轉(zhuǎn)換共刺激受體的制作方法

文檔序號(hào)：11766698閱讀：266來源：國知局

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本申請(qǐng)是發(fā)明名稱為“轉(zhuǎn)換共刺激受體”、申請(qǐng)?zhí)枮椤?01280041432.6”、申請(qǐng)日為2012年7月27日的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2011年7月29日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)61/513,259的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的內(nèi)容整體通過引用并入本文。

本發(fā)明背景

免疫系統(tǒng)的一般原理是t細(xì)胞感知其微環(huán)境，然后取決于它們所感知的信號(hào)，或是被激活或是被抑制。cd28基因家族由傳遞陽性信號(hào)的2個(gè)基因(cd28和icos)，以及遞送陰性信號(hào)的3個(gè)基因(ctla4、pd-1和btla)組成(riley等人,2005,blood105:13-21)。pd-1的配體是pdl1和pdl2。眾所周知，pd-1配體經(jīng)常在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)，并且t細(xì)胞上的pd-1與pdl1或pdl2的接合可以導(dǎo)致t細(xì)胞失活。

此時(shí)，防止由pd-1或btla配體遞送的陰性信號(hào)的僅有方式是得到與pd-1或btla結(jié)合的拮抗性抗體或融合蛋白，這是一種現(xiàn)在正在早期臨床試驗(yàn)中測(cè)試的方式(cheever等人,2008,immunolrev222:357-68)。另一方式將是得到可能抑制pd-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或btla信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物。當(dāng)前防止pd-1滅活t細(xì)胞的方式是用pd-1拮抗性抗體對(duì)患者進(jìn)行全身治療。

上述方式兩者均具有局限性，因?yàn)轳v留在腫瘤微環(huán)境以及整個(gè)免疫系統(tǒng)中的t細(xì)胞都免于所述全身治療所導(dǎo)致的滅活，并且預(yù)期這會(huì)在一些患者中導(dǎo)致自身免疫或全身炎癥反應(yīng)綜合征(beck等人,2006,jclinoncol24:2283-9；blansfield等人,2005,jimmunother28:593-8；dougan等人,2009,annualreviewofimmunology27:83-117)。

因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于用于過繼療法的有效形式的組合物和方法存在迫的需求。本發(fā)明解決了這種需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了這樣的融合蛋白，其包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中第一結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽，第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分，第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的至少一部分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白還包含跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域或與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽選自ctla4、pd-1和btla。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽選自cd28和icos。

本發(fā)明還提供了被改造以表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞，所述融合蛋白包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽，所述第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還包含嵌合抗原受體(car)，其中所述car包含特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和cd3-ζ鏈的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明還提供了這樣的載體，其包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽，所述第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽。

本發(fā)明提供了治療癌癥患者的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括向所述患者施用被遺傳改造以表達(dá)融合蛋白的t細(xì)胞，融合蛋白包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中第一結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽，且第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，t細(xì)胞被進(jìn)一步遺傳改造以表達(dá)car，其中所述car包含特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和cd3-ζ鏈的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，t細(xì)胞是自體t細(xì)胞。

附圖簡(jiǎn)述

當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述將得到更好的理解。為了說明本發(fā)明，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于在附圖中所示的實(shí)施方案的準(zhǔn)確配置和手段。

圖1，包括圖1a至1c，是證明btla信號(hào)可以以嵌合共刺激受體(ccr)或另外地稱為轉(zhuǎn)換受體的形式被轉(zhuǎn)變成其他信號(hào)的一系列圖像。圖1a是描繪嵌合轉(zhuǎn)換受體的示意性圖示的圖像。圖1b是證明在所指示的不同時(shí)刻通過hvem-fc融合蛋白檢測(cè)到btla的表面表達(dá)的圖像。圖1c是描繪由電穿孔的t細(xì)胞產(chǎn)生的il-2的圖像，所述t細(xì)胞用btla配體陰性細(xì)胞系(ktplocd86a2)或btla配體hvem陽性細(xì)胞系(ktplocd86a2hvem)刺激。刺激后24小時(shí)，通過elisa測(cè)定il的產(chǎn)生。結(jié)果顯示通過將btla胞外結(jié)構(gòu)域與icos和cd3ζ兩者的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，t細(xì)胞可以通過刺激表達(dá)btla配體的hvem的細(xì)胞系而被激活，表明btla信號(hào)可以以嵌合共刺激受體的形式轉(zhuǎn)變成其它信號(hào)。

圖2，包括圖2a至2c，是證明btla信號(hào)可以通過btla-cd28ccr被轉(zhuǎn)變成cd28信號(hào)的一系列圖像。

圖3，包括圖3a和3b，是證明btla信號(hào)可以通過btla-icosccr轉(zhuǎn)變成icos信號(hào)的一系列圖像。結(jié)果顯示，由btla-icos轉(zhuǎn)變的icos信號(hào)增加th17細(xì)胞產(chǎn)生。

圖4，包括圖4a至4d，是證明pd1信號(hào)可以轉(zhuǎn)變成cd28信號(hào)的一系列圖像。

圖5，包括圖5a和5c，是證明由于pd1-cd28ccr共同引入逆轉(zhuǎn)pd1抑制的一系列圖像。

圖6，包括圖6a至6c，是證明pd1信號(hào)轉(zhuǎn)變成icos信號(hào)的一系列圖像。

圖7是證明pd1wt對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制性作用被pd1嵌合構(gòu)建物拯救的圖像。

圖8是證明pd-1嵌合受體不影響粒酶b產(chǎn)生的圖像。

圖9是證明在存在或不存在pd1時(shí)觀察到cd8t細(xì)胞的殺傷活性的最小差異的圖像。

圖10是顯示pd-1嵌合受體對(duì)t細(xì)胞增殖的作用的圖像。

圖11是顯示pd1-cd28嵌合受體增加cd8t細(xì)胞的數(shù)目的圖像。

詳述

本發(fā)明大體上涉及融合蛋白受體，當(dāng)展示在細(xì)胞上時(shí)其可以將傳輸至細(xì)胞的陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。該融合蛋白是嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中第一結(jié)構(gòu)域是與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽以及第二結(jié)構(gòu)域是與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制性因子并且激活所述融合蛋白，其中信號(hào)通過第二結(jié)構(gòu)域發(fā)送，產(chǎn)生傳輸至細(xì)胞的陽性信號(hào)。以此方式，融合蛋白能夠?qū)⒓?xì)胞中另外的陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。因此，本發(fā)明可以被認(rèn)為涵蓋轉(zhuǎn)換受體，所述轉(zhuǎn)換受體能夠?qū)㈥幮孕盘?hào)轉(zhuǎn)換為陽性信號(hào)以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的增強(qiáng)可以治療與免疫應(yīng)答不足相關(guān)的疾病。

本發(fā)明基于下列的發(fā)現(xiàn)：t細(xì)胞可以被改造以表達(dá)轉(zhuǎn)換受體以便利用這樣的事實(shí)：t細(xì)胞能夠感知其微環(huán)境從而根據(jù)它們所感知的信號(hào)被激活或抑制。例如，本發(fā)明利用這樣的事實(shí)：在腫瘤微環(huán)境中存在抑制t細(xì)胞活性的配體。t細(xì)胞被改造以表達(dá)轉(zhuǎn)換受體，其中第一結(jié)構(gòu)域能夠被腫瘤微環(huán)境中的抑制性配體激活，并且借助于通過轉(zhuǎn)換受體的第二結(jié)構(gòu)域的信號(hào)將傳輸至t細(xì)胞的另外的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為陽性信號(hào)。因此，本發(fā)明提供了一種療法，其提供改善的治療指數(shù)，具有較少的毒性以及提供有效的一次治療的能力，并且避免了繼續(xù)施用抗體的需要。

在一些情況下，細(xì)胞在被施用于需要其的患者之前被遺傳修飾。優(yōu)選地，細(xì)胞可以被遺傳修飾以穩(wěn)定地表達(dá)本發(fā)明所需的轉(zhuǎn)換受體。在其他情況下，細(xì)胞可以被進(jìn)一步修飾以在其表面上表達(dá)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，賦予新的抗原特異性，所述抗原特異性是mhc非依賴性的(例如，嵌合抗原受體(car))。car將特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與cd3-ζ鏈或fcγri蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合成單一嵌合蛋白質(zhì)。在此背景下，細(xì)胞被改造以表達(dá)轉(zhuǎn)換受體和car兩者。

本發(fā)明的修飾細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生長期持久性，可以形成持續(xù)的腫瘤控制。

本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體的方法，以及在癌癥的研究和治療中使用這些轉(zhuǎn)換受體的方法。

定義

除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管可在測(cè)試本發(fā)明的實(shí)踐中使用類似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但優(yōu)選的材料和方法在本文中進(jìn)行描述。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明中，將使用以下術(shù)語。

也應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式的目的，并不意欲是限制性的。

本文使用冠詞“一(a)”和“一(an)”，指的是該冠詞語法對(duì)象的一個(gè)或多于一個(gè)(即，指的是至少一個(gè))。以例子說明，“一元件”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)的元件。

如本文使用的“大約”，當(dāng)指的是可測(cè)量的值諸如量、時(shí)間持續(xù)時(shí)間等時(shí)，意指涵蓋從指定值±20％或±10％的變化，更優(yōu)選±5％，甚至更優(yōu)選±1％，和還要更優(yōu)選±0.1％的變化，只要這種變化適于實(shí)施公開的方法。

術(shù)語“抗體”，如本文所用的，指的是與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可為源于天然來源或源于重組來源的完整的免疫球蛋白，并可為完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)部分?？贵w通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、fv、fab和f(ab)2，以及單鏈抗體和人源化抗體(harlow等人,1999,見:usingantibodies:alaboratorymanual(使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等人,1989,見:antibodies:alaboratorymanual(抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),coldspringharbor,newyork；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等人,1988,science242:423-426)。

如本文所用的術(shù)語“抗原”或“ag”被定義為激發(fā)免疫應(yīng)答的分子。該免疫應(yīng)答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞的激活，或兩者。技術(shù)人員將理解任何大分子，實(shí)際上包括所有的蛋白質(zhì)或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組dna。技術(shù)人員將理解任何dna(包括編碼引起免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列)因此編碼“抗原”，如該術(shù)語在本文中使用那樣。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不必僅由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是，本發(fā)明包括但不限于，多于一個(gè)的基因的部分核苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以各種各樣的組合進(jìn)行排列，以引起所需的免疫應(yīng)答。此外，技術(shù)人員將理解，抗原根本不必由“基因”編碼。容易顯而易見的是，抗原可被產(chǎn)生、合成或可源自生物學(xué)樣品。這種生物學(xué)樣品可包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物學(xué)流體。

如本文所用的術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”，指的是生物學(xué)效應(yīng)，其可由腫瘤體積的減小、腫瘤細(xì)胞數(shù)的減少、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的減少、預(yù)期壽命的增加或與癌性病癥相關(guān)的各種生理癥狀的改善來顯示?！翱鼓[瘤效應(yīng)”也可由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體在預(yù)防腫瘤在首發(fā)位置出現(xiàn)的能力來顯示。

如本文所用的，術(shù)語“自體”可以用來指源自相同個(gè)體、隨后被再次引入該個(gè)體的任何物質(zhì)。

“同種異體的(allogeneic)”指的是源自相同物種的不同動(dòng)物的移植物。

“異種的(xenogeneic)”指的是源自不同物種的動(dòng)物的移植物。

如本文所用的，“生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性”是指根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白，其具有與作為本發(fā)明的融合蛋白的結(jié)構(gòu)單元的單一野生型蛋白相似的結(jié)構(gòu)功能(但不一定達(dá)到相同程度)，和/或相似的調(diào)控功能(但不一定達(dá)到相同程度)，和/或相似的生物化學(xué)功能(但不一定達(dá)到相同程度)和/或免疫學(xué)活性(但不一定達(dá)到相同程度)。

如本文所用的術(shù)語“癌癥”被定義為以畸變細(xì)胞的快速和失控生長為特征的疾病。癌癥細(xì)胞可局部播散或通過血流和淋巴系統(tǒng)播散至身體的其他部分。各種癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

“嵌合蛋白”是指任何單一多肽單元，其包含兩個(gè)不同的多肽結(jié)構(gòu)域，其中所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不是該相同多肽單元內(nèi)天然存在的。典型地，此嵌合蛋白通過表達(dá)cdna構(gòu)建體來制備，但可以通過本領(lǐng)域中已知的蛋白合成方法制備。

如本文所用的術(shù)語“衍生物”就氨基酸序列而言是指本發(fā)明的融合蛋白的化學(xué)修飾。

“編碼”指的是多核苷酸諸如基因、cdna或mrna中用作用于合成生物學(xué)過程中的其他多聚體和大分子的模板的核苷酸的特異性序列的固有性質(zhì)，所述多聚體和大分子具有定義的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或定義的氨基酸序列中的任一個(gè)以及由其得到的生物學(xué)性質(zhì)。因此，如果對(duì)應(yīng)于編碼蛋白的基因的mrna的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼所述蛋白質(zhì)。其核苷酸序列與mrna序列相同并通常提供在序列表中的編碼鏈，和用作轉(zhuǎn)錄基因或cdna的模板的非編碼鏈兩者，都可被稱為編碼該基因或cdna的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。

除非另有規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此的簡(jiǎn)并形式并編碼相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)或rna的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。

“有效量”或“治療有效量”在本文中可互換使用，并且指的是如本文所述有效實(shí)現(xiàn)特定生物學(xué)結(jié)果的化合物、制劑、材料或組合物的量。這種結(jié)果可以包括，但不限于，如通過本領(lǐng)域中合適的任何方式測(cè)定的對(duì)病毒感染的抑制。

如本文所用的“內(nèi)源的”指的是來自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)的或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文所用的，術(shù)語“外源的”指的是從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外引入的或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文所用的術(shù)語“表達(dá)”被定義為由它的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

“表達(dá)載體”指的是包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包含可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包含足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其他元件可由宿主細(xì)胞供應(yīng)或在體外表達(dá)系統(tǒng)中供應(yīng)。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域己知的那些，諸如整合了重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露的或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。

如本文所用的，術(shù)語“融合蛋白”指的是包含兩個(gè)或更多個(gè)不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列的嵌合蛋白。典型地，由本領(lǐng)域中熟知的體外重組技術(shù)獲得融合蛋白。

“同源的”，如本文所用的，指的是兩個(gè)聚合分子之間，例如，兩個(gè)核酸分子諸如兩個(gè)dna分子或兩個(gè)rna分子之間，或兩個(gè)多肽分子之間的亞單位序列同一性。當(dāng)兩個(gè)分子兩者中的亞單位位置被相同的單體亞單位占據(jù)時(shí)；例如，如果兩個(gè)dna分子的每一個(gè)中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則它們?cè)谀莻€(gè)位置處是同源的。兩個(gè)序列之間的同源性是匹配或同源的位置數(shù)的直接函數(shù)；例如，如果兩個(gè)序列中的位置的一半(例如，多聚體10個(gè)亞單位長度中的5個(gè)位置)是同源的，則兩個(gè)序列是50％同源的；如果所述位置的90％(例如10個(gè)中的9個(gè))是匹配的或同源的，則兩個(gè)序列是90％同源的。

術(shù)語“免疫反應(yīng)”，如本文中所用的，是指刺激和/或激活免疫細(xì)胞的可檢測(cè)結(jié)果。

“免疫應(yīng)答”，如該術(shù)語在本文中使用那樣，指的是導(dǎo)致激活和/或引起t細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞和/或抗原遞呈細(xì)胞的任一個(gè)中的效應(yīng)器功能的過程。因此，免疫應(yīng)答，如技術(shù)人員將要理解的那樣，包括，但不限于，輔助t細(xì)胞或細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答的任何可檢測(cè)到抗原特異性或同種異體激活、抗體產(chǎn)生、t細(xì)胞介導(dǎo)的同種異體反應(yīng)的激活，等等。

“免疫細(xì)胞”，如該術(shù)語在本文中使用那樣，指的是參與免疫應(yīng)答的發(fā)起的任何細(xì)胞。此類細(xì)胞包括，但不限于，t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞，等。

如本文所用的，“指導(dǎo)材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其他可用于傳達(dá)本發(fā)明組合物和方法的有用性的表達(dá)媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)材料可例如被附加在包含本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器上，或與包含所述核酸、肽和/或組合物的容器一起運(yùn)送。可選地，指導(dǎo)材料可與容器分開地運(yùn)送，目的是指導(dǎo)材料和化合物由接受者配合使用。

“分離的”指從自然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動(dòng)物中的核酸或肽不是“分離的”，但與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)部分或完全分離的同一核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或例如，可存在于非自然環(huán)境，諸如宿主細(xì)胞中。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，對(duì)于通常存在的核酸堿基使用以下縮寫?！癮”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鳥苷，“t”指的是胸苷，和“u”指的是尿苷。

除非另有規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此的簡(jiǎn)并版本并編碼相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或rna的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子，其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可在某些版本中包含(一個(gè)或多個(gè))內(nèi)含子。

如本文所用的“慢病毒”指的是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的屬。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細(xì)胞的；它們可傳遞顯著量的遺傳信息進(jìn)入宿主細(xì)胞的dna，以便它們是基因傳遞載體的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv是慢病毒的所有例子。源自慢病毒的載體提供了實(shí)現(xiàn)顯著水平的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的工具。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”免疫應(yīng)答，如本文所用的，是指與缺少治療或化合物的哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答水平相比，和/或與在其他方式相同但未治療的哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答水平的可檢測(cè)到的增加或減少。該術(shù)語涵蓋擾亂和/或影響天然信號(hào)或應(yīng)答，由此介導(dǎo)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中的有益的治療性應(yīng)答。

“陰性信號(hào)”，如本文所使用的，是指誘發(fā)與減少增殖、減少激活、減少細(xì)胞處理等相關(guān)的胞內(nèi)事件的經(jīng)典級(jí)聯(lián)的信號(hào)。

“陽性信號(hào)”，如本文所使用的，是指誘發(fā)與增加增殖、增加激活、增加細(xì)胞處理等相關(guān)的胞內(nèi)事件的經(jīng)典級(jí)聯(lián)的信號(hào)。

術(shù)語“可操作地連接”指的是調(diào)控序列和異源核酸序列之間的功能性連接，其導(dǎo)致后者的表達(dá)。例如，當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄斜环胖靡耘c第二核酸序列具有功能關(guān)系時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子被可操作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的dna序列是連續(xù)的，并且在必要時(shí)在相同的閱讀框中連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)。

免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、肌肉內(nèi)(i.m.)或胸骨內(nèi)注射，或輸注技術(shù)。

如本文所用的術(shù)語“多核苷酸”被定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸的多聚體。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸為可被水解成單體“核苷酸”的多核苷酸的一般常識(shí)。單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域中可用的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重組手段，即，利用普通克隆技術(shù)和pcr^tm等等從重組文庫或細(xì)胞基因組克隆核酸序列，和通過合成手段。

如本文所用的，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并指的是由肽鍵共價(jià)連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個(gè)氨基酸，和對(duì)可包括蛋白質(zhì)或肽的序列的氨基酸最大數(shù)目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)包括通過肽鍵相互連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸。如本文所用的，該術(shù)語指的是短鏈和較長鏈，短鏈在本領(lǐng)域中也例如通常被稱為肽、寡肽和寡聚體；較長鏈在本領(lǐng)域中通常被稱為蛋白質(zhì)，其具有很多類型?！岸嚯摹卑ɡ缟飳W(xué)活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”被定義為啟動(dòng)多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄需要的，由細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識(shí)別的dna序列。

如本文所用的，術(shù)語“啟動(dòng)子/調(diào)控序列”指可操作地連接至啟動(dòng)子/調(diào)控序列的基因產(chǎn)物表達(dá)所需的核酸序列。在一些例子中，該序列可為核心啟動(dòng)子序列，并且在其他例子中，該序列也可包括基因產(chǎn)物表達(dá)所需的增強(qiáng)子序列和其他調(diào)控元件。啟動(dòng)子/調(diào)控序列可例如為以組織特異方式表達(dá)基因產(chǎn)物的序列。

“組成型”啟動(dòng)子為這樣的核苷酸序列，其當(dāng)與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí)，使得在細(xì)胞的大多數(shù)或所有生理學(xué)條件下在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子為這樣的核苷酸序列，其當(dāng)與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí)，使得在基本上僅當(dāng)對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物存在于細(xì)胞中時(shí)，在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“組織特異性”啟動(dòng)子為這樣的核苷酸序列，其當(dāng)與編碼基因或由基因指定的多核苷酸可操作地連接時(shí)，使得基本上只要細(xì)胞為對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的組織類型的細(xì)胞，則在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

術(shù)語“對(duì)象”意欲包括在其內(nèi)可引起免疫應(yīng)答的活生物體(例如，哺乳動(dòng)物)。

如本文所用的“基本上純化的”細(xì)胞為基本上不含其他細(xì)胞類型的細(xì)胞?；旧霞兓募?xì)胞也指的是已經(jīng)與在其天然存在狀態(tài)下與其正常相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞類型分離的細(xì)胞。在一些例子中，基本上純化的細(xì)胞群指的是均質(zhì)細(xì)胞群。在其他例子中，該術(shù)語簡(jiǎn)單地指的是已經(jīng)與在其天然狀態(tài)下與其正常相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在體外培養(yǎng)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，不在體外培養(yǎng)細(xì)胞。

如本文所用的術(shù)語“治療性的”是指治療和/或預(yù)防。治療性效果通過疾病狀態(tài)的抑制、緩和或根除獲得。

如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是這樣的過程，通過該過程外源的核酸被轉(zhuǎn)移或引入宿主細(xì)胞中。“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)用外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。該細(xì)胞包括原代對(duì)象細(xì)胞和它的子代。

如本文所用的短語“轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接”指啟動(dòng)子處于與多核苷酸有關(guān)的正確的位置和定向，以控制通過rna聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和多核苷酸的表達(dá)的起始。

“載體”為物質(zhì)的組合物，其包含分離的核酸，并且其可用于遞送分離的核酸至細(xì)胞內(nèi)部。很多載體在本領(lǐng)域中是己知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。該術(shù)語也應(yīng)被解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，諸如例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的例子包括但不限于，腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等等。

術(shù)語“刺激”是指通過刺激分子(例如，tcr/cd3復(fù)合物)與它的關(guān)聯(lián)配體結(jié)合，由此介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，諸如但不限于，經(jīng)由tcr/cd3復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，來誘導(dǎo)的初級(jí)應(yīng)答。刺激可介導(dǎo)某些分子的改變的表達(dá)，諸如tgf-β的下調(diào)和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織等等。

“激活”，如本文所用的，指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測(cè)到的細(xì)胞增殖的t細(xì)胞的狀態(tài)。激活也可與誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和可檢測(cè)到的效應(yīng)器功能相關(guān)聯(lián)。術(shù)語“激活的t細(xì)胞”指的是正在經(jīng)歷細(xì)胞分裂的t細(xì)胞等。激活也可以與下列相關(guān)聯(lián)：產(chǎn)生免疫應(yīng)答(例如，有絲分裂原諸如cona或pha)，可檢測(cè)地上調(diào)表面標(biāo)志物，諸如cd25，即，il2受體，起始涉及p56lck的磷酸化級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞因子和白介素的釋放，增加dna合成(所述dna合成可以通過評(píng)估³h-胸苷摻入至新生dna鏈中的水平的方法等來評(píng)估)，和使細(xì)胞增殖。

如本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指識(shí)別并結(jié)合樣品中存在的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶(例如，t細(xì)胞上存在的刺激和/或共刺激分子)蛋白的抗體或配體，但所述抗體或配體基本上不識(shí)別或結(jié)合樣品中的其他分子。

范圍：在此公開中，本發(fā)明的多個(gè)方面可以以范圍形式示出。應(yīng)當(dāng)理解，以范圍形式的描述僅是為了方便和簡(jiǎn)潔，并不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的刻板限制。因此，對(duì)范圍的描述應(yīng)被考慮為具有具體公開的所有可能的子范圍以及處于那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，對(duì)范圍諸如從l至6的描述應(yīng)被考慮為具有具體公開的子范圍諸如從l至3、從l至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這均是適用的。

描述

本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)：嵌合轉(zhuǎn)換受體可以被設(shè)計(jì)為將陰性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃孕盘?hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)換受體是嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的第一蛋白質(zhì)或其片段，和與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的第二蛋白質(zhì)或其片段。與陰性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于ctla-4、pd-1、btla等。與陽性信號(hào)相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于cd28、icos等。

本發(fā)明涉及嵌合轉(zhuǎn)換受體和相關(guān)的融合蛋白，以及利用這些蛋白質(zhì)治療癌癥的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被改造以表達(dá)嵌合轉(zhuǎn)換受體的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)，其中被改造的細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤性質(zhì)。在一些例子中，被改造的細(xì)胞還被改造以表達(dá)嵌合抗原受體(car)。在一些例子中，本發(fā)明的被改造的細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的il-2和ifn-γ產(chǎn)生。在一些例子中，本發(fā)明的被改造的細(xì)胞被極化以分泌il-17。因此，本發(fā)明的被改造的細(xì)胞當(dāng)輸注到患者中時(shí)可以在患者體內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞。

組合物

本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了轉(zhuǎn)換受體，所述轉(zhuǎn)換受體當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)將細(xì)胞中的陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。例如，此轉(zhuǎn)換受體具有第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含遞送陰性信號(hào)的多肽；所述第二結(jié)構(gòu)域包含遞送陽性信號(hào)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具有遞送陰性信號(hào)能力的多肽包括但不限于ctla4、pd-1、btla等。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有遞送陽性信號(hào)能力的多肽包括但不限于icos、cd28等。

在遞送陰性信號(hào)的多肽的情況下，合適的第一結(jié)構(gòu)域包括野生型ctla4的變體或衍生物。優(yōu)選地，此實(shí)施方案的轉(zhuǎn)換受體的第一結(jié)構(gòu)域是ctla蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分，具體地，所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的該部分對(duì)于與ctla的天然配體結(jié)合是必不可少的。胞外結(jié)構(gòu)域的野生型形式的變體，或負(fù)責(zé)與ctla的天然配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域部分也包括在本發(fā)明中，只要所述變體提供與野生型蛋白類似的生物學(xué)活性水平即可。

在遞送陰性信號(hào)的多肽的情況下，合適的第一結(jié)構(gòu)域包括野生型pd-1的變體或衍生物。優(yōu)選地，此實(shí)施方案的轉(zhuǎn)換受體的第一結(jié)構(gòu)域是pd-1蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分，具體地，所述胞外結(jié)構(gòu)域的該部分對(duì)于與pd-1的天然配體結(jié)合是必不可少的。胞外結(jié)構(gòu)域的野生型形式的變體，或負(fù)責(zé)與pd-1的天然配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域部分也包括在本發(fā)明中，只要所述變體提供與野生型蛋白類似的生物學(xué)活性水平即可。

在遞送陰性信號(hào)的多肽的情況下，合適的第一結(jié)構(gòu)域包括野生型btla的變體或衍生物。優(yōu)選地，此實(shí)施方案的轉(zhuǎn)換受體的第一結(jié)構(gòu)域是btla蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分，具體地，所述胞外結(jié)構(gòu)域的該部分對(duì)于與btla的天然配體結(jié)合是必不可少的。胞外結(jié)構(gòu)域的野生型形式的變體，或負(fù)責(zé)與btla的天然配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域部分也包括在本發(fā)明中，只要所述變體提供與野生型蛋白類似的生物學(xué)活性水平即可。

在遞送陽性信號(hào)的多肽的情況下，合適的第二結(jié)構(gòu)域包括icos蛋白的變體或衍生物。優(yōu)選地，此實(shí)施方案中的轉(zhuǎn)換受體的第二結(jié)構(gòu)域是icos蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(也稱為內(nèi)結(jié)構(gòu)域)的至少一部分，具體地，該部分對(duì)于觸發(fā)到達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分的信號(hào)是必不可少的。icos蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的野生型形式的變體，或負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的部分也包括在本發(fā)明中，只要所述變體提供與野生型蛋白類似的的生物學(xué)活性水平即可。

在遞送陽性信號(hào)的多肽的情況下，合適的第二結(jié)構(gòu)域包括cd28蛋白的變體或衍生物。優(yōu)選地，此實(shí)施方案中的轉(zhuǎn)換受體的第二結(jié)構(gòu)域是cd28蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(也稱為內(nèi)結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)的)的至少一部分，具體地，該部分對(duì)于觸發(fā)到達(dá)細(xì)胞的胞內(nèi)成分的信號(hào)是必不可少的。cd28蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的野生型形式的變體，或負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的部分也包括在本發(fā)明中，只要所述變體提供與野生型蛋白類似的的生物學(xué)活性水平即可。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體包括對(duì)應(yīng)于胞質(zhì)的、跨膜的和胞外結(jié)構(gòu)域的多肽，以及對(duì)應(yīng)于胞質(zhì)的、跨膜的和胞外結(jié)構(gòu)域的較小部分的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)換受體包含遞送陰性信號(hào)的第一多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)換受體包含遞送陽性信號(hào)的第二多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的又另一方面中，遞送本文所述的任一轉(zhuǎn)換受體的陰性信號(hào)成分的第一多肽可以用另一抑制性蛋白(即，防止免疫應(yīng)答的激活和/或誘導(dǎo)t細(xì)胞或其他細(xì)胞類型，諸如b細(xì)胞、天然殺傷(nk)細(xì)胞、nkt細(xì)胞、淋巴系祖細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、具有抗原遞呈能力的基于組織的巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞以及許多非專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞中的任一種，例如，內(nèi)皮細(xì)胞中的凋亡)替代。抑制性蛋白的實(shí)例包括但不限于pd-1、ctla-4、btla、cd160、cd161和cd94的配體；lag-3和cd244(參見2011,wherry,natimmunol.131:492-9)。

根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的遞送陰性信號(hào)的第一多肽，條件是所述多肽結(jié)合相應(yīng)的配體，并且通過此結(jié)合事件導(dǎo)致轉(zhuǎn)換受體的激活。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)換受體的遞送陰性信號(hào)的第一多肽與其相應(yīng)配體的接合導(dǎo)致該轉(zhuǎn)換受體的遞送陽性信號(hào)的第二多肽的激活。以此方式，陰性信號(hào)可以轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。即，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體的第一多肽可以觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使得本發(fā)明的第二多肽的激活導(dǎo)致陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體的第一多肽的獨(dú)特特征是其將天然地將引起到達(dá)細(xì)胞的陰性信號(hào)的天然轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)變成誘導(dǎo)細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤特征的陽性信號(hào)。

類似地，可以使用任何合適的第二多肽，條件是所述蛋白質(zhì)可以向細(xì)胞發(fā)送陽性信號(hào)，該陽性信號(hào)不同于與轉(zhuǎn)換受體的第一多肽成分相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。第二多肽可以是發(fā)送陽性信號(hào)或激活信號(hào)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二多肽的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于cd28、cd27、icos、cd137(4-1bb)和tcrζ。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了其中存在有大量抑制免疫系統(tǒng)的配體或蛋白質(zhì)的微環(huán)境，其中免疫系統(tǒng)的抑制導(dǎo)致不合乎需要的疾病狀態(tài)。即，該轉(zhuǎn)換受體可以被改造以包含第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合微環(huán)境中的免疫抑制因子并且將正常與所述免疫抑制因子相關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)，其中所述陽性信號(hào)激活細(xì)胞以表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的優(yōu)選嵌合蛋白是btla:icos。btla與icos序列的遺傳嵌合和重組表達(dá)產(chǎn)生嵌合的btla:icos“轉(zhuǎn)換受體”，其顯示了歸因于btla和icos兩者的結(jié)構(gòu)和功能特征。被改造以表達(dá)btla:icos的細(xì)胞可以將抑制性信號(hào)傳導(dǎo)重新定向?yàn)榇碳ば盘?hào)并且由此增強(qiáng)t細(xì)胞功能。在一些情況下，細(xì)胞被改造以表達(dá)btla:icos轉(zhuǎn)換受體以及car。

本發(fā)明的另一優(yōu)選嵌合蛋白是pd1:cd28。pd1與cd28序列的遺傳嵌合和重組表達(dá)產(chǎn)生嵌合的pd1:cd28“轉(zhuǎn)換受體”，其顯示了歸因于pd1和cd28兩者的結(jié)構(gòu)和功能特征。被改造以表達(dá)pd1:cd28的細(xì)胞可以將抑制性信號(hào)傳導(dǎo)重新定向?yàn)榇碳ば盘?hào)并且由此增強(qiáng)t細(xì)胞功能。在一些情況下，細(xì)胞被改造以表達(dá)pd1:cd28轉(zhuǎn)換受體以及car。

本發(fā)明的另一優(yōu)選嵌合蛋白是ctla4:cd28。ctla4與cd28序列的遺傳嵌合和重組表達(dá)產(chǎn)生嵌合的ctla4:cd28“轉(zhuǎn)換受體”，其顯示了歸因于ctla4和cd28兩者的結(jié)構(gòu)和功能特征。被改造以表達(dá)ctla4:cd28的細(xì)胞可以將抑制性信號(hào)傳導(dǎo)重新定向?yàn)榇碳ば盘?hào)并且由此增強(qiáng)t細(xì)胞功能。在一些情況下，細(xì)胞被改造以表達(dá)ctla4:cd28轉(zhuǎn)換受體以及car。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以大量形式存在。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是直鏈或支鏈多肽的形式。直鏈的嵌合蛋白可以通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生。例如，嵌合轉(zhuǎn)錄盒可以使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)重疊或基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的重疊延伸拼接來組裝。

支鏈的多肽嵌合蛋白可以容易地通過模板組裝合成肽(tasp)技術(shù)來制備(mutter,trendsbiochem.sci.13:260-265(1988))。通過此方法，肽單元被單獨(dú)合成并且使用化學(xué)偶聯(lián)劑將其共價(jià)偶聯(lián)至多功能載體，諸如核心肽。例如，短桿菌肽s的環(huán)狀十肽類似物可以用作核心肽，其中兩個(gè)反向平行的β-片區(qū)段(lys-ala-lys)通過兩個(gè)β-轉(zhuǎn)角連接?？梢允褂脜^(qū)段縮合策略來將第一和第二蛋白質(zhì)附接到4個(gè)賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以作為通過橋諸如化學(xué)鍵，連接在一起的兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立蛋白質(zhì)存在。例如，在支鏈結(jié)構(gòu)中使用化學(xué)交聯(lián)劑諸如二硫代-雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)(dsp)，兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)成分可以彼此直接共價(jià)連接。例如，通過此方法，第一和第二蛋白質(zhì)可以直接連接。

本發(fā)明的嵌合轉(zhuǎn)換受體的特定第一和第二多肽可以根據(jù)被治療的疾病而變化。例如，典型地，當(dāng)治療癌癥或病毒感染時(shí)，使用刺激免疫細(xì)胞應(yīng)答的第二多肽。當(dāng)治療其中存在致病性免疫應(yīng)答的免疫系統(tǒng)病癥時(shí)，使用抑制性第二多肽。因此，對(duì)于癌癥和病毒疾病，將抑制性免疫信號(hào)轉(zhuǎn)變成激活免疫激活信號(hào)的轉(zhuǎn)換受體是合乎需要的。相反，對(duì)于自身免疫病，將激活免疫信號(hào)轉(zhuǎn)變成抑制性免疫信號(hào)的嵌合轉(zhuǎn)換受體是合乎需要的。在此情況下，免疫-抑制性第二蛋白成分可以針對(duì)不同的致病免疫效應(yīng)器，包括t細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞。

因此，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)換受體，其當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)將細(xì)胞中的陽性信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮孕盘?hào)。例如，此轉(zhuǎn)換受體包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含遞送陽性信號(hào)的多肽；所述第二結(jié)構(gòu)域包含在細(xì)胞中遞送陰性信號(hào)的多肽。

遺傳修飾

本發(fā)明涵蓋用慢病毒載體(lv)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，lv編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體，所述轉(zhuǎn)換受體包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含遞送陽性信號(hào)的多肽；所述第二結(jié)構(gòu)域包含遞送陰性信號(hào)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可以進(jìn)一步用編碼嵌合抗原受體(car)的lv轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述嵌合抗原受體將特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與cd3-ζ鏈或fcγri蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合成單一嵌合蛋白。

源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實(shí)現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S轉(zhuǎn)基因長期、穩(wěn)定的整合并且其在子細(xì)胞中傳播。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠白血病病毒的載體的額外優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛赊D(zhuǎn)導(dǎo)非增殖的細(xì)胞，諸如肝細(xì)胞。它們還具有低免疫原性的額外優(yōu)點(diǎn)。

簡(jiǎn)單概括，典型地通過可操作地連接編碼所需多肽或其部分的核酸至啟動(dòng)子，并將構(gòu)建體結(jié)合入表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的天然或合成核酸的表達(dá)。該載體可以適合于復(fù)制和整合真核細(xì)胞。典型的克隆載體包含可用于調(diào)控所需核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動(dòng)子。

該核酸可被克隆入許多類型的載體中。例如，該核酸可被克隆入這樣的載體中，所述載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。

進(jìn)一步地，表達(dá)載體可以以病毒載體形式提供給細(xì)胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的并在例如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),volumes1-3(第三版,coldspringharborpress,ny2001)，和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊(cè)中進(jìn)行了描述?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種生物體中起作用的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、方便的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美國專利號(hào)6,326,193)。

額外的啟動(dòng)子元件，例如，增強(qiáng)子，調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。典型地，這些位于起始位點(diǎn)上游的30-110bp區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)顯示許多啟動(dòng)子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔經(jīng)常是可變的，以便當(dāng)元件相對(duì)于另一個(gè)被倒置或移動(dòng)時(shí)，保持啟動(dòng)子功能。在胸苷激酶(tk)啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的間隔可被增加至隔開50bp，之后活性才開始下降。取決于啟動(dòng)子，表現(xiàn)出單個(gè)元件可協(xié)作或獨(dú)立地起作用，以激活轉(zhuǎn)錄。

啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是即刻早期巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列為能夠驅(qū)動(dòng)可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列的高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列。然而，也可使用其他組成型啟動(dòng)子序列，包括但不限于類人猿病毒40(sv40)早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)長末端重復(fù)(ltr)啟動(dòng)子、momulv啟動(dòng)子、鳥類白血病病毒啟動(dòng)子、epstein-barr病毒即刻早期啟動(dòng)子、rous肉瘤病毒啟動(dòng)子、以及人基因啟動(dòng)子，諸如但不限于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌球蛋白啟動(dòng)子、血紅蛋白啟動(dòng)子和肌酸激酶啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，本發(fā)明不應(yīng)被限于應(yīng)用組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用提供了分子開關(guān)，其當(dāng)這樣的表達(dá)是期望的時(shí)，能夠打開可操作地連接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多核苷酸序列的表達(dá)，或當(dāng)表達(dá)是不期望的時(shí)關(guān)閉所述表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于金屬硫蛋白啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子、孕酮啟動(dòng)子和四環(huán)素啟動(dòng)子。

為了評(píng)估car多肽或其部分的表達(dá)，被引入細(xì)胞的表達(dá)載體也可包含可選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因中的任一個(gè)或兩者，以便于從尋求通過病毒載體被轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他方面，可選擇標(biāo)記可被攜帶在單獨(dú)一段dna上并用于共轉(zhuǎn)染程序?？蛇x擇標(biāo)記和報(bào)道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。

報(bào)道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并用于評(píng)價(jià)調(diào)控序列的功能性。通常地，報(bào)道基因?yàn)橐韵禄颍浩洳淮嬖谟谑荏w生物體或組織中或由受體生物體或組織表達(dá)，并且其編碼多肽，該多肽的表達(dá)由一些可容易檢測(cè)到的性質(zhì)例如酶活性來清楚表示。在dna已經(jīng)被引入受體細(xì)胞后，報(bào)道基因的表達(dá)在合適的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。合適的報(bào)道基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等人，2000febsletters479:79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的并可利用己知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常，顯示最高水平的報(bào)道基因表達(dá)的具有最少的5’側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子區(qū)可被連接至報(bào)道基因并用于評(píng)價(jià)試劑的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子-驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。

將基因引入細(xì)胞和將基因表達(dá)入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是己知的。在表達(dá)載體的情況下，載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如，表達(dá)載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包含載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。參見，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))volumes1-3(第三版,coldspringharborpress,ny2001)。

將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用dna和rna載體。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動(dòng)物例如人細(xì)胞中的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒i、腺病毒和腺相關(guān)病毒等等。參見，例如美國專利號(hào)5,350,674和5,585,362。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠、和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送工具的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒遞送系統(tǒng)的情況下，示例性遞送工具為脂質(zhì)體?？紤]使用脂質(zhì)制劑，以將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體或體內(nèi))。在另一方面，核酸可與脂質(zhì)相締合。與脂質(zhì)相締合的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng)由與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相締合的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體內(nèi)，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)合并，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠束中或與膠束復(fù)合，或以其他方式與脂質(zhì)相締合。脂質(zhì)、脂質(zhì)/dna或脂質(zhì)/表達(dá)載體締合的組合物不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如，它們可以雙分子層結(jié)構(gòu)，作為膠束存在或具有“坍塌的(collapsed)”結(jié)構(gòu)。它們也可簡(jiǎn)單地被散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì)，其可為天然存在或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括脂肪小滴，其天然存在于細(xì)胞質(zhì)以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。

適于使用的脂質(zhì)可從商業(yè)來源中獲得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“dmpc”)可從sigma，st.louis，mo獲得；磷酸二鯨蠟酯(“dcp”)可從k&klaboratories(plainview，ny)獲得；膽固醇(“choi”)可從calbiochem-behring獲得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂質(zhì)可從avantipolarlipids，inc.(birmingham，al)獲得。脂質(zhì)在氯仿或氯仿/甲醇中的原液可在大約-20℃保存。氯仿用作唯一的溶劑，因?yàn)樗燃状几菀渍舭l(fā)。“脂質(zhì)體”為通用術(shù)語，其包括通過產(chǎn)生封閉的脂質(zhì)雙分子層或聚集體而形成的多種單一和多層脂質(zhì)載體。脂質(zhì)體可以以具有含有磷脂雙分子層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊泡結(jié)構(gòu)為特征。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個(gè)脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水性溶液中時(shí)，它們自發(fā)形成。在形成密閉的結(jié)構(gòu)并使水和溶解的溶質(zhì)陷入脂質(zhì)雙分子層之間前，該脂質(zhì)成分經(jīng)歷自身重排(ghosh等人，1991glycobiology5；505-10)。然而，也包括與正常的囊泡結(jié)構(gòu)相比具有溶液中的不同結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集體而存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合物。

治療性應(yīng)用

本發(fā)明包括這種類型的細(xì)胞療法，其中t細(xì)胞被遺傳修飾以表達(dá)轉(zhuǎn)換受體并且被改造的t細(xì)胞被輸注至需要其的受體。輸注的細(xì)胞能夠殺死受體中的腫瘤細(xì)胞。不像抗體療法，本發(fā)明的被改造的t細(xì)胞能夠體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生長期持久性，可以引起持續(xù)的腫瘤控制。

本發(fā)明還涉及用于治療患者的疾病的方法，包括向患者施用有效量的本發(fā)明的被改造的轉(zhuǎn)換受體。根據(jù)本發(fā)明的方法可以治療多種疾病，包括但不限于癌癥，諸如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌和白血病；病毒感染，諸如hbv、hcv、htlv-1、htlv-ii、ebv、hsv-i、hsv-ii和kshv的慢性病毒感染；和自身免疫病，諸如關(guān)節(jié)炎、哮喘、移植物抗宿主病、器官排斥、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、變應(yīng)性皮炎、斯耶格倫氏綜合征、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性肝病和骨髓增生異常綜合征。

癌癥的實(shí)例包括但不限于，癌，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和白血病或惡性淋巴增殖性疾病。此類癌癥的更具體的例子包括腎癌或腎臟癌癥，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌，肺的腺癌和肺的鱗狀癌，鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌，膀胱癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌或胃癌癥——包括胃腸癌，胃腸道間質(zhì)瘤(gist)，胰腺癌，頭頸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，卵泡膜細(xì)胞瘤(thecomas)，男性細(xì)胞瘤(arrhenoblastomas)，肝細(xì)胞瘤，血液學(xué)惡性腫瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(nhl)，多發(fā)性骨髓瘤和急性血液學(xué)惡性腫瘤，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，子宮內(nèi)膜異位癥，纖維肉瘤，絨毛膜癌，唾液腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，食管癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，鼻咽癌，喉癌，卡波西肉瘤，黑素瘤，皮膚癌，許旺氏細(xì)胞瘤(schwannoma)，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，骨源性肉瘤，平滑肌肉瘤，尿道癌，甲狀腺癌，腎母細(xì)胞瘤(wilm'stumor)，以及b細(xì)胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴細(xì)胞性(sl)nhl；中度/濾泡性nhl；中度彌漫性nhl；高度免疫母細(xì)胞性nhl；高度淋巴母細(xì)胞性nhl；高度小無核裂細(xì)胞性nhl；巨大腫塊nhl；外套細(xì)胞淋巴瘤；aids相關(guān)淋巴瘤；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom'smacroglobulinemia))；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)；急性成淋巴細(xì)胞性白血病(all)；毛細(xì)胞性白血病，慢性成髓細(xì)胞性白血??；和移植后淋巴增殖性病癥(ptld)，以及與斑痣性錯(cuò)構(gòu)瘤病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦腫瘤有關(guān)的)、和meigs綜合征有關(guān)的異常血管增殖?！澳[瘤”，如本文所使用的，指所有贅生性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的或者是良性的，以及所有癌前的和癌性的細(xì)胞和組織。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，“腫瘤抗原”或“過度增生性病癥抗原”或“與過度增生性病癥相關(guān)的抗原”指的是特定過度增生性病癥常見的抗原。在某些方面，本發(fā)明的過度增生性病癥抗原源自癌癥，包括但不限于，原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宮癌，宮頸癌，膀胱癌，腎癌和腺癌諸如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌，等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腫瘤抗原包括一種或多種被源自哺乳動(dòng)物癌腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)免疫識(shí)別的抗原癌癥表位(antigeniccancerepitopes)。

惡性腫瘤表達(dá)可用作免疫攻擊的靶抗原的許多蛋白。這些分子包括但不限于組織特異性抗原諸如mart-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和gp100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特異性抗原(psa)。其他靶分子屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的組，諸如癌基因her-2/neu/erbb-2。而另一組的靶抗原為癌性胚胎抗原，諸如癌胚抗原(cea)。在b-細(xì)胞淋巴瘤中，腫瘤特異性獨(dú)特型免疫球蛋白構(gòu)成對(duì)個(gè)體腫瘤獨(dú)特的真正的腫瘤特異性免疫球蛋白抗原。b-細(xì)胞分化抗原諸如cd19、cd20和cd37是b-細(xì)胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選物。這些抗原中的一些(cea、her-2、cd19、cd20、獨(dú)特型)已經(jīng)有限成功地用作利用單克隆抗體的被動(dòng)免疫療法的靶標(biāo)。

在癌癥治療的情況下，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以任選地聯(lián)合其他化療劑施用于患者。合適的化療劑包括，例如，烷化劑諸如塞替派和環(huán)磷酰胺；磺酸烷基酯類諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylameiamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥類(nitrogenmustards)諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亞硝基脲類(nitrosoureas)諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素c(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素d(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二偶氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)，5-fu；雄激素類，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformthine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；psk^tm；雷佐生(razoxane)；西左非蘭(sizofiran)；螺鍺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“ara-c”)；環(huán)磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷類(taxanes)，例如，紫杉醇(taxol^tm,bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)和多烯紫杉醇(taxotere^tm,rhone-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊甙(etoposide)(vp-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素c(mitomycinc)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；諾維本(navelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；cpt-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；維甲酸(retinoicacid)；埃斯波霉素(esperamicins)、卡培他濱(capecitabine)；和上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

還包括能起作用以調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素劑包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，ly117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(法樂通，fareston)；和抗雄激素劑諸如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

還包括能夠使腫瘤細(xì)胞對(duì)trail敏感并克服trail抗性的化療劑，諸如蛋白酶體抑制劑和組蛋白脫乙?；?hdac)抑制劑，放線菌酮，甲磺酸伊馬替尼和其他蛋白酪氨酸激酶抑制劑，17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素，三氧化二砷和凋亡蛋白x-連鎖抑制劑小分子拮抗劑；和這些中任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

關(guān)于癌癥治療方法的額外信息在美國專利號(hào)7,285,522中提供，該專利整體通過引用并入。

因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療乳腺癌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療結(jié)腸癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療肝癌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療卵巢癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療白血病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療黑素瘤。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體可以用于治療自身免疫病，例如，移植物排斥，或移植物抗宿主或宿主抗移植物疾病。

典型地，對(duì)于每種疾病應(yīng)用，可以生成候選轉(zhuǎn)換受體的小“文庫”并且該文庫可以在適宜的和公認(rèn)的離體和體內(nèi)模型中進(jìn)行比較評(píng)價(jià)以確定相對(duì)功效和毒性。

在方法中使用的具體的第一和第二蛋白質(zhì)將根據(jù)被治療的疾病而變化。通常，對(duì)于癌癥，將抑制性免疫轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)轉(zhuǎn)變成激活免疫轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)的轉(zhuǎn)換受體是合乎需要的。不希望受限于任何特殊理論，由本發(fā)明的被改造的細(xì)胞引起的抗腫瘤免疫應(yīng)答可以是主動(dòng)或被動(dòng)免疫應(yīng)答。所述應(yīng)答可以是過繼免疫療法方式的部分。

關(guān)于離體免疫，以下中的至少一項(xiàng)在將細(xì)胞施用進(jìn)入哺乳動(dòng)物前在體外發(fā)生：i)擴(kuò)充細(xì)胞，ii)將編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體的核酸引入細(xì)胞中，和/或iii)冷凍保存細(xì)胞。

離體程序在本領(lǐng)域中是公知的，并在以下更完全地進(jìn)行討論。簡(jiǎn)單地說，細(xì)胞從哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中分離并用表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體的載體進(jìn)行遺傳修飾(即，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。被改造的細(xì)胞可被施用給哺乳動(dòng)物受者，以提供治療益處。哺乳動(dòng)物受者可為人，并且被改造的細(xì)胞可相對(duì)于受者為自體的?？蛇x地，細(xì)胞可相對(duì)于受者為同種異體的、同基因的(syngeneic)或異種的。

在此通過引用并入的美國專利號(hào)5,199,942中描述的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的離體擴(kuò)充程序，可被應(yīng)用至本發(fā)明的細(xì)胞。其他合適的方法在本領(lǐng)域中是己知的，因此本發(fā)明不限于細(xì)胞離體擴(kuò)充的任何具體方法。簡(jiǎn)單地說，t細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)充包括：(1)從外周血收獲物或骨髓外植體收集來自哺乳動(dòng)物的cd34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；和(2)離體擴(kuò)充這樣的細(xì)胞。除了美國專利號(hào)5,199,942中描述的細(xì)胞生長因子，其他因子諸如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配體，也可用于培養(yǎng)和擴(kuò)充細(xì)胞。

除了就離體免疫而言使用基于細(xì)胞的疫苗之外，本發(fā)明還提供了體內(nèi)免疫以引起針對(duì)患者中抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。

通常地，如本文所述激活和擴(kuò)充的細(xì)胞可用于治療和預(yù)防免疫受損的個(gè)體中產(chǎn)生的疾病。特別地，本發(fā)明的被改造的細(xì)胞用于治療癌癥。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于發(fā)展癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的患者。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括施用給需要其的對(duì)象以治療有效量的本發(fā)明的被改造的t細(xì)胞。

本發(fā)明的被改造的t細(xì)胞可被單獨(dú)施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如il-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群聯(lián)合施用。簡(jiǎn)單地說，本發(fā)明的藥物組合物可包含如本文所述的靶細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑聯(lián)合。這樣的組合物可包含緩沖液諸如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑諸如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、以及患者疾病的類型和嚴(yán)重度，盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠赏ㄟ^臨床實(shí)驗(yàn)來確定。

當(dāng)表示“免疫學(xué)上的有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”或“治療量”時(shí)，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師考慮患者(對(duì)象)的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度以及病癥的個(gè)體差異來確定?？赏ǔＶ赋觯喊疚拿枋龅膖細(xì)胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選10⁵至10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量(包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值)施用。t細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細(xì)胞可通過使用免疫療法中公知的輸注技術(shù)(參見，例如，rosenberg等人,neweng.j.ofmed.319:1676,1988)施用。對(duì)于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測(cè)患者的疾病體征并因此調(diào)整治療而由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

在某些實(shí)施方案中，可期望向?qū)ο笫┯眉せ畹膖細(xì)胞，并隨后重新抽取血液(或?qū)嵤﹩尾裳撼煞中g(shù))，根據(jù)本發(fā)明激活來自其中的t細(xì)胞，和用這些激活和擴(kuò)充的t細(xì)胞再輸入至該患者。該過程可每幾周進(jìn)行多次。在某些實(shí)施方案中，t細(xì)胞可從10cc至400cc的抽取血液中進(jìn)行激活。在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞從20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽取血液中進(jìn)行激活。不被理論所束縛，利用此多次血液抽取/多個(gè)再輸注方案，可選出某些t細(xì)胞群。

對(duì)對(duì)象施用組合物可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過霧化吸入法、注射、攝入、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可經(jīng)皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的t細(xì)胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射被施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的t細(xì)胞組合物優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射施用。t細(xì)胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結(jié)或感染部位。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，利用本文描述的方法或本領(lǐng)域己知的將t細(xì)胞擴(kuò)充至治療性水平的其他方法激活和擴(kuò)充的細(xì)胞，與任何數(shù)量的相關(guān)治療模式結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)施用給患者，所述治療模式包括但不限于用以下試劑進(jìn)行的治療：所述試劑諸如抗病毒療法，西多福韋和白介素-2、針對(duì)ms患者的阿糖胞苷(也已知為ara-c)或那他珠單抗治療，或?qū)︺y屑病患者的依法利珠單抗治療或?qū)ml患者的其他治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的t細(xì)胞可與以下各項(xiàng)聯(lián)合使用：化療、輻照、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506，抗體，或其他免疫消融劑諸如campath、抗-cd3抗體或其他抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、fr901228、細(xì)胞因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對(duì)生長因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等人,cell66:807-815,1991；henderson等人,immun.73:316-321,1991；bierer等人,curr.opin.immun.5:763-773,1993；isoniemi(見前))。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺、或抗體諸如okt3或campath的t細(xì)胞消融療法結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)而施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物在b-細(xì)胞消融療法諸如與cd20反應(yīng)的試劑，例如美羅華(rituxan)后進(jìn)行施用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象可經(jīng)歷高劑量化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，之后進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植。在特定實(shí)施方案中，在移植后，對(duì)象接受本發(fā)明的擴(kuò)充的免疫細(xì)胞的輸注。在一個(gè)額外的實(shí)施方案中，擴(kuò)充的細(xì)胞在外科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。

待施用給患者的以上治療的劑量將隨著被治療狀況的精確屬性和治療的受者而變化。人施用的劑量換算可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐實(shí)施。例如，campath的劑量對(duì)于成人患者將通常在1至大約100mg的范圍內(nèi)，通常每天施用一次，持續(xù)1至30天之間的時(shí)期。盡管在一些例子中可使用高至每天40mg的較大劑量(美國專利號(hào)6,120,766中描述)，但優(yōu)選的日劑量為每天l至10mg。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

本發(fā)明通過參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅出于說明性的目的提供，并不意欲為限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應(yīng)被解釋為限于以下實(shí)施例，而是應(yīng)被解釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)變得顯而易見的任何和全部的變化形式。

沒有進(jìn)一步的描述，相信利用先前的描述和以下的說明性實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可制造和利用本發(fā)明的化合物，并實(shí)踐請(qǐng)求保護(hù)的方法。以下工作實(shí)施例因此具體指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并不解釋為以任何方式限制本公開的剩余部分。

實(shí)施例1：轉(zhuǎn)換受體

本文給出的結(jié)果證明了，嵌合受體可以被改造從而將t細(xì)胞上的陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以開發(fā)出系統(tǒng)性地避免腫瘤抑制因子的抑制并且因此避免整個(gè)免疫系統(tǒng)的抑制的方法。簡(jiǎn)言之，t細(xì)胞被改造以表達(dá)嵌合受體，所述嵌合受體編碼pd-1胞外結(jié)構(gòu)域(沒有抑制性pd-1結(jié)構(gòu)域)和刺激性cd28或icos信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。嵌合受體的定向?qū)d-1胞外結(jié)構(gòu)域置于細(xì)胞外并將cd28或icos刺激性結(jié)構(gòu)域置于t細(xì)胞內(nèi)。因此，t細(xì)胞與腫瘤抗原在腫瘤微環(huán)境中的相互作用在pd-1配體的接合后被正性地影響，因?yàn)榧?xì)胞中的信號(hào)通過cd28或icos信號(hào)傳導(dǎo)內(nèi)結(jié)構(gòu)域而不是天然的抑制性pd-1內(nèi)結(jié)構(gòu)域遞送。

現(xiàn)在描述這些實(shí)驗(yàn)中采用的材料和方法。

材料和方法

轉(zhuǎn)換受體的產(chǎn)生

設(shè)計(jì)構(gòu)建體用于測(cè)試btla轉(zhuǎn)換受體。下面是每個(gè)構(gòu)建體的序列，所述構(gòu)建體被克隆進(jìn)基于pgem.64a的ivt載體中。

btla；seqidno:1

atgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttcttaatcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagagacaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgctaacaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaacaagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaatgggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtgacagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctgtatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgagaaggcaccaaggaaagcaaaatgaactctctgacacagcaggaagggaaattaacctggttgatgctcaccttaagagtgagcaaacagaagcaagcaccaggcaaaattcccaagtactgctatcagaaactggaatttatgataatgaccctgacctttgtttcaggatgcaggaagggtctgaagtttattctaatccatgcctggaagaaaacaaaccaggcattgtttatgcttccctgaaccattctgtcattggaccgaactcaagactggcaagaaatgtaaaagaagcaccaacagaatatgcatccatatgtgtgaggagttaa

btla-btm-cd28；seqidno:2

btla-btm-cd27；seqidno:3

btla-itm-cd28；seqidno:4

btla-itm-cd27；seqidno:5

btla-btm-icos；seqidno:6

btla-btm-icos-z；seqidno:7

aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttcttaatcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagagacaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgctaacaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaacaagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaatgggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtgacagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctgtatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgtgttggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctatgcagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaagcggccgca

btla-itm-icos；seqidno:8

btla-itm-icos-z；seqidno:9

t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

已經(jīng)描述了利用包被有抗-cd3和抗-cd28單克隆抗體的順磁聚苯乙烯珠的t細(xì)胞制備方法(laport等人,2003,blood102:20042013)。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)如所述的那樣進(jìn)行(levine等人,2006,procnatlacadsciusa103:17372-17377)。利用rna電穿孔t細(xì)胞已經(jīng)被描述為(2010,zhao等人,cancerres70:9062)表達(dá)這些受體的方法。已經(jīng)描述了腺病毒載體的應(yīng)用(2004,schroers等人,exphematol32:536)。已經(jīng)描述了許多其他的在t細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的方式(2009,june等人,natrevimmunol9:704)。

細(xì)胞因子分析

可溶性細(xì)胞因子的量化利用從lifetechnologies(invitrogen)購買的luminex珠陣列技術(shù)和試劑盒實(shí)施。按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案，利用3倍系列稀釋產(chǎn)生的8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)施測(cè)定。

現(xiàn)在描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本文給出的結(jié)果證明了，嵌合受體可以被改造并在t細(xì)胞上表達(dá)，其中所述嵌合受體將t細(xì)胞上的陰性信號(hào)轉(zhuǎn)變成陽性信號(hào)。因此，本發(fā)明提供了一種類型的過繼t細(xì)胞或nk細(xì)胞療法，所述療法利用已經(jīng)被遺傳修飾以表達(dá)t細(xì)胞受體(tcrs)或嵌合抗原受體(cars)的細(xì)胞。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以開發(fā)出系統(tǒng)性避免pd-1的抑制并且因此避免整個(gè)免疫系統(tǒng)的抑制的靶向方法。該靶向方法包括施用表達(dá)嵌合受體的t細(xì)胞，所述嵌合受體編碼例如pd-1胞外結(jié)構(gòu)域，和t細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)部分上的刺激性cd28或icos信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域而非抑制性pd-1結(jié)構(gòu)域。因此，t細(xì)胞與腫瘤抗原在腫瘤微環(huán)境中的相互作用在pd-1配體的接合后被正性地影響，因?yàn)榧?xì)胞中的信號(hào)通過cd28或icos信號(hào)傳導(dǎo)內(nèi)結(jié)構(gòu)域而不是天然的抑制性pd-1內(nèi)結(jié)構(gòu)域遞送。

轉(zhuǎn)變btla信號(hào)

以相似的方式，已經(jīng)構(gòu)建了編碼btla的嵌合受體。btla，與pd-1一起都是cd28家族的成員。btla具有數(shù)個(gè)配體，包括hvem，hvem在腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞上表達(dá)，經(jīng)常在腫瘤微環(huán)境內(nèi)。眾所周知，btla與細(xì)胞上的天然配體的相互作用負(fù)性地調(diào)控t-細(xì)胞免疫應(yīng)答(paulos等人,2010,jclininvest120:76-80；derré等人,2010,jclininvest120:157-67；chemnitz等人,2006,jimmunol176:6603-14)。為了規(guī)避，構(gòu)建了由btla胞外結(jié)構(gòu)域和包含cd28或icos結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的嵌合受體。

簡(jiǎn)言之，使用分子克隆來構(gòu)建圖1中所繪的示例性嵌合受體。為了測(cè)試t細(xì)胞表面上表達(dá)的btlaccr的連接是否可以正確地被表達(dá)并且通過icos胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域向cd3ζ轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，編碼btlaccr的ivtmrna如指示的那樣被電穿孔進(jìn)被刺激的t細(xì)胞并且在如指示的不同時(shí)間通過hvem-fc融合蛋白檢測(cè)btla的表面表達(dá)(圖1b)。被電穿孔的t細(xì)胞用btla配體陰性細(xì)胞系(ktpolcd86a2)或btla配體hvem陽性細(xì)胞系(ktcd86fluhvem)刺激。刺激后24小時(shí)，通過elisa測(cè)定由t細(xì)胞產(chǎn)生的il-2(圖1c)。結(jié)果顯示，通過將btla胞外結(jié)構(gòu)域與icos和cd3ζ兩者的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，t細(xì)胞可以被表達(dá)btla配體hvem的細(xì)胞系的刺激所激活，指示btla信號(hào)可以以嵌合共刺激受體(ccr)的形式轉(zhuǎn)變成其他信號(hào)。

設(shè)計(jì)下一組實(shí)驗(yàn)以評(píng)估btla抑制信號(hào)是否可以通過btla-cd28ccr轉(zhuǎn)變成cd28共刺激信號(hào)。為了發(fā)現(xiàn)可以顯示cd28信號(hào)傳導(dǎo)的適宜窗口，將不同劑量的rna(ug/0.1mlt細(xì)胞)電穿孔進(jìn)t細(xì)胞中并通過facs檢測(cè)car(cd19z、cd19-28z)表達(dá)。上圖顯示了直方圖和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的百分比，并且下圖顯示了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的mfi(圖2a)。如圖2a中所述的rna電穿孔的t細(xì)胞的il2產(chǎn)生被cd19陽性細(xì)胞系k562-cd19刺激，并且如圖2b中所示通過elisa測(cè)定il-2產(chǎn)生。上圖顯示了ifn-γ并且下圖顯示了il-2產(chǎn)生。結(jié)果顯示，在1.5ug的rna劑量下，不像cd19-28zrna電穿孔的t細(xì)胞(其顯示超過300pg/mlil-2產(chǎn)生)，對(duì)于cd19zrna電穿孔的t細(xì)胞沒有可檢測(cè)的il-2產(chǎn)生。以1.5ug的rna劑量對(duì)于cd19z和cd19-28z電穿孔的t細(xì)胞兩者，可以以相似的水平檢測(cè)到ifn-γ產(chǎn)生。因此，使用1.5ugrna作為rna劑量來測(cè)試轉(zhuǎn)變btla-cd28信號(hào)的多肽。

t細(xì)胞用1.5ugcd19z和btlaccr如指示的那樣共同電穿孔并用表達(dá)cd19(k562cd19)或cd19和hvem兩者(k562cd19/hvem)的k562刺激。表達(dá)間皮素的k562細(xì)胞系(具有或不具有hvem)用作對(duì)照(圖2c)。結(jié)果顯示，全長(野生型)btla抑制il2和ifn-γ兩者產(chǎn)生。對(duì)于僅用cd19z電穿孔的t細(xì)胞，當(dāng)用cd19/hvem雙陽性細(xì)胞系刺激時(shí)沒有可檢測(cè)到的il-2產(chǎn)生，而用cd19-28z電穿孔并用cd19/hvem雙陽性細(xì)胞系刺激的t細(xì)胞產(chǎn)生超過400pg/ml的il-2。然而，當(dāng)t細(xì)胞用cd19z和btla-cd28ccrrna兩者共同電穿孔時(shí)，當(dāng)用cd19/hvem雙陽性細(xì)胞系刺激時(shí)，il-2產(chǎn)生比cd19-28z電穿孔的t細(xì)胞高4倍。當(dāng)用cd19/hvem雙陽性細(xì)胞系或表達(dá)低水平的hvem的cd19陽性k562刺激(圖2c)時(shí)，用cd19z和btla-cd28ccrrna兩者共同電穿孔的t細(xì)胞與cd19z或cd19-28z電穿孔的t細(xì)胞相比產(chǎn)生更高的ifn-γ。本文給出的結(jié)果證明，btla抑制信號(hào)可以通過btla-cd28ccr轉(zhuǎn)變成cd28信號(hào)。

設(shè)計(jì)下一組實(shí)驗(yàn)以測(cè)試是否抑制性btla信號(hào)可以通過btla-icosccr轉(zhuǎn)變成共刺激icos信號(hào)。簡(jiǎn)言之，在如圖3a中顯示的，在th17極化系統(tǒng)中測(cè)試將btla轉(zhuǎn)變成icos信號(hào)。靜息cd4t細(xì)胞用cd19z和btlaccr如指示的那樣(處理)共同電穿孔并用cd19/hvem雙陽性細(xì)胞系(1組和2組，一式兩份)刺激，或t細(xì)胞用btla-icos單獨(dú)電穿孔并用板結(jié)合的hvem-fc和okt3刺激(第3組)。如所述的那樣(2010,paulos等人,sciencetranslationalmedicine)，cd3/icos珠或cd3/cd28珠分別用作陽性和陰性對(duì)照。所有培養(yǎng)在th17細(xì)胞因子混合物的存在下進(jìn)行。在刺激后不同的天數(shù)(如指示的那樣)時(shí)，t細(xì)胞用pma/離子霉素(ionomycin)刺激，并且通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)il-17a和ifn-γ(圖3b)。結(jié)果顯示，由btla-icos轉(zhuǎn)變的icos信號(hào)在hvem抑制信號(hào)的存在下增強(qiáng)th17細(xì)胞產(chǎn)生。

將pd-1轉(zhuǎn)變成cd28信號(hào)

為了測(cè)試t細(xì)胞表面上表達(dá)的pd1ccr的連接是否可以被功能表達(dá)以通過cd28或cd27或icos胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，使用編碼pd1ccr的ivtrna(序列顯示在下面)。

pd1-i-icos；seqidno.10

atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgttctggttacccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttatttgttggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctataa

pd1-28-cd28；seqidno.11

atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcctaa

pd1-cd27；seqidno.12

atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgatccttgtgatcttctctggaatgttccttgttttcaccctggccggggccctgttcctccatcaacgaaggaaatatagatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctgccccagggaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggattaccgaaaaccggagcctgcctgctccccctaa

如指示的pd1ccr和cd19zrna被共同電穿孔進(jìn)刺激的t細(xì)胞中，并且在如指示的時(shí)間點(diǎn)通過抗-pd1和抗-carab檢測(cè)轉(zhuǎn)基因(圖4a)。如圖4a中所述共同電穿孔的t細(xì)胞與表達(dá)pd-l1或作為對(duì)照的gfp的nalm6(人b細(xì)胞白血病細(xì)胞系)或表達(dá)pd-l1或作為對(duì)照的icosl的k562-cd19共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)后24h測(cè)定ifn-γ產(chǎn)生。用cd19z和pd1-cd28(pd1-28)共引入的t細(xì)胞與用cd19z單獨(dú)電穿孔或與具有截短的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的pd1，或pd1-cd27(pd1-27)共同電穿孔的t細(xì)胞相比顯示顯著較高的ifn-γ產(chǎn)生。當(dāng)與cd19/pd-l1雙陽性細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)t細(xì)胞用cd19z和全長(野生型)pd1共同電穿孔并用cd19/pd-l1雙陽性細(xì)胞系刺激時(shí)，看到強(qiáng)烈的t細(xì)胞抑制(圖4b)。

如圖4a中所述共同電穿孔的t細(xì)胞與表達(dá)pd-l1或作為對(duì)照的gfp的nalm6(人b細(xì)胞白血病細(xì)胞系)或表達(dá)pd-l1或作為對(duì)照的icosl的k562-cd19共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)后24h測(cè)定il-2產(chǎn)生。共引入cd19z和pd1-cd28(pd1-28)的t細(xì)胞與用cd19z單獨(dú)電穿孔或與具有截短的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的pd1，或pd1-cd27(pd1-27)共同電穿孔的t細(xì)胞相比顯示顯著較高的il-2產(chǎn)生。當(dāng)與cd19/pd-l1雙陽性細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)t細(xì)胞用cd19z和全長pd1共同電穿孔并用cd19/pd-l1雙陽性細(xì)胞系刺激時(shí)，看到強(qiáng)烈的t細(xì)胞抑制(圖4c)。

如圖4a中所述共同電穿孔的t細(xì)胞在基于流動(dòng)的ctl測(cè)定中測(cè)試。用cd19z和pd1共同引入的t細(xì)胞顯示顯著減少的針對(duì)nalm6-pd-l1靶標(biāo)的殺傷能力，而當(dāng)使用nalm6-pd1作為靶標(biāo)時(shí)，對(duì)于用pd1ccr共同電穿孔的t細(xì)胞，與用cd19z單獨(dú)電穿孔的t細(xì)胞相比，沒有看到顯著的差異。當(dāng)pd1配體陰性nalm6用作靶標(biāo)時(shí)，對(duì)于所有t細(xì)胞組，包括用cd19z和pd1共同電穿孔的t細(xì)胞，均未發(fā)現(xiàn)顯著的差異。

設(shè)計(jì)下一組實(shí)驗(yàn)來通過pd1-cd28ccr共同引入以逆轉(zhuǎn)pd1抑制。為了模擬腫瘤微環(huán)境或處于其中t細(xì)胞為pd1陽性的慢性感染的情況，t細(xì)胞用cd3/cd28珠或okt3/pbmc/il2刺激，并用cd19z(10ug)和pd1(5ug)與另外的pd1ccr(10ug)如指示的那樣共同電穿孔。電穿孔后1天通過facs檢測(cè)car和pd1和/或pd1ccr表達(dá)(圖5a)。

如圖5a中所示電穿孔的t細(xì)胞與nalm6或表達(dá)pd-l1的k562-cd19共培養(yǎng)。共培養(yǎng)過夜后測(cè)定il-2產(chǎn)生。結(jié)果顯示，與不含pd-l1的cd19陽性細(xì)胞系共培養(yǎng)的相同t細(xì)胞相比，用cd19z單獨(dú)電穿孔的t細(xì)胞產(chǎn)生il-2的量減少。然而，在pd1的存在下，當(dāng)與pd-l1陽性細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)，il-2產(chǎn)生完全被阻斷，例外是與pd1-cd28(pd1-28)共同電穿孔的t細(xì)胞，后者顯示比單獨(dú)cd19z的t細(xì)胞產(chǎn)生高得多的il-2，而當(dāng)t細(xì)胞與pd-l1陰性細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)，t細(xì)胞上的pd1表達(dá)對(duì)t細(xì)胞的影響最小(圖5b)。

如圖5a中所示電穿孔的t細(xì)胞與nalm6或表達(dá)pd-l1的k562-cd19共培養(yǎng)。共培養(yǎng)過夜后測(cè)定ifn-γ產(chǎn)生(圖5c)。看到與圖5b中所示的il-2產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子產(chǎn)生曲線。本文給出的結(jié)果證明，pd1-cd28ccr可以逆轉(zhuǎn)pd1的抑制效應(yīng)并且促進(jìn)t細(xì)胞效應(yīng)器功能。

將pd1轉(zhuǎn)變成icos信號(hào)

cd4t細(xì)胞用pd1(或pd1變體)和cd19-zcarmrna(每種10ug)電穿孔。電穿孔后4小時(shí)(第0天)，t細(xì)胞與表達(dá)pd-l1和cd19的k562細(xì)胞在r10培養(yǎng)基中在il1(10ng/ml)、il6(10ng/ml)、il23(20ng/ml)以及針對(duì)il4和ifnγ的中和抗體(10μg/ml)的存在下混合(0.5:1＝k562:t細(xì)胞)。在指示的天數(shù)(電穿孔后5、9和12天)時(shí)，細(xì)胞與pma(3ug/ml)和離子霉素(1ug/ml)和用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的golgistop溫育4小時(shí)。進(jìn)行cd4的表面染色，然后進(jìn)行ifn-γ，il17和il2的細(xì)胞內(nèi)染色。用抗-cd28/cd3珠和抗-icos/cd3珠刺激的cd4t細(xì)胞用作對(duì)照(圖6a)。與pd1野生型或無尾pd1相比，在表達(dá)pd1-icos的細(xì)胞中，細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，特別是在第9天時(shí)。刺激的t細(xì)胞的細(xì)胞增殖顯示在圖6c中。

pd-1嵌合受體

pd-1在患有慢性病毒感染的患者中的cd8耗竭的t細(xì)胞的表面上上調(diào)。阻斷pd-1:pd-l1信號(hào)恢復(fù)表達(dá)pd-1的cd8耗竭的t細(xì)胞的功能。許多腫瘤表達(dá)pd-l1，提供了免疫抑制性的微環(huán)境。

下面實(shí)驗(yàn)的目的是通過將pd-1嵌合受體引入至腫瘤部位來指引過繼轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞以克服抑制性腫瘤微環(huán)境。

觀察到pd1wt對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制效應(yīng)被pd1嵌合構(gòu)建體挽救(圖7)。然而，pd1嵌合受體不影響粒酶b產(chǎn)生(圖8)。類似地，在存在或缺少pd1的情況下，觀察到cd8t細(xì)胞的殺傷活性的差異最小(圖9)。

設(shè)計(jì)下一組實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)pd-1嵌合受體對(duì)t細(xì)胞增殖的作用(圖10)。觀察到pd1-cd28嵌合受體增加cd8t細(xì)胞的數(shù)目(圖11)。

總之，本文給出的結(jié)果證明，pd-1嵌合構(gòu)建體沒有表現(xiàn)出由pd-1wt顯示的抑制效應(yīng)。pd1-cd28似乎增加cd4t細(xì)胞中tnfα、il2和ifnγ的產(chǎn)生。pd-1嵌合受體不顯示高于表達(dá)cd19carz的t細(xì)胞本身的增加的細(xì)胞毒性。pd1-cd28增加cd8t細(xì)胞數(shù)高于表達(dá)cd19carz的t細(xì)胞本身的數(shù)目。

將共抑制信號(hào)傳導(dǎo)重新定向?yàn)殛栃怨泊碳?/u>

本文給出的結(jié)果證明，轉(zhuǎn)換受體通過電穿孔或采用慢病毒載體在t細(xì)胞中表達(dá)。觀察到car和轉(zhuǎn)換受體可以在相同的t細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)表達(dá)car或tcr和轉(zhuǎn)換受體的細(xì)胞暴露于具有btla或pd-1的配體的腫瘤細(xì)胞時(shí)，t細(xì)胞顯示具有陽性免疫應(yīng)答，而不是通常的抑制性應(yīng)答。

當(dāng)這些嵌合受體在t細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，在btla轉(zhuǎn)換受體的情況下，在與腫瘤細(xì)胞上它們的天然配體hvem相互作用后，觀察到t細(xì)胞被刺激，然后表達(dá)與陽性抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)的功能，包括分泌ifn-γ。

來自這些研究的另一重要結(jié)果是，hvem:btla與嵌合受體的相互作用導(dǎo)致增強(qiáng)的il-17分泌。這是th17細(xì)胞的標(biāo)志物，th17細(xì)胞已知是可用于腫瘤免疫療法的細(xì)胞(martin-orozco等人,2009,immunity31:787-98；paulos等人,2010,sciencetranslationalmedicine2:55-78；garaude等人,2010,scitranslmed2(55):55ps2)。例如，本文給出的結(jié)果證明，表達(dá)car和具有icos信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的btla轉(zhuǎn)換受體的t細(xì)胞被極化以分泌大量的il-17。

另外，本文給出的結(jié)果顯示，如果表達(dá)car和具有cd28和缺失的結(jié)構(gòu)域的pd1轉(zhuǎn)換受體的t細(xì)胞表達(dá)pd-1轉(zhuǎn)換受體，則防止它們具有抑制作用，而是殺死腫瘤細(xì)胞并分泌細(xì)胞因子(il-2和ifn-γ)。

不希望受限于任何特定理論，據(jù)信通過在t細(xì)胞上表達(dá)具有pd-1或btla轉(zhuǎn)換受體的嵌合抗原受體(cars)，然后將該t細(xì)胞引入至腫瘤微環(huán)境中，所述t細(xì)胞具有增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)并且表現(xiàn)出th17表型。用于本發(fā)明的腫瘤免疫療法的過繼t細(xì)胞轉(zhuǎn)移的類型在疫苗療法的領(lǐng)域中也適用，諸如對(duì)于慢性病毒感染包括hiv或其他病毒諸如ebv、hcv或cmv。此技術(shù)也可以容易地結(jié)合到其他目前正在使用用tcr遺傳修飾的t細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中。例如，在具有對(duì)癌癥抗原諸如mage-a3和ny-eso-1特異的tcr的t細(xì)胞的情況下，可以使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)換受體，并且據(jù)信這些t細(xì)胞加入轉(zhuǎn)換受體將增加t細(xì)胞的功效。

本文引用的各個(gè)和每個(gè)專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開內(nèi)容在此都通過引用全文并入。盡管已經(jīng)參考具體實(shí)施方案公開了本發(fā)明，但顯而易見的是可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)本發(fā)明的其他實(shí)施方案和變化形式，而不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。權(quán)利要求意欲被解釋為包括所有這樣的實(shí)施方案和等同變化形式。

序列表

<110>賓夕法尼亞大學(xué)董事會(huì)

c.h.瓊

y.趙

<120>轉(zhuǎn)換共刺激受體

<130>046483-6010-00-wo.601501

<150>us61/513,259

<151>2011-07-29

<160>12

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<210>1

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<212>dna

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<400>1

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