本發(fā)明屬于單克隆抗體生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶是由aco基因編碼的一種非血紅素鐵酶(zhangz,schofieldcj,baldwinje,thomasp,johnp.biochem.j.307:77–85)，這種酶屬于氧化還原酶家族，廣泛存在于植物中，特別是果實(shí)。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶是催化乙烯合成的限速酶，起到調(diào)控果實(shí)的發(fā)育和成熟的作用(pirrungmc,kaiserlm,chenjbiochemistry.32(29):7445–50)。目前市面上并沒有專門針對(duì)果實(shí)成熟研究的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的靶向抗體，因此，在蛋白組學(xué)層面上，對(duì)于該研究領(lǐng)域缺乏有效的抗體工具，用于不同植物類型、不同品系或不同發(fā)育時(shí)期該酶表達(dá)能力水平的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明通過提供一個(gè)靶向蛋白研究的工具，使得對(duì)不同植物類型、不同品系或不同發(fā)育時(shí)期的蛋白表達(dá)變化及蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜的更深層次研究得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶多肽，即四組‘nyppcpnpel’‘gglillfqdd’‘hsivinlgdq’和‘svehrviaqt’，分別以其作為免疫原，免疫小鼠得到淋巴細(xì)胞，并利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制得融合細(xì)胞，經(jīng)免疫印跡法、有限稀釋法和elisa法，得到能夠產(chǎn)物高親和性和高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，及由該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，并經(jīng)免疫酶聯(lián)，蛋白印記，免疫共沉淀加質(zhì)譜和抗體芯片檢測(cè)等驗(yàn)證，確定最有效抗體。一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體，所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)序列包含seqidno.2所示的cdr1的氨基酸序列、seqidno.4所示的cdr2的氨基酸序列和seqidno.6所示的cdr3的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)序列包含seqidno.9所示的cdr1的氨基酸序列、seqidno.11所示的cdr2的氨基酸序列和seqidno.13所示的cdr3的氨基酸序列。優(yōu)選為，所述的重鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)依次包含seqidno.1、3、5和7所示的氨基酸序列，和所述的輕鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)依次包含seqidno.8、10、12和14所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了上述1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體在檢測(cè)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶上的應(yīng)用，包括用于檢測(cè)果實(shí)不同發(fā)育階段1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的含量變化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明的一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體，對(duì)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶具有高親和力和高特異性，能廣泛地用于對(duì)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶檢測(cè)上，特別可用于檢測(cè)果實(shí)不同發(fā)育階段1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的含量變化；此外，本發(fā)明的單克隆抗體提供了一個(gè)靶向蛋白研究的工具，使得對(duì)不同植物類型、不同品系或不同發(fā)育時(shí)期的蛋白表達(dá)變化及蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜的更深層次研究得以實(shí)現(xiàn)。附圖說明圖1為蘋果全蛋白裂解液與克隆號(hào)1h16anti-aco1抗體的內(nèi)源蛋白印記wb驗(yàn)證結(jié)果示意圖；圖2為蘋果全蛋白裂解液與克隆號(hào)1h16anti-aco1抗體和對(duì)照抗體的抗體芯片檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖3為本發(fā)明克隆號(hào)1h16anti-aco1抗體與不同濃度1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶elisa反應(yīng)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實(shí)際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明未特別的說明，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段，且所用的原料、試劑也均為市售可購買得到的商品。實(shí)施例1一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備和抗1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體的制備和純化1.1抗原的制備合成四組1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶多肽‘nyppcpnpel’‘gglillfqdd’‘hsivinlgdq’和‘svehrviaqt’，并分別以其作為免疫原，上述多肽也均偶聯(lián)了vlp以及傳統(tǒng)klh系統(tǒng)的免疫原性增強(qiáng)因子。1.2免疫小鼠每組抗原將用來免疫6只balb/c小鼠(8-12周齡)，并監(jiān)測(cè)其血清效價(jià)以決定最優(yōu)的免疫次數(shù)。每個(gè)6免疫原多肽混合成一組。優(yōu)化了的佐劑和免疫方法能產(chǎn)生針對(duì)大多數(shù)抗原多肽的高親和力的抗體(igg亞型)。初次免疫后會(huì)經(jīng)過3到4次的加強(qiáng)，加強(qiáng)后將取小鼠血清檢測(cè)滴度(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的重組蛋白作為抗抗原包被)。滴度合格的小鼠將沖擊一次并用于融合，不合格的小鼠將繼續(xù)一到兩次加強(qiáng)，至滴度最高后融合。1.3血清檢測(cè)和篩選免疫小鼠眼眶取血，并用elisa檢測(cè)血清滴度(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的重組蛋白作為抗原包被)。血清效價(jià)需大于10k，否則繼續(xù)加強(qiáng)免疫。1.4融合及篩選取全脾和1/2的淋巴結(jié)，與骨髓瘤sp2/0細(xì)胞系融合。工藝為優(yōu)化過的peg融合。融合細(xì)胞鋪到4塊384孔板上(每孔細(xì)胞102到104)，進(jìn)行培養(yǎng)。收集所有孔的上清，用elisa對(duì)多肽檢測(cè)原進(jìn)行篩選，鏡檢有細(xì)胞的陽性孔轉(zhuǎn)到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。生長(zhǎng)幾天后，收集所有孔的上清用elisa檢測(cè)與可溶片段檢測(cè)原的反應(yīng)。陽性孔進(jìn)一步檢測(cè)不同稀釋度的可溶片段檢測(cè)原結(jié)合，以進(jìn)行親和力排序。每個(gè)多肽免疫原親和力最高的20個(gè)親代克隆進(jìn)入亞克隆。每個(gè)可溶片段免疫原親和力最高的60個(gè)親代克隆進(jìn)入亞克隆。1.5亞克隆及篩選通過有限稀釋法和elisa篩選進(jìn)行亞克隆，得到單克隆雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞鋪96孔板，并培養(yǎng)至覆蓋約1/6的底部。elisa檢測(cè)每個(gè)孔上清針對(duì)可溶片段檢測(cè)原和相應(yīng)多肽檢測(cè)原的反應(yīng)，取od值高且細(xì)胞狀態(tài)良好的兩個(gè)孔進(jìn)入下輪亞克隆。重復(fù)上述步驟直到孔中細(xì)胞株陽性率100％。此時(shí)我們得到單克隆細(xì)胞株。經(jīng)過最后一輪亞克隆后，所有陽性細(xì)胞立即擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分凍存供以后使用，另一部分進(jìn)行上清或腹水制備。1.6抗體上清制備和純化最終獲得8株單克隆細(xì)胞株，并通過腹部注射到f1小鼠用于抗體生產(chǎn)。產(chǎn)生的腹水用proteina/g純化，并用于后續(xù)檢測(cè)。實(shí)施例2抗ck18單克隆抗體的驗(yàn)證對(duì)獲得的8株單克隆抗體細(xì)胞株進(jìn)行免疫酶聯(lián)，蛋白印記，免疫共沉淀加質(zhì)譜，抗體芯片等驗(yàn)證，確定最有效抗體。2.1抗體與抗原多肽的elisa(免疫酶聯(lián))配對(duì)驗(yàn)證取待配對(duì)腹水抗體包被96孔elisa板，孵育，洗滌后脫脂牛奶過夜封閉，pbs洗滌，4℃保存待用?？乖嚯姆跤?，pbs洗滌，同時(shí)設(shè)置對(duì)照。hrp標(biāo)記檢測(cè)抗體，加入到孵育有前述的elisa板中。tmb顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。篩選得到8個(gè)細(xì)胞株的效價(jià)如表一所示：表一2.2抗體的內(nèi)源蛋白印記(wb)驗(yàn)證使用蘋果全蛋白裂解液，抗體稀釋濃度1：1000、1：2000及1:5000進(jìn)行wb驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-aco1(克隆1h16)在wb驗(yàn)證中，可以特異性的識(shí)別36kd條帶，與預(yù)期大小相符，如圖1所示。2.3抗體的免疫共沉淀(ip)加質(zhì)譜驗(yàn)證提取蘋果全蛋白1mg，使用anti-aco1(克隆1h16)進(jìn)行免疫沉淀，ip產(chǎn)物切取36kd大小條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜結(jié)果如表二所示，aco1在ip樣品中大量富集，說明本抗體對(duì)aco1識(shí)別的特異性高，并且，本抗體可以應(yīng)用于ip實(shí)驗(yàn)。表二2.4抗體芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用芯片點(diǎn)樣儀將anti-aco1(克隆1h16)抗體及對(duì)照抗體點(diǎn)制于以nc膜為基質(zhì)的玻璃片，形成直徑為100um的抗體點(diǎn)。將蘋果全蛋白進(jìn)行生物素標(biāo)記，按2ug/ml的濃度孵育在抗體芯片上，室溫孵育半小時(shí)。pbs輕柔清洗三遍，再用cy3-sa熒光二抗進(jìn)行孵育，pbs清洗三遍，使用genepix熒光芯片掃描儀523nm掃描芯片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，anti-aco1抗體對(duì)目標(biāo)蛋白有明顯富集結(jié)合效果，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，而對(duì)照抗體沒有發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。實(shí)施例3本發(fā)明的一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體在果實(shí)發(fā)育階段檢測(cè)的應(yīng)用由于本發(fā)明的抗體對(duì)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶具有獨(dú)特的特異性，可作為專門檢測(cè)水果果實(shí)發(fā)育階段的檢測(cè)抗體，或者本領(lǐng)域根據(jù)常規(guī)技術(shù)手段也可將其進(jìn)一步開發(fā)為檢測(cè)試劑盒。首先，本發(fā)明抗體以固定濃度(1mg/ml)與不同濃度1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行elisa實(shí)驗(yàn)，得到相應(yīng)的od值，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的濃度坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為酶標(biāo)儀測(cè)得的光密度值(od值)，如圖3所示。該標(biāo)準(zhǔn)曲線用于后續(xù)將待測(cè)樣本檢測(cè)的od值換算成該酶的濃度；其中標(biāo)準(zhǔn)品為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的重組蛋白，通過bca蛋白定量以及考染跑膠確認(rèn)濃度，并按10ug/ml,5ug/ml,2.5ug/ml,1.25ug/ml倍比稀釋，如表三所示。表三標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ug/ml)1052.51.25標(biāo)準(zhǔn)品od值3.1252.3951.6140.956然后，取不同桃類的組織液體樣本進(jìn)行elisa實(shí)驗(yàn)，使用相同的本發(fā)明抗體濃度(1mg/ml)進(jìn)行檢測(cè)，得到的od值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得到水果的實(shí)際酶含量及對(duì)應(yīng)的成熟度，如表四所示。表四檢測(cè)od值酶濃度換算(mg/ml)果實(shí)成熟度水蜜桃2.6954.30軟糯黃桃2.3212.96較軟糯油桃1.8741.89較脆櫻桃1.2621.03脆實(shí)施例4將1h16克隆號(hào)anti-aco1抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)并提取總rna，將mrna反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cdna；通過pcr擴(kuò)增重鏈及輕鏈基因并將擴(kuò)增基因克隆至測(cè)序載體，進(jìn)行多個(gè)陽性克隆測(cè)序得到最終序列結(jié)果。以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。sequencelisting<110>艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司<120>一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的單克隆抗體及其應(yīng)用<130>2017<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>prt<213>人工序列<220><221>v-region<222>(1)..(24)<223>vhf1<400>1thrglnleuglngluthrglyproserleuvalserproglyglnthr151015leualagluthralaservalpro20<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(9)<223>vhcdr1<400>2proalasergluthrleuglualaval15<210>3<211>16<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(16)<223>vhf2<400>3glyasnasnilearglysileprometleulysleuglutyrmetala151015<210>4<211>7<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(7)<223>vhcdr2<400>4ilesertyrleualaasnser15<210>5<211>23<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(23)<223>vhf3<400>5thralaproserleuglythralasermetalaleualaserileala151015serleuthrprocysthrala20<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(7)<223>vhcdr3<400>6thralathrserthrleuala15<210>7<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vhf4<400>7glythrglyglythrservalleuserpro1510<210>8<211>22<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(22)<223>vlf1<400>8thralailemetproleuvalglycysleutyrseralathrilemet151015glutyralaleualathr20<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(5)<223>vlcdr1<400>9valglythralaser15<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(16)<223>vlf2<400>10proleuglyglyileleuvalalaserthrleualaileserproleu151015<210>11<211>4<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(4)<223>vlcdr2<400>11alaserleuthr1<210>12<211>35<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(35)<223>vlf3<400>12asnargpheprovalproaspglnargthrglyproglyserglythr151015valphethrleuthrvalileasnmetglnsergluargleualaasp202530tyrpheala35<210>13<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vlcdr3<400>13argglntyrthriletyrprogluthrala1510<210>14<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vlf4<400>14thrglygluglyglulysvalgluileile1510當(dāng)前第1頁12