本發(fā)明涉及一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

膠原蛋白作為哺乳動物體內(nèi)最豐富的的蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，在組織形成和維持體內(nèi)平衡中起到關(guān)鍵作用。當(dāng)膠原蛋白的產(chǎn)生和降解平衡遭到破壞時，會引起諸多疾病，其中一些疾病可能致命。在膠原重建過程中，若膠原產(chǎn)生過剩，過量的膠原在器官中累積，易產(chǎn)生組織纖維化，最終導(dǎo)致腫瘤等嚴(yán)重疾病；或者膠原不可控降解導(dǎo)致膠原蛋白退化性疾病，如關(guān)節(jié)炎。在諸多病理條件中，膠原蛋白分子的三重螺旋結(jié)構(gòu)被蛋白酶在細(xì)胞外環(huán)境中酶解。因此，設(shè)計和制備能特異性識別膠原蛋白的探針對這些疾病的診斷和治療具有重要意義。目前，已研發(fā)出一些短肽和抗體用于膠原蛋白的識別及成像，但是，這些檢測方法存在價格昂貴，操作復(fù)雜，特異性差，結(jié)合能力弱等缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法。本方法是利用特定序列的膠原多肽可以特異性的結(jié)合部分解鏈的膠原蛋白，特異性好、結(jié)合能力強、制備簡單，檢測方便，無生物毒性。

本發(fā)明的一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法，其包括以下步驟：

(1)膠原多肽探針的設(shè)計

設(shè)計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的(gly-pro-hyp)n或(gly-pro-pro)n重復(fù)序列，以幫助多肽可以與膠原蛋白特異性結(jié)合；②、多肽序列的特定位置修飾發(fā)光物質(zhì)；

(2)膠原多肽探針的制備

通過固相合成法，合成特定序列的膠原多肽，再使用發(fā)光物質(zhì)修飾該膠原多肽；

(3)膠原纖維染色

在膠原纖維分散液中加入膠原多肽探針溶液，4℃孵育3h，離心棄上清液，用1xpbs洗掉未結(jié)合探針；

(4)體外成像

在組織切片上加封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用dapi稀釋液染色，使用1xpbs洗掉未結(jié)合探針和過量dapi稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照；

(5)體內(nèi)成像

將膠原多肽探針注射入實驗活體內(nèi)，然后麻醉后放入成像裝置中進(jìn)行成像試驗。

所述步驟(1)中膠原多肽探針的序列為x-(gly-pro-hyp)n(n為4-20之間的整數(shù))，x-(gly-pro-pro)n(n為4-20之間的整數(shù))，(gly-pro-hyp)n-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-hyp)m(n和m為1-20之間的整數(shù))，或(gly-pro-pro)n-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-pro)m(n和m為1-20之間的整數(shù))中的一種；其中x為發(fā)光物質(zhì)，gly為甘氨酸，pro為脯氨酸，hyp為羥脯氨酸，amp為4-氨基脯氨酸。

所述步驟(1)中的發(fā)光物質(zhì)為熒光素類、香豆素類、羅丹明類、菁染料類、bodipy類、磷光分子、半導(dǎo)體量子點及碳量子點、上轉(zhuǎn)化稀土納米材料和長余輝納米材料中的一種或幾種；所述發(fā)光物質(zhì)連接在膠原多肽的n端，或通過膠原多肽某一中間位置的amp(4-氨基脯氨酸)的側(cè)鏈連接。

所述步驟(2)中多肽固相合成的具體方法為：

a)將80-120mg的樹脂加入具有篩板的反應(yīng)器中，使用2-8ml二氯甲烷溶脹樹脂；

b)由15-25％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脫除n端fmoc保護(hù)基，通過顯色反應(yīng)來檢測保護(hù)基的脫除程度；

c)將n端由fmoc保護(hù)的氨基酸(4eq)與hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合均勻后加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)1-6hrs；

d)反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液由反應(yīng)器中抽出，樹脂分別由2-8mldmf和dcm洗2-4次，顯色反應(yīng)檢測氨基酸縮合完全，樹脂由15-25％哌啶/dmf溶液處理3次，分別為5min、5min和15min，樹脂分別由5mldmf和dcm洗3次，顯色反應(yīng)檢測保護(hù)基脫除完全；

e)之后重復(fù)步驟c)和d)，直到合成目標(biāo)序列的膠原多肽后，然后向反應(yīng)器中加入20-30％乙酸酐，顯色反應(yīng)檢測反應(yīng)完全后，樹脂分別由3-8mldmf和dcm洗2-4次；

f)樹脂分別用dcm和甲醇輪流洗滌2-4次，然后將樹脂抽干，加入切割液，切割液的組分為tfa:tis:水的質(zhì)量比為90:5:5，反應(yīng)1-6hrs；

g)向反應(yīng)液加入冰乙醚中，將多肽沉淀，然后通過離心收集沉淀，用tfa溶解沉淀，加入過量冰乙醚再次沉淀并離心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗滌2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色譜純化得純肽；

h)將20-30mg純肽由dmf溶解，稱取熒光物質(zhì)(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)，由dmf溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加diea(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反應(yīng)12-48hrs；

i)將反應(yīng)液加入冰乙醚中，得到黃色沉淀，黃色沉淀由水溶解并透析除去熒光物質(zhì)，然后將溶液凍干得到探針。

所述步驟(3)中膠原纖維由i型膠原醋酸溶液在nacl溶液中透析得到，將0.5-1.5mg/mli型膠原蛋白醋酸溶液在nacl溶液中透析，得到膠原纖維；將0.05-0.15mg/ml探針溶液加入到膠原纖維分散液中，在4℃孵育3hrs，離心后棄上清液，然后加入1xpbs振蕩，離心后棄上清液，重復(fù)三次，用以洗掉未結(jié)合探針，然后將處理后的纖維分散液滴于載玻片上，實驗熒光顯微鏡獲取圖像；

所述步驟(4)中組織切片為冰凍切片或石蠟切片；在組織切片上加0.2-0.8ml封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用80-120μl探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μldapi稀釋液染色0.5-1.5min，使用1xpbs洗掉未結(jié)合探針和過量dapi稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

所述步驟(5)中膠原多肽探針在注射前先溶于已滅菌的含半胱氨酸的1xpbs中，實驗活體為小鼠，小鼠體重為20-30g，小鼠由含2％異氟烷氧氣麻醉。

本發(fā)明的有益效果是：

1.制備簡單，檢測方便；

2.特異性好，結(jié)合能力強。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

圖1為本發(fā)明的膠原纖維染色熒光顯微鏡圖；

圖2為本發(fā)明的體外成像的熒光顯微鏡圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，如圖1和2所示，本實施例的一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法，其包括以下步驟：

(1)膠原多肽探針的設(shè)計

設(shè)計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的(gly-pro-hyp)n或(gly-pro-pro)n重復(fù)序列，以幫助多肽可以與膠原蛋白特異性結(jié)合；②、多肽序列的特定位置修飾發(fā)光物質(zhì)；

(2)膠原多肽探針的制備

通過固相合成法，合成特定序列的膠原多肽，再使用發(fā)光物質(zhì)修飾該膠原多肽；

(3)膠原纖維染色

在膠原纖維分散液中加入膠原多肽探針溶液，4℃孵育3h，離心棄上清液，用1xpbs洗掉未結(jié)合探針；

(4)體外成像

在組織切片上加封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用dapi稀釋液染色，使用1xpbs洗掉未結(jié)合探針和過量dapi稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照；

(5)體內(nèi)成像

將膠原多肽探針注射入實驗活體內(nèi)，然后麻醉后放入成像裝置中進(jìn)行成像試驗。

所述步驟(1)中膠原多肽探針的序列為x-(gly-pro-hyp)n(n為4-20之間的整數(shù))，x-(gly-pro-pro)n(n為4-20之間的整數(shù))，(gly-pro-hyp)n-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-hyp)m(n和m為1-20之間的整數(shù))，或(gly-pro-pro)n-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-pro)m(n和m為1-20之間的整數(shù))中的一種；其中x為發(fā)光物質(zhì)，gly為甘氨酸，pro為脯氨酸，hyp為羥脯氨酸，amp為4-氨基脯氨酸。

所述步驟(1)中的發(fā)光物質(zhì)為熒光素類、香豆素類、羅丹明類、菁染料類、bodipy類、磷光分子、半導(dǎo)體量子點及碳量子點、上轉(zhuǎn)化稀土納米材料和長余輝納米材料中的一種或幾種；所述發(fā)光物質(zhì)連接在膠原多肽的n端，或通過膠原多肽某一中間位置的amp(4-氨基脯氨酸)的側(cè)鏈連接。

所述步驟(2)中多肽固相合成的具體方法為：

a)將80-120mg的樹脂加入具有篩板的反應(yīng)器中，使用2-8ml二氯甲烷溶脹樹脂；

b)由15-25％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脫除n端fmoc保護(hù)基，通過顯色反應(yīng)來檢測保護(hù)基的脫除程度；

c)將n端由fmoc保護(hù)的氨基酸(4eq)與hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合均勻后加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)1-6hrs；

d)反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液由反應(yīng)器中抽出，樹脂分別由2-8mldmf和dcm洗2-4次，顯色反應(yīng)檢測氨基酸縮合完全，樹脂由15-25％哌啶/dmf溶液處理3次，分別為5min、5min和15min，樹脂分別由5mldmf和dcm洗3次，顯色反應(yīng)檢測保護(hù)基脫除完全；

e)之后重復(fù)步驟c)和d)，直到合成目標(biāo)序列的膠原多肽后，然后向反應(yīng)器中加入20-30％乙酸酐，顯色反應(yīng)檢測反應(yīng)完全后，樹脂分別由3-8mldmf和dcm洗2-4次；

f)樹脂分別用dcm和甲醇輪流洗滌2-4次，然后將樹脂抽干，加入切割液，切割液的組分為tfa:tis:水的質(zhì)量比為90:5:5，反應(yīng)1-6hrs；

g)向反應(yīng)液加入冰乙醚中，將多肽沉淀，然后通過離心收集沉淀，用tfa溶解沉淀，加入過量冰乙醚再次沉淀并離心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗滌2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色譜純化得純肽；

h)將20-30mg純肽由dmf溶解，稱取熒光物質(zhì)(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)，由dmf溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加diea(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反應(yīng)12-48hrs；

i)將反應(yīng)液加入冰乙醚中，得到黃色沉淀，黃色沉淀由水溶解并透析除去熒光物質(zhì)，然后將溶液凍干得到探針。

所述步驟(3)中膠原纖維由i型膠原醋酸溶液在nacl溶液中透析得到，將0.5-1.5mg/mli型膠原蛋白醋酸溶液在nacl溶液中透析，得到膠原纖維；將0.05-0.15mg/ml探針溶液加入到膠原纖維分散液中，在4℃孵育3hrs，離心后棄上清液，然后加入1xpbs振蕩，離心后棄上清液，重復(fù)三次，用以洗掉未結(jié)合探針，然后將處理后的纖維分散液滴于載玻片上，實驗熒光顯微鏡獲取圖像；

所述步驟(4)中組織切片為冰凍切片或石蠟切片；在組織切片上加0.2-0.8ml封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用80-120μl探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μldapi稀釋液染色0.5-1.5min，使用1xpbs洗掉未結(jié)合探針和過量dapi稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

所述步驟(5)中膠原多肽探針在注射前先溶于已滅菌的含半胱氨酸的1xpbs中，實驗活體為小鼠，小鼠體重為20-30g，小鼠由含2％異氟烷氧氣麻醉。

實施例1

(1)膠原多肽探針的設(shè)計

設(shè)計的膠原多肽序列為(gly-pro-hyp)3-gly-pro-amp(-fam)-(gly-pro-hyp)3，其中fam為羧基熒光素；

(2)膠原多肽探針的制備

1.將100mgrink氨樹脂加入具有篩板的反應(yīng)器中，使用5ml二氯甲烷溶脹樹脂；

2.由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脫除n端fmoc保護(hù)基，顯色反應(yīng)檢測保護(hù)基脫除完全；

3.將n端由fmoc保護(hù)的氨基酸(4eq)與hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低溫活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)3hrs。

4.反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液由反應(yīng)器中抽出，樹脂分別由5mldmf和dcm洗3次。顯色反應(yīng)檢測氨基酸縮合完全，樹脂由20％哌啶/dmf溶液處理3次，分別為5min、5min和15min。樹脂分別由5mldmf和dcm洗3次，顯色反應(yīng)檢測保護(hù)基脫除完全；

5.重復(fù)步驟3、4，直到合成目標(biāo)序列的膠原多肽(gly-pro-hyp)3-gly-pro-amp-(gly-pro-hyp)3。向反應(yīng)器中加入25％乙酸酐，顯色反應(yīng)檢測反應(yīng)完全，樹脂分別由5mldmf和dcm洗3次。

6.樹脂分別用dcm和甲醇輪流洗滌3次。將樹脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝90:5:5)，反應(yīng)3hrs。

7.反應(yīng)液加入冰乙醚中，將多肽沉淀。離心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入過量冰乙醚再次沉淀并離心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗滌2次后風(fēng)干，得到粗肽。粗肽由反相液相色譜純化得純肽。

8.將25mg純肽由dmf溶解，稱取羧基熒光素(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)，由dmf溶解，低溫活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反應(yīng)24hrs。

9.將反應(yīng)液加入冰乙醚中，得到黃色沉淀，黃色沉淀由水溶解并透析除去熒光物質(zhì)，然后將溶液凍干得到探針。

(3)膠原纖維染色

將1mg/mli型膠原蛋白醋酸溶液在nacl溶液中透析，得到膠原纖維。在80μl膠原纖維分散液中加入50μl0.1mg/ml探針溶液，4℃孵育3hrs，離心棄上清液，加入100μl1xpbs振蕩，洗掉未結(jié)合探針，離心去上清，重復(fù)三次；纖維分散液滴于載玻片上，實驗熒光顯微鏡獲取圖像，如圖1所示。

(4)體外成像

鼠耳組織冰凍切片上加0.5ml封閉液，放置30min后吸走液體。使用100μl5μm探針溶液染色，4℃孵育2hrs。吸去染色液后，使用100μldapi稀釋液染色1min。使用1xpbs洗滌3次，洗掉未結(jié)合探針和過量的dapi。滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照，如圖2所示。

(5)體內(nèi)成像

將110μl的4nm膠原多肽探針由小鼠尾部注射，將已麻醉的小鼠放入成像裝置中進(jìn)行成像試驗。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。