(yàn)方法

將大麥葉片、玉米葉片、水稻葉片(日本腈)、高粱葉片、大豆葉片、泡桐葉片、番茄葉片、蒲公英葉片、綠蘿葉片在液氮中研磨成粉狀。

取0.05g粉末置于加有1mlrap1裂解液的離心管中，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，其間渦旋3-4次。

加入200μl三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置10分鐘。其間渦旋3-4次。13000rpm，4℃離心15分鐘。

吸取500μl上清，加入500μl異丙醇，輕柔混勻。

將上一步所得混合物(溶液和可能出現(xiàn)的絮狀沉淀)都加入一個(gè)吸附柱rb(rna吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，吸附柱rb放入收集管中。

向吸附柱rb中加入700μlraw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中。

向吸附柱rb中加入500μlaw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中。

將吸附柱rb放入收集管中，13,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

將吸附住rb轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，打開管蓋并于室溫放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

向吸附柱的膜中央部位滴加50μl加熱至65℃的rna洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

rna提取完成后取1μl使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna濃度及純度。

配制0.8％的瓊脂糖凝膠，上樣量1μl進(jìn)行電泳，電壓100v檢測(cè)rna。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)施例1中所述的方法一次性提取了不同植物材料葉片的總rna并測(cè)定了rna濃度和純度以及采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了rna的完整性。rna凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rna完整性良好，純度高，無雜質(zhì)影響(圖1)。使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna純度及濃度結(jié)果顯示，代表rna純度的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求。。數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為，使用本發(fā)明專利即一種簡(jiǎn)單高效通用型總rna提取試劑盒可以從不同種類的植物葉片材料中提取到高純度高質(zhì)量的rna(表1中編號(hào)1-9數(shù)據(jù))。

實(shí)施例2、

1、實(shí)驗(yàn)方法

取水稻葉片、水稻根、水稻莖、蒲公英花、番茄果實(shí)粉末0.05g置于加有1mlrap1裂解液的離心管中，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，其間渦旋3-4次。

加入200μl三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置10分鐘。其間渦旋3-4次。13000rpm，4℃離心15分鐘。

吸取500μl上清，加入500μl異丙醇，輕柔混勻。

將上一步所得混合物(溶液和可能出現(xiàn)的絮狀沉淀)都加入一個(gè)吸附柱rb(rna吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入700μlraw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入500μlaw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

將吸附柱rb放入收集管中，13,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；

將吸附住rb轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，打開管蓋并于室溫放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；

向吸附柱的膜中央部位滴加50μl加熱至65℃的rna洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中；

rna提取完成后取1μl使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna濃度及純度；

配制0.8％的瓊脂糖凝膠，上樣量1μl進(jìn)行電泳，電壓100v檢測(cè)rna。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)施例2中所述的方法一次性提取了水稻葉片、水稻根、水稻莖、蒲公英花、番茄果實(shí)的總rna并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了rna的完整性及測(cè)定了rna濃度和純度。rna凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有材料提取的rna完整性良好，純度高，無雜質(zhì)影響(圖2)。使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定所提取到的rna濃度及純度，代表rna純度的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求(表1中編號(hào)10-14數(shù)據(jù))，這個(gè)結(jié)果表示出本試劑盒適用于植物不同部位的總rna提取。

實(shí)施例3、

1、實(shí)驗(yàn)方法

取牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝組織、小鼠肺組織、大鼠胰腺組織、大鼠腮腺、豬肉、羊肉組織在液氮中研磨成粉末，取0.05g置于加有1mlrap1裂解液的離心管中，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，其間渦旋34次。

加入200μl三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置10分鐘。其間渦旋3-4次。13000rpm，4℃離心15分鐘。

吸取500μl上清，加入500μl異丙醇，輕柔混勻。

將上一步所得混合物(溶液和可能出現(xiàn)的絮狀沉淀)都加入一個(gè)吸附柱rb(rna吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入700μlraw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入500μlaw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

將吸附柱rb放入收集管中，13,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；

將吸附住rb轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，打開管蓋并于室溫放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；

向吸附柱的膜中央部位滴加50μl加熱至65℃的rna洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中；

rna提取完成后取1μl使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna濃度及純度；

配制0.8％的瓊脂糖凝膠，上樣量1μl進(jìn)行電泳，電壓100v檢測(cè)rna。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)施例3中所述的方法一次性提取了牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝組織、小鼠肺組織、大鼠胰腺組織、大鼠腮腺、豬肉、羊肉組織的總rna并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了rna的完整性及測(cè)定了rna濃度和純度。rna凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有材料提取的rna完整性良好，純度高，無雜質(zhì)影響(圖2)。使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定所提取到的rna濃度及純度，代表rna純度的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求(表1中編號(hào)15-22數(shù)據(jù))，這個(gè)結(jié)果表示出本試劑盒適用于不同動(dòng)物組織及的部位的總rna提取。

實(shí)施例4、

1、實(shí)驗(yàn)方法

將酵母菌和細(xì)菌在液氮中研磨成粉狀，取0.05g粉末置于加有1mlrap1裂解液的離心管中，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，其間渦旋3-4次。

加入200μl三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置10分鐘。其間渦旋3-4次。13000rpm，4℃離心15分鐘。

吸取500μl上清，加入500μl異丙醇，輕柔混勻。

將上一步所得混合物(溶液和可能出現(xiàn)的絮狀沉淀)都加入一個(gè)吸附柱rb(rna吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入700μlraw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入500μlaw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

將吸附柱rb放入收集管中，13,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；

將吸附住rb轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，打開管蓋并于室溫放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；

向吸附柱的膜中央部位滴加50μl加熱至65℃的rna洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中；

rna提取完成后取1μl使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna濃度及純度；

配制0.8％的瓊脂糖凝膠，上樣量1μl進(jìn)行電泳，電壓100v檢測(cè)rna。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)施例4中所述的方法一次性提取了酵母菌和細(xì)菌總rna并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了rna的完整性及測(cè)定了rna濃度和純度。rna凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有材料提取的rna完整性良好，純度高，無雜質(zhì)影響(圖4)。使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定所提取到的rna濃度及純度，代表rna純度的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求(表1中編號(hào)23-26數(shù)據(jù))，這個(gè)結(jié)果表示出本試劑盒適用不同種類的微生物總rna提取。

實(shí)施例5、

1、實(shí)驗(yàn)方法

小鼠全抗凝血液100μl中加入900μlrap1裂解液的離心管中，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，其間渦旋3-4次。

加入200μl三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置10分鐘。其間渦旋3-4次。13000rpm，4℃離心15分鐘。

吸取500μl上清，加入500μl異丙醇，輕柔混勻。

將上一步所得混合物都加入一個(gè)吸附柱rb(rna吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入700μlraw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

向吸附柱rb中加入500μlaw漂洗液，12,000rpm離心30秒鐘，倒掉廢液，將吸附柱rb放入收集管中；

將吸附柱rb放入收集管中，13,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；

將吸附住rb轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，打開管蓋并于室溫放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；

向吸附柱的膜中央部位滴加50μl加熱至65℃的rna洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中；

rna提取完成后取1μl使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定rna濃度及純度；

配制0.8％的瓊脂糖凝膠，上樣量1μl進(jìn)行電泳，電壓100v檢測(cè)rna。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)施例5中所述的方法一次性提取了小鼠抗凝全血總rna并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了rna的完整性及測(cè)定了rna濃度和純度。rna凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有材料提取的rna完整性良好，純度高，無雜質(zhì)影響(圖5)。使用nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧生物有限公司)測(cè)定所提取到的rna濃度及純度，代表rna純度的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果為od260/od280＝1.8～2.0，od260/od230＞1.8，大大滿足分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)總rna產(chǎn)量及質(zhì)量的要求(表1中編號(hào)27-28數(shù)據(jù))，這個(gè)結(jié)果表示這種簡(jiǎn)單高效通用型總rna提取試劑盒適用于全抗凝血的總rna提取。