本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測禽白細胞介素10(il-10)含量的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
：1989年，fiorentino等最先描述了白介素10是一種由2型輔助t細胞(th2)分泌的、抑制th1細胞中il-2和ifn-γ合成的新的免疫介質(zhì)。2004年，lisarothwell等從感染艾美耳球蟲的雞盲腸扁桃體提取總rna，經(jīng)rt-pcr獲得chil-10的全長cdna序列，其編碼一條175個氨基酸的多肽，其中有21個氨基酸組成信號肽，成熟肽段長154個氨基酸。雞il-10與人il-10和鼠il-10的氨基酸序列同源性分別為45％和42％。雞il-10基因包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞等細胞可以分泌il-10，此外，th1、th2、th17、treg以及b細胞亞群也被證實可以分泌il-10。il-10能夠抑制cd4+t細胞的增殖和細胞因子包括th1型il-2、ifn-γ和th2型il-4、il-5的合成。il-10抑制單核/巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，并因此抑制了lps和ifn-γ誘導(dǎo)其分泌tnf-α、il-1β、il-6、il-8、g-csf和gm-csf。此外，il-10可以阻止b細胞凋亡，增強其增殖、分化和mhcii類分子的表達，而且在ig類別轉(zhuǎn)換中il-4起著積極的作用。il-10在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。目前，已有在蛋白水平上檢測人和小鼠il-10的商品化試劑盒，但是由于chil-10與人和小鼠il-10的同源性僅分別為45％和42％，所以目前國內(nèi)，無論是在學(xué)術(shù)研究還是臨床疾病分析中主要還是以熒光定量pcr檢測chil-10的相對含量。但由于mrna水平與蛋白水平并不呈絕對的線性關(guān)系，所以應(yīng)用熒光定量pcr并不能反應(yīng)出雞il-10蛋白的實際水平，故其并不能作為一個檢測雞il-10蛋白量的實驗技術(shù)而應(yīng)用，同時熒光定量pcr技術(shù)操作繁瑣，對專業(yè)技能要求較高且價格昂貴，不宜用于生產(chǎn)實際。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供抗chil-10的單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗chil-10的單克隆抗體是由保藏號為cgmccno.13836的雜交瘤細胞株1g11和保藏號為cgmccno.13837的雜交瘤細胞株1d6分泌的。將保藏號為cgmccno.13836的雜交瘤細胞株1g11分泌的抗chil-10的單克隆抗體命名為1g11抗體，將保藏號為cgmccno.13837的雜交瘤細胞株1d6分泌的抗chil-10的單克隆抗體命名為1d6抗體。本發(fā)明的第二個目的是提供分泌抗chil-10的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明提供的分泌抗chil-10的單克隆抗體的雜交瘤細胞株為1g11和1d6。雜交瘤細胞株1g11的分類命名為雜交瘤細胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細胞株已于2017年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.13836。雜交瘤細胞株1d6的分類命名為雜交瘤細胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細胞株已于2017年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.13837。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的酶聯(lián)免疫試劑盒包括上述1g11抗體和/或1d6抗體。上述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括chil-10標準品；所述chil-10標準品是通過將核苷酸序列如序列表中序列1所示的chil-10基因在原核細胞中進行表達獲得的。所述酶聯(lián)免疫試劑盒中還包括如下中的至少一種：酶標板、包被緩沖液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、封閉液、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(hrp標記的鏈霉親和素)、顯色液和終止液。本發(fā)明的第四個目的是提供上述抗chil-10的單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株或上述酶聯(lián)免疫試劑盒的新用途。本發(fā)明提供了上述抗chil-10的單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株或上述酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量中的應(yīng)用。上述抗chil-10的單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株在制備檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的試劑或膠體金試紙條或試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的方法。本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的方法是以1g11抗體為包被抗體、生物素化的1d6抗體為檢測抗體的雙抗體夾心elisa檢測方法。上述方法檢測或輔助檢測待測樣品中chil-10含量的方法具體包括如下步驟：(1)將1g11抗體包被到酶標板上，洗滌；(2)封閉(1)得到的酶標板，洗滌；(3)向(2)得到的酶標板中加入chil-10標準品或待測樣品，孵育，洗滌；(4)向(3)得到的酶標板中加入生物素化的1d6抗體，孵育，洗滌；(5)向(4)得到的酶標板中加入hrp標記的鏈霉親和素，孵育，洗滌；(6)向(5)得到的酶標板中加入底物顯色，顯色后加入終止液終止反應(yīng)；(7)用酶標儀檢測加入chil-10標準品的各孔的吸光度值，以chil-10標準品濃度為橫坐標、以酶標儀的讀數(shù)為縱坐標繪制標準曲線；(8)用酶標儀檢測加入待測樣品的孔的吸光度值，將吸光度值代入所述標準曲線，即得待測樣品中chil-10的濃度。上述方法中，所述步驟(1)中，用碳酸鹽緩沖液將1g11抗體稀釋后包被到酶標板上；所述步驟(2)中，用脫脂奶溶液封閉(1)得到的酶標板；所述步驟(3)中，用bsa溶液將chil-10標準品稀釋后加入酶標板中；所述步驟(4)中，用bsa溶液將生物素化的1d6抗體稀釋至1μg/ml后加入酶標板中。所述生物素化的1d6抗體的制備方法參照抗體生物素標記試劑盒(購自thermoscientific，prod#21440)中說明書中的方法。上述方法中，所述步驟(1)中，所述抗體的濃度稀釋為4μg/ml；所述包被的條件為4℃包被12h；所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.05m，ph為9.6；所述步驟(2)中，所述脫脂奶溶液(溶劑為洗滌緩沖液)的質(zhì)量分數(shù)為5％；所述封閉的條件為37℃封閉3h；所述bsa溶液(溶劑為洗滌緩沖液)的質(zhì)量分數(shù)為1％；所述步驟(3)中，所述孵育時間為2h；所述步驟(4)中，所述孵育時間為45min；所述步驟(5)中，所述孵育時間為15min；所述用酶標儀檢測吸光度值時的波長為450nm；所述底物為tmb；所述終止液為2mh2so4。本發(fā)明在酶聯(lián)免疫的基礎(chǔ)上結(jié)合生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)建立雙抗體夾心elisa，該方法利用標記了抗體的生物素和hrp標記的鏈霉親和素之間的高親和力及高特異性結(jié)合，使大量的酶分子聚集在抗原抗體復(fù)合物周圍，產(chǎn)生多級放大作用，使每個抗體攜帶的酶分子顯著增加，從而極大地提高靈敏度。與熒光定量pcr相比，本發(fā)明所建立的雙抗體夾心elisa檢測方法有以下優(yōu)點：(1)樣品處理簡單，不需要取動物的組織進行rna的提取及反轉(zhuǎn)錄，僅采取少量動物的血液，分離血清進行適當稀釋后，即可進行檢測；(2)簡單、快速，操作方法簡單，且整個檢測過程僅需3-4個小時；(3)準確性高，直接在蛋白水平上針對chil-10進行檢測，不易受操作或是其他外部條件影響；(4)成本低、對儀器要求不高。本發(fā)明利用禽il-10單克隆抗體建立了針對il-10在蛋白水平上的雙夾心elisa檢測方法，可以用于檢測血清及細胞上清中il-10含量。通過實驗證明：本發(fā)明的禽il-10單克隆抗體具有良好的特異性和親和力，能夠準確地反映出血清或細胞上清中禽il-10的含量，且本發(fā)明的檢測方法快捷、高效又準確，解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用pcr檢測方法帶來的操作繁瑣，耗時耗力，易受操作及其他外部條件影響等問題，不僅有助于評價il-10在機體內(nèi)的動態(tài)變化水平，為疾病的預(yù)防和治理提供很好的參考，而且有助于了解禽類傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及機體保護性免疫反應(yīng)的動態(tài)。附圖說明圖1為單克隆抗體的純化。圖2為單抗抗原表位識別區(qū)分析。a：chil-10截短示意圖(△1和△2)；b,c,d：westernblot分析1d6株和1g11株單抗對不同截短蛋白的識別情況；e：各株單抗抗原表位識別區(qū)域示意圖。圖3為單克隆抗體特異性鑒定。a,b,c,d分別以his-tag單抗和純化的1g11株單抗、1d6株單抗為一抗進行單抗特異性分析。圖4為標準曲線的建立。圖5為his-il-10的復(fù)性和westernblot鑒定。a：m:蛋白分子量標準；1：pet-30a空載體誘導(dǎo)前；2：pet-30a空載體誘導(dǎo)后；3：his-il-10誘導(dǎo)前；4：his-il-10誘導(dǎo)后；5：his-il-10超聲裂解上清液；6：his-il-10超聲裂解沉淀；7：復(fù)性后his-il-10。b：1：pet-30a空載體誘導(dǎo)前；2：pet-30a空載體誘導(dǎo)后；3：his-il-10誘導(dǎo)前；4：復(fù)性后his-il-10。圖6為gst-il-10的可溶性分析和westernblot驗證。a：m:蛋白分子量標準；1：pgxe-6p-1空載體誘導(dǎo)后；2：gst-il-10誘導(dǎo)前；3：gst-il-10誘導(dǎo)后4：gst-il-10超聲裂解上清液；5：gst-il-10超聲裂解沉淀。b：1：pgxe-6p-1空載體誘導(dǎo)后；2：gst-il-10誘導(dǎo)前；3：gst-il-10誘導(dǎo)后。圖7為il-10mrna水平檢測結(jié)果。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所使用的溶液的配方如下：1、包被緩沖液為0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)，是將a液438.5ml和b液61.5ml混勻得到的溶液，其中a液和b液的配方如下：2、洗滌緩沖液(pbst，ph7.4)的配方如下：試劑用量kh2po40.2gna2hpo4·12h2o2.9gnacl8.0gkcl0.2gtween-200.5ml蒸餾水1000ml3、封閉液(5％的脫脂奶)的配方如下：試劑用量脫脂奶5g洗滌緩沖液100ml4、樣品及抗體稀釋液(1％的bsa)的配方如下：試劑用量牛血清白蛋白(bsa)1g洗滌緩沖液100ml5、終止液(2mh2so4)的配置方法試劑用量濃硫酸22ml水178ml6、pbs(ph7.4)稱取8.0gnacl，0.2gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4溶解于800ml蒸餾水，濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.4，定容至1l，121℃高壓20min，4℃保存。下述實施例中的原核表達的chil-2在文獻“付夢姣等，il-2單克隆抗體的制備與鑒定，中國獸醫(yī)雜志”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實施例中的原核表達的chil-4在文獻“關(guān)曉宇等，抗雞白介素4單克隆抗體的制備與鑒定，生物工程學(xué)報”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實施例中的緩沖液的制備方法如下：1、0.05m甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph2.8)a液：稱取1.5g甘氨酸溶于100ml蒸餾水中，制成0.2m甘氨酸作為母液備用。b液：量取1.65ml濃鹽酸，用蒸餾水定容至100ml，制成0.2m鹽酸作為母液備用。取a液25ml，b液8.4ml，加蒸餾水定容至100ml。2、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0-5.0)a液：稱取檸檬酸10.5g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m檸檬酸作為母液備用。b液：稱取檸檬酸鈉14.7g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m檸檬酸鈉作為母液備用。將93mla液和7mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0)。將65.5mla液和34.5mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph4.0)。將41mla液和59mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)。3、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0-8.0)a液：稱取二水磷酸二氫鈉3.9g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m磷酸二氫鈉作為母液備用。b液:稱取十二水磷酸氫二鈉8.975g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m磷酸氫二鈉作為母液備用。將87.7mla液和12.3mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)。將39mla液和61mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph7.0)。將5.3mla液和94.7mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph8.0)。4、0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稱取1.59g碳酸鈉，2.93g碳酸氫鈉，溶于1000ml蒸餾水中。5、0.05m碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液(ph10)a液：稱取0.21g碳酸氫鈉溶于50ml蒸餾水中制成0.05m碳酸氫鈉作為母液備用。b液:稱取0.4g氫氧化鈉溶于100ml蒸餾水中制成0.1m氫氧化鈉作為母液備用。取a液50ml，b液10.7ml，加蒸餾水定容至100ml后混勻。下述實施例中的封閉液的配方如下：1、5％的脫脂奶：稱取5g脫脂奶，溶于80mlpbst中，最后定容至100ml。2、2％的bsa：稱取2gbsa，溶于80mlpbst中，最后定容至100ml。3、1％的明膠：稱取1g明膠，溶于80mlpbst中，攪拌溶解，最后定容至100ml。4、5％的脫脂奶+1％的酪蛋白：稱取0.5g酪蛋白，用pbst定容至50ml，攪拌溶解過夜，然后與等量的5％的脫脂奶混合。實施例1、用于檢測禽白細胞介素10(il-10)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及雙抗體夾心elisa檢測方法的建立及條件的優(yōu)化一、用于檢測禽白細胞介素10(il-10)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備本發(fā)明的用于檢測禽白細胞介素10(il-10)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括聚苯乙烯酶標反應(yīng)板、il-10標準品(重組蛋白his-chil-10，夾心蛋白)、抗il-10單克隆體1g11(包被抗體)、抗il-10單克隆抗體1d6(檢測抗體)、0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6，包被液)、pbst(ph7.4，洗滌緩沖液)、5％脫脂奶(封閉液)、1％bsa(樣品及抗體稀釋液)、hrp標記的鏈霉親和素、底物tmb、2mh2so4溶液(終止液)。1、免疫原的制備(1)雞il-10原核表達載體的構(gòu)建將序列1所示的雞il-10基因序列插入到載體pet-30a(購自優(yōu)寶生物公司，產(chǎn)品目錄號為vt1212)的bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點間，且保持載體pet-30a的其他序列不變，得到pet-30a-chil-10質(zhì)粒。將序列1所示的雞il-10基因序列插入到載體pgex-6p-1(購自優(yōu)寶生物公司，產(chǎn)品目錄號為vt1258)的bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點間，且保持載體pgex-6p-1的其他序列不變，得到pgex-6p-1-chil-10質(zhì)粒。(2)重組菌的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化1)分別將質(zhì)粒pet-30a-chil-10和pgex-6p-1-chil-10轉(zhuǎn)化到rosetta(de3)(北京康為世紀生物，貨號為cw0811a)中，分別得到重組菌。2)分別向重組菌中加入iptg至終濃度為1mmol/l，37℃誘導(dǎo)6h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解(其功率比為35％，槽溫度為46℃，超聲3s，停3s，超聲總時間為30min)后12000r/min離心20min，分離上清和沉淀。通過sds-page分析蛋白的表達情況并用westernblotting進行驗證后，提取包涵體，并進行稀釋復(fù)性，分別得到純化后的重組蛋白his-chil-10(22kda)和gst-chil-10(40kda)。sds-page和westernblotting檢測結(jié)果如圖5和圖6。重組蛋白his-chil-10用于免疫小鼠，gst-chil-10用于雜交瘤細胞篩選。上述純化的具體步驟如下：1、將上清液過柱，流速為10倍柱體積/小時。2、使用15倍柱體積的solublebindingbuffer沖洗柱子，收集流穿峰。3、使用5倍柱體積的solubleelutionbuffer洗脫，收集洗脫峰。4、洗脫后，依次使用3倍柱體積的solublebindingbuffer和5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20％乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒)，封柱后2-8℃保存。2、小鼠免疫及雜交瘤細胞株的獲得以重組蛋白his-chil-10為抗原，免疫8周齡雌性balb/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮內(nèi)多點注射，50μg/只。3周后進行二免，抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注射，50μg/只。3周后進行三免，免疫劑量與途徑同二免。三免1周后，小鼠斷尾采血分離血清，以重組蛋白gst-chil-10所包被的酶標反應(yīng)板用間接elisa的方法測定血清抗體效價，當效價大于1∶10000時，小鼠達到融合以制備單克隆抗體的標準。在細胞融合前3d，進行加強免疫，小鼠腹腔注射抗原，50μg/只。3、細胞融合小鼠三次免疫后取小鼠血清采用間接elisa進行抗體效價檢測，效價合格者進行加強免疫用于細胞融合。細胞融合的具體步驟如下：將準備好的sp2/0雜交瘤細胞和免疫脾細胞按照1:2-1:5的比例混合，加到一個無菌的50ml離心管中，4℃，1000rpm離心10min，棄上清，將盛有細胞的離心管插入37℃的溫水中，一邊輕輕晃動離心管，一邊吸取1ml溶解好的peg4000融合劑，一滴一滴加入到細胞泥中，在60s內(nèi)完成此操作，然后靜止60s,之后按照如下方法加入15ml10％dmem培養(yǎng)液：第1-2min緩緩加入1ml10％dmem培養(yǎng)液，第三分鐘加入1ml，第四分鐘加入2ml，然后在3min內(nèi)加入余下的10％dmem培養(yǎng)液，1000rpm離心10min，棄上清，加入40mlhat選擇培養(yǎng)液懸浮沉淀細胞，將懸浮細胞加入96孔板中，100ul/孔，置于37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。上述間接elisa進行抗體效價檢測的具體步驟如下：用ph9.6的碳酸鹽緩沖液(包被液)將gst-chil-10蛋白稀釋至1ug/ml，100ul/孔包被corning酶標板，4℃過夜；甩干孔內(nèi)殘留液體，每孔加入300ulpbst，洗滌3次，3min/次；甩干孔內(nèi)殘留液體后每孔加入300ul5％脫脂乳，4℃封閉過夜；洗滌；斷尾采血，將陰陽性血清分別做2倍比稀釋，將稀釋好的血清加入酶標板，100ul/孔，每個稀釋度做三個以上的平行孔，37℃孵育1小時，清洗5遍；加1：5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗雞igy(igg)酶標二抗100ul/孔，37℃孵育1小時；pbst洗滌三遍；甩干孔內(nèi)殘留液體，加入稀釋好的酶標二抗溶液，37℃孵育1小時；pbst洗滌；加tmb顯色劑100ul/孔，室溫顯色10-15分鐘，每孔加50ul終止液后酶標儀檢測d450值。結(jié)果的判定由檢測od450>標準陰性樣品的均值+2x標準陰性樣品的標準差進行陽性判定，在統(tǒng)計學(xué)上該判定結(jié)果可以達到95％的置信區(qū)間。4、陽性雜交瘤細胞篩選待融合的細胞克隆生長到1/4-1/3時，利用間接elisa方法對培養(yǎng)上清進行檢測，方法同血清抗體效價測定，加入陰陽性血清對照和sp2/0細胞上清對照，用sp2/0細胞上清值作為臨界值篩選陽性雜交瘤細胞，陰性孔三天后再檢一次，如仍為陰性則棄之。經(jīng)兩次間接elisa檢測為陽性的細胞孔，選擇陽性值較高的進行擴大培養(yǎng)和亞克隆。5、陽性雜交瘤細胞的亞克隆將陽性細胞輕輕吹起，取少量細胞稀釋后用臺盼藍染色液進行細胞計數(shù)，用細胞培養(yǎng)液將陽性雜交瘤細胞10倍稀釋后，吸取80-100個雜交瘤細胞加入到10ml15％dmem培養(yǎng)液中，混勻，將稀釋好的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，使每孔內(nèi)大約含有1個雜交瘤細胞，每個陽性克隆鋪一塊板，另外每塊板內(nèi)有1孔加入10個細胞，1個孔內(nèi)加入100個細胞以避免陽性細胞的丟失，將細胞放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長至覆蓋孔底部1/4-1/3時，吸取細胞上清利用間接elisa進行檢測，選擇只有一個細胞克隆的陽性孔再次進行克隆，亞克隆一共做3-4次。當獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株后，進行擴大培養(yǎng)。最終獲得三株可穩(wěn)定分泌chil-10抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1g11和1d6。雜交瘤細胞株1g11的分類命名為雜交瘤細胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細胞株已于2017年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.13836。雜交瘤細胞株1d6的分類命名為雜交瘤細胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細胞株已于2017年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.13837。6、單克隆抗體的制備及鑒定挑選經(jīng)產(chǎn)balb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟1ml/只，7d后分別將步驟5篩選得到的2株雜交瘤細胞注射入小鼠腹腔進行腹水制備，雜交瘤細胞注射量為2.0×106個/只。收集的腹水經(jīng)離心后收集上清，利用正辛酸飽和硫酸銨沉淀法進行純化(圖1)。其中，雜交瘤細胞株1g11分泌的chil-10單克隆抗體命名為抗chil-10單克隆抗體1g11(1g11抗體)；雜交瘤細胞株1d6分泌的chil-10單克隆抗體命名為抗chil-10單克隆抗體1d6(1d6抗體)，并分別對其特性進行鑒定，包括亞型鑒定、腹水效價測定、親和力測定、抗體特異性鑒定及抗原表位分析。(1)單克隆抗體的抗原表位分析構(gòu)建chil-10的截短蛋白的表達載體△1(his-chil-101-102aa)和△2(his-chil-1052-154aa)，然后在rosetta(de3)(北京康為世紀生物，貨號為cw0811a)分別誘導(dǎo)各個截短蛋白的表達載體，并分別以此為抗原，以chil-10單克隆抗體為一抗，以hrp標記山羊抗小鼠igg為二抗通過westernblotting分析單克隆抗體的抗原識別區(qū)。上述chil-10的截短蛋白的表達載體△1(his-chil-101-102aa)為將序列2所示的dna片段插入到載體pet-28a的bamh和xhoⅰ酶切位點間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。上述△2(his-chil-1052-154aa)，為將序列3所示的dna片段插入到載體pet-28a的bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：1d6單抗識別的抗原表位區(qū)域為chil-10n端的1-52aa，1g11識別的是chil-10n端的52-102aa。(2)單克隆抗體得特異性檢測以原核表達的重組蛋白his-chil-4、his-chil-2、his-chil-10和his-chifn-γ為抗原，經(jīng)sds-page后轉(zhuǎn)印至pvdf膜；分別以his-tag單抗和純化的1g11株單抗、1d6株單抗為一抗；以hrp-山羊抗小鼠igg為二抗進行westernblotting，檢測單克隆抗體的特異性。上述原核表達的his-chifn-γ表達載體為將序列4所示的雞ifn-γ基因序列插入載體pet-28a(購自emdbiosciences(novagen)，產(chǎn)品目錄號為69864-3)的ecorⅰ和hindiii酶切位點間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。結(jié)果圖3所示。結(jié)果表明：2株單抗均只識別原核表達的his-chil-10蛋白，而不識別原核表達的his-chil-2、his-chil-4和his-chifn-γ，表明2株單抗特異性良好。(3)單克隆抗體的ig亞類的鑒定按照sigma公司的mousemonoclonalantibodyisotypingreagents鑒定試劑盒說明書進行單克隆抗體亞型的鑒定。結(jié)果表明，2株抗體的亞型均為igg1。(4)單克隆抗體得親和力檢測利用間接elisa方法測定單克隆抗體的親和力，具體步驟如下：以2μg/ml重組蛋gst-chil-10包被酶標反應(yīng)板，封閉后加入倍比稀釋的單克隆抗體，以hrp標記的山羊抗小鼠igg為二抗，酶標儀讀取od450吸光值。當連續(xù)幾個稀釋度的od450讀數(shù)不再增大時視為抗原抗體100％結(jié)合，以抗體濃度(mol/l)為橫坐標，od450吸光值為縱坐標做散點圖，生成對數(shù)趨勢線和公式。將od450最大值的一半帶入公式，求出此時的抗體濃度即為單克隆抗體的親和力解離常數(shù)(kd)。結(jié)果表明：1d6和1g11抗體的親和力解離常數(shù)分別為5.01×10-10和7.59×10-10，2株抗體的親和力良好。二、雙抗體夾心elisa檢測方法的建立及條件的優(yōu)化本發(fā)明在酶聯(lián)免疫的基礎(chǔ)上結(jié)合生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)建立了雙抗體夾心elisa檢測方法，該方法以1g11抗體為包被抗體、以his-chil-10為夾心蛋白，以生物素標記1d6抗體為檢測抗體，并利用標記了抗體的生物素和hrp標記的鏈霉親和素之間的高親和力及高特異性結(jié)合，使大量的酶分子聚集在抗原抗體復(fù)合物周圍，產(chǎn)生多級放大作用，使每個抗體攜帶的酶分子顯著增加，從而極大地提高靈敏度。按照常規(guī)雙抗體elisa方法進行操作，每優(yōu)化一個條件則固定其他條件。當優(yōu)化好一個條件a，那么下一次優(yōu)化另一條件b時，則采用a的條件，其他條件仍固定，以此類推，直到所有的條件優(yōu)化完畢。每完成一次條件優(yōu)化，需對得到的數(shù)據(jù)進行處理，綜合考慮p/n值(p/n值＝陽性對照od450均值/陰性對照od450均值，通常以p/n值最大，且p值接近1，n值較小作為最佳反應(yīng)條件的判定依據(jù))以及線性關(guān)系良好的夾心蛋白濃度范圍兩方面，確定最佳反應(yīng)條件。1、包被條件的優(yōu)化分別以0.05m甘氨酸-鹽酸(ph2.8)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph4.0)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph7.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph8.0)、0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)和0.05m碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液(ph10)為包被液。將1g11抗體稀釋至濃度為10μg/ml，4℃包被12h，1％的pbst洗滌3遍后，用5％的脫脂奶4℃封閉12h后洗滌，加入以pbs進行倍比稀釋的重組蛋白gst-il-10，并以pbs為陰性對照，37℃孵育1h后洗滌。用pbs按1:1000對生物素化抗體(生物素化抗體的制備方法參照抗體生物素標記試劑盒(購自thermoscientific，prod#21440)中thermoscientific，prod#21440說明書)進行稀釋，37℃孵育1h后洗滌，用1％的bsa按1:10000對hrp標記的鏈霉親和素(購自thermoscientific，prod#21130)進行稀釋，37℃孵育30min后洗滌，加入顯色液tmb后2mh2so4終止。在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被液。在優(yōu)化包被溫度及時間時，用最佳包被液對抗體進行稀釋，分別室溫包被12h、4℃包被12h和37℃包被2h，其他反應(yīng)條件同上，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被溫度及時間。在優(yōu)化包被濃度時，用最佳包被液將抗體分別稀釋到5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml和20μg/ml，采用最佳包被溫度及時間，其他反應(yīng)條件同上，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被濃度。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳的包被條件如下：0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋包被抗體至4μg/ml，4℃包被12h。2、封閉條件的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，分別以5％的脫脂奶、1％的bsa、1％的明膠和5％小牛血清作為封閉液，在37℃分別封閉1h、2h和3h，其他反應(yīng)條件同上，作為封閉液，在4℃，12h和37℃，3h的條件下進行封閉，其他反應(yīng)條件同上，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳封閉條件。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳的封閉條件如下：5％的脫脂奶，37℃封閉3h。3、生物素化抗體以及hrp標記的鏈酶親和素稀釋比例的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，分別將生物素化抗體按1:5000、1:10000和1:15000進行稀釋，其他反應(yīng)條件同上，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳生物素化抗體稀釋比例。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳生物素化抗體稀釋比例為1:15000；最佳hrp標記的鏈酶親和素稀釋比例為1:10000。4、夾心蛋白孵育時間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳條件，夾心蛋白分別孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h，其他反應(yīng)條件不變，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳夾心蛋白孵育時間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳夾心蛋白孵育時間2.0h。5、生物素化抗體孵育時間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，生物素化抗體分別孵育30min、45min、1.0h、1.5h和2.0h，其他反應(yīng)條件不變，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳生物素化抗體孵育時間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳生物素化抗體孵育時間為45min。6、hrp標記的鏈霉親和素孵育時間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，hrp標記的鏈霉親和素分別孵育15min、30min、45min和60min，其他反應(yīng)條件不變，在酶標儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳hrp標記的鏈霉親和素的孵育時間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳hrp標記的鏈霉親和素的孵育時間為15min。7、最佳反應(yīng)條件的確定通過上述對反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定雙抗體夾心elisa檢測方法的具體步驟如下：ph9.6碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗體至4μg/ml，4℃包被12h；5％的脫脂奶，37℃封閉3h；用1％的bsa稀釋夾心蛋白，37℃孵育2h；用1％的bsa按照1:15000的比例將生物素化抗體稀釋至1μg/ml，37℃孵育45min；用1％的bsa按照1:10000的比例稀釋hrp標記的鏈霉親和素，37℃孵育15min。實施例2、用于檢測禽il-10的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的靈敏度檢測一、本發(fā)明的用于檢測禽il-10的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的靈敏度檢測按照實施1中確定的雙抗體夾心elisa檢測方法的最優(yōu)條件，以1g11抗體為包被抗體、生物素化抗體1d6為檢測抗體，將夾心蛋白倍比稀釋至不同濃度后進行elisa試驗，并以夾心蛋白濃度為橫坐標，以od450為縱坐標建立標準曲線。具體步驟如下：1、用碳酸鹽緩沖液(ph9.6)將1g11抗體稀釋成4μg/ml，100μl/孔，4℃包被12h后，洗滌緩沖液洗滌3次，300μl/孔，甩干孔內(nèi)殘留液體；2、5％的脫脂奶，300μl/孔，37℃封閉3h后，洗滌同上；3、用1％的bsa將夾心蛋白(重組蛋白gst-chil-2)稀釋至不同濃度(濃度如表1所示)，100μl/孔，37℃孵育2h后，洗滌同上；4、用1％的bsa按照1:15000的比例對生物素化抗體1d6進行稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h后，洗滌同上；5、用1％的bsa按1:10000的比例對hrp標記的鏈霉親和素進行稀釋，100μl/孔，37℃孵育15min后，洗滌同上；6、加入顯色液tmb，100μl/孔，待陰性對照輕微變藍時，加入2mh2so4，50μl/孔，終止反應(yīng)；7、酶標儀讀取od450吸光值。標準曲線如圖4所示。夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系如表1所示。結(jié)果表明：夾心蛋白濃度在0.1ng/ml-6.25ng/ml的濃度范圍內(nèi)，其濃度與od450線性關(guān)系良好，所能檢測到的最小夾心蛋白濃度為100pg/ml。表1、夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系夾心蛋白(ng/ml)6.253.1251.5630.80.40.20.10od4500.31250.2230.17750.15550.130.13250.1250.118二、對比文獻中抗體靈敏度的檢測按照步驟一中的方法，分別以文獻“抗雞白細胞介素10單克隆抗體的制備及鑒定”中的雜交瘤細胞株分泌的抗chil-10抗體以及本發(fā)明中的抗chil-10抗體為包被抗體和檢測抗體，將夾心蛋白倍比稀釋至不同濃度后進行elisa試驗，并計算p/n值。p/n值＝陽性對照od450均值/陰性對照od450均值。p/n值越大，靈敏度越高。不同抗體組合夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系如表2、表3和表4所示。從表中可以看出：以1g11為包被抗體，以1d6為檢測抗體的組合p/n值最高，檢測效果最好，因此，本發(fā)明的以1g11抗體為包被抗體、生物素化抗體1d6為檢測抗體的抗體組合的靈敏度更好。表2、包被抗體為4f3表3、包被抗體為1g11表4、包被抗體為4b2實施例3、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應(yīng)用分別用0.5ug/ml，1ug/ml，5ug/ml的脂多糖(lps)刺激hd11細胞(雞巨噬細胞)，分為兩組：一組刺激8h后提取細胞rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，并以獲得的cdna為模板進行熒光定量pcr，檢測il-10mrna表達情況；另外一組刺激48h后，取上清液，6000rpm離心2min后再取上清液，并采用本發(fā)明的用于檢測禽il-10的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測lps刺激后的hd11細胞(雞巨噬細胞)上清液中的il-10蛋白含量。以未用lps刺激的hd11細胞作為對照(nor)。il-10mrna水平檢測結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明：雞il-10mrna水平在不同濃度的lps的刺激下均上調(diào)。il-10蛋白含量的檢測結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明：hd11細胞經(jīng)lps刺激后，雞il-10蛋白水平均提高，檢測結(jié)果與mrna水平檢測結(jié)果符合，說明本發(fā)明試劑盒具有臨床應(yīng)用性。表5、lps刺激下的hd11細胞上清il-10濃度檢測(#1和#2分別代表兩組重復(fù))序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種檢測禽白細胞介素10含量的方法及其專用試劑盒<160>4<210>1<211>465bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1ttggagcccacctgcctgcacttctctgagctgctgcccgcccggctgcgggagctgagg60gtgaagtttgaggaaattaaggactattttcaatccagggacgatgaacttaacatccaa120ctgctcagctctgaactgctggatgagtttaaggggacctttggctgccagtctgtgtca180gagatgctgcgcttctacacagatgaggtcctgccccgtgccatgcagaccagcaccagt240catcagcagagcatgggcgacctgggcaacatgctgctgggcctgaaggcgacgatgcgg300cgctgtcaccgcttcttcacctgcgagaagaggagcaaagccatcaagcagatcaaggag360acgttcgagaagatggatgagaacgggatctacaaagccatgggggagttcgacatcttc420atcaactacatcgaggagtacctgctgatgaggaggaggaagtga465<210>2<211>309bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ttggagcccacctgcctgcacttctctgagctgctgcccgcccggctgcgggagctgagg60gtgaagtttgaggaaattaaggactattttcaatccagggacgatgaacttaacatccaa120ctgctcagctctgaactgctggatgagtttaaggggacctttggctgccagtctgtgtca180gagatgctgcgcttctacacagatgaggtcctgccccgtgccatgcagaccagcaccagt240catcagcagagcatgggcgacctgggcaacatgctgctgggcctgaaggcgacgatgcgg300cgctgttga309<210>3<211>312bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gggacctttggctgccagtctgtgtcagagatgctgcgcttctacacagatgaggtcctg60ccccgtgccatgcagaccagcaccagtcatcagcagagcatgggcgacctgggcaacatg120ctgctgggcctgaaggcgacgatgcggcgctgtcaccgcttcttcacctgcgagaagagg180agcaaagccatcaagcagatcaaggagacgttcgagaagatggatgagaacgggatctac240aaagccatgggggagttcgacatcttcatcaactacatcgaggagtacctgctgatgagg300aggaggaagtga312<210>4<211>435bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4catactgcaagtagtctaaatcttgttcaacttcaagatgatatagacaaactgaaagct60gactttaactcaagtcattcagatgtagctgacggtggacctattattgtagagaaactg120aagaactggacagagagaaatgagaaaaggatcatactgagccagattgtttcgatgtac180ttggaaatgcttgaaaacactgacaagtcaaagccgcacatcaaacacatatctgaggag240ctctatactctgaaaaacaaccttcctgatggcgtgaagaaggtgaaagatatcatggac300ctggccaagctcccgatgaacgacttgagaatccagcgcaaagccgcgaatgaactcttc360agcatcttacagaagctggtggatcctccgagtttcaaaaggaaaaggagccagtctcag420aggagatgcaattgc435當前第1頁12