本發(fā)明涉及一種灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

據(jù)發(fā)明人所知，在我國(guó)，灰飛虱分布遍及各省市，以長(zhǎng)江流域和華北稻區(qū)發(fā)生較多?；绎w虱最重要的危害形式是種群暴發(fā)促進(jìn)植物病毒病的流行，釀成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前主要以化學(xué)農(nóng)藥來防治灰飛虱，已造成灰飛虱對(duì)常用各類殺蟲劑產(chǎn)生了不同水平的抗性，亟需通過對(duì)灰飛虱進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)和抗藥性形成機(jī)制的研究，開發(fā)出治理技術(shù)和策略，實(shí)現(xiàn)灰飛虱的可持續(xù)防治。

發(fā)明人通過研究灰飛虱抗藥性分子機(jī)制，找出灰飛虱的抗藥性基因，并在此基礎(chǔ)上通過實(shí)施喂食rnai技術(shù)手段來降低灰飛虱抗藥性。目前，發(fā)明人已將研究成果于2016年提交了兩件專利申請(qǐng)，一為申請(qǐng)?zhí)朿n201610432190.3，名稱《灰飛虱抗藥性基因cyp6ay3v2、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)，另一為申請(qǐng)?zhí)朿n201610567595.8，名稱《灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因lsce12、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)。

如上述專利申請(qǐng)中所言，現(xiàn)有技術(shù)利用rnai技術(shù)抗蟲的思路主要有兩種：第一種是找到害蟲的致死基因，然后據(jù)此設(shè)計(jì)合成dsrna，并通過喂食直接導(dǎo)致害蟲死亡、或直接導(dǎo)致害蟲不能正常發(fā)育和繁殖；第二種是找到害蟲的致死基因，然后據(jù)此設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，使農(nóng)作物具備能直接導(dǎo)致害蟲死亡的能力。然而，在當(dāng)前的實(shí)際情況下，社會(huì)公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍帶有很深的誤解，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物很難被直接接受；同時(shí)，能通過喂食直接導(dǎo)致害蟲死亡、或直接導(dǎo)致害蟲不能正常發(fā)育和繁殖的dsrna，容易被社會(huì)公眾誤認(rèn)為該dsrna本身帶有致死毒性、或發(fā)育/繁殖毒性，使這種dsrna也不容易被接受。

與之相比，發(fā)明人利用rnai技術(shù)，通過喂食dsrna降低灰飛虱抗藥性，使灰飛虱更容易被殺蟲劑殺滅，可有效避免社會(huì)公眾產(chǎn)生類似的誤解，這無疑會(huì)使后續(xù)的推廣工作更加順利。

在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人仍在繼續(xù)研究，以期找到灰飛虱的其它抗藥性基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于發(fā)明人的最新研究成果，提供一種灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr，利用該基因可獲得降低灰飛虱抗藥性的基因片段(即dsrna)，通過喂食rnai降低灰飛虱抗藥性。同時(shí)，本發(fā)明還提供與該基因相應(yīng)的降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr，其特征是，該基因的序列如seqidno.1所示。

該基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為1854bp，其中，開放閱讀框?yàn)閺?′端第379位到第1638位堿基，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1260bp；5′端utr區(qū)從第1位到第378位堿基，3′端utr區(qū)從1639位到1854位堿基。該基因的等電點(diǎn)是6.75，分子重量是47.70kda。

由前文所述灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr編碼的多肽，其特征是，該多肽的序列如seqidno.2所示。

該多肽由419個(gè)氨基酸殘基組成，其中，有250個(gè)屬于極性氨基酸，有52個(gè)屬于強(qiáng)酸氨基酸(asp和glu)，有51個(gè)屬于強(qiáng)堿氨基酸(arg和lys)，有169個(gè)屬于疏水性氨基酸。該多肽的第75-168位氨基酸和第194-416位氨基酸之間分別有一個(gè)nr_lbd_err結(jié)構(gòu)域和nr_dbd_err結(jié)構(gòu)域。采用apssp2法預(yù)測(cè)該多肽的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，α螺旋占43.53％，β折疊占5.49％，無規(guī)則卷曲占50.98％；其中，在nr_dbd_err結(jié)構(gòu)域，有6個(gè)β折疊和3個(gè)α螺旋；在nr_lbd_err結(jié)構(gòu)域，有3個(gè)β折疊和11個(gè)α螺旋。

本發(fā)明還提供：

降低灰飛虱抗藥性的基因片段，其特征是，該基因片段的序列如seqidno.3所示。

前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段的合成方法，包括以下步驟：

第一步、從灰飛虱材料中提取灰飛虱總rna；所述灰飛虱材料至少包括灰飛虱卵、灰飛虱若蟲、灰飛虱成蟲之一；

第二步、先以灰飛虱總rna為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈；再以pcr合成灰飛虱cdna模板；

第三步、采用引物dslserr-f和引物dslserr-r、以及灰飛虱cdna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得dsrna模板并進(jìn)行純化；其中，所述引物dslserr-f的序列為5′端加有t7啟動(dòng)子序列的seqidno.5所示序列，所述引物dslserr-r的序列為5′端加有t7啟動(dòng)子序列的seqidno.6所示序列，所述t7啟動(dòng)子序列如seqidno.7所示；

第四步、采用純化后的dsrna模板，體外合成dsrna并保存?zhèn)溆?；所得dsrna即為目標(biāo)基因片段。

該合成方法進(jìn)一步完善的技術(shù)方案如下：

優(yōu)選地，第一步的具體過程為：

采用總rna提取試劑盒從灰飛虱材料中提取灰飛虱總rna；以瓊脂糖凝膠電泳純化灰飛虱總rna；以核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)灰飛虱總rna的濃度以及吸光度值；將灰飛虱總rna凍存；

第二步的具體過程為：

以灰飛虱總rna為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna第一鏈；然后，采用cdna第一鏈，于pcr儀中合成灰飛虱cdna模板，具體合成條件為：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得灰飛虱cdna模板凍存；

第三步的具體過程為：

采用引物dslserr-f和引物dslserr-r、以及灰飛虱cdna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并獲得dsrna模板，擴(kuò)增時(shí)的pcr反應(yīng)條件為：94℃3min，94℃30s，68℃30s以及72℃1min10個(gè)循環(huán)，94℃30s以及72℃1min28個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持；電泳純化所得dsrna模板，并以回收試劑盒進(jìn)行純化后保存；

第四步的具體過程為：

采用純化后的dsrna模板，以試劑盒體外合成dsrna，并以2～5倍反應(yīng)體系的無核酸酶水溶解所得dsrna，然后凍存?zhèn)溆谩?/p>

更優(yōu)選地，第一步中，凍存灰飛虱總rna的溫度為-80℃以下；第二步中，凍存灰飛虱cdna模板的溫度為-20℃±5℃；第三步中，純化后保存dsrna模板的溫度為-20℃±5℃；第四步中，凍存dsrna的溫度為-80℃以下。

前文所述合成方法中所用引物，其特征是，包括引物dslserr-f和引物dslserr-r，所述引物dslserr-f的序列為5′端加有t7啟動(dòng)子序列的seqidno.5所示序列，所述引物dslserr-r的序列為5′端加有t7啟動(dòng)子序列的seqidno.6所示序列，所述t7啟動(dòng)子序列如seqidno.7所示。

本發(fā)明還提供：

前文所述灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr的用途，其特征是，該用途為用于合成前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段。

本發(fā)明還提供：

前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段的用途，其特征是，該用途為用于降低灰飛虱抗藥性。

優(yōu)選地，該用途為降低灰飛虱針對(duì)氟啶蟲胺腈的抗藥性。

發(fā)明人經(jīng)反復(fù)地深入實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，灰飛虱的雌激素相關(guān)受體基因lserr是導(dǎo)致灰飛虱具有抗藥性的關(guān)鍵基因，一方面，通過檢測(cè)基因lserr和/或其編碼的多肽，可檢測(cè)灰飛虱的抗藥性，另一方面，通過以基因lserr為模板最終體外合成dsrna，并進(jìn)行喂食rnai，可有效降低灰飛虱的抗藥性，實(shí)現(xiàn)對(duì)灰飛虱的抗藥性治理。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中灰飛虱lserr基因cds全長(zhǎng)電泳圖，圖中，1泳道為灰飛虱pcr電泳結(jié)果；m為dl2000marker。

圖2是實(shí)施例2中灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性和敏感品系中l(wèi)serr基因半定量電泳圖。

圖3是實(shí)施例3中灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性和敏感品系中l(wèi)serr基因熒光定量分析。

圖4是實(shí)施例4中灰飛虱的含有t7啟動(dòng)子的抗藥性基因lserr序列。

圖5是實(shí)施例4中灰飛虱的含有t7啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因gfp序列。

圖6是實(shí)施例4中灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr體外合成的dsrna(即圖中的dslserr，下同)、以及綠色熒光蛋白基因gfp體外合成的dsgfp的電泳圖。

圖7是實(shí)施例5中喂食灰飛虱dsrna后其基因表達(dá)量變化圖。

圖8是實(shí)施例5中灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr沉默后氟啶蟲胺腈抗性的毒理分析圖。

具體實(shí)施方式

一、本發(fā)明的主要研究過程：

1、確定抗藥性基因

發(fā)明人在研究中了解到，在雌激素相關(guān)受體的配體結(jié)合域插入甘氨酸密碼子的轉(zhuǎn)基因果蠅品系中，cyp12dl和cyp6g2過量表達(dá)。果蠅err配體綁定域突變?cè)黾恿藢?duì)反向激動(dòng)劑4－羥基他莫昔芬和己烯雌酚的敏感性。研究表明，err的主要作用是調(diào)節(jié)代謝基因網(wǎng)絡(luò)，特別是那些與線粒體的生物合成和功能相關(guān)的。在此背景下，發(fā)明人將灰飛虱的核受體err基因作為研究對(duì)象，加以研究。

本發(fā)明利用深圳華大基因研究院測(cè)序得到的灰飛虱核受體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過ncbi-nr數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，得到轉(zhuǎn)錄組注釋信息。利用rt-pcr技術(shù)對(duì)雌激素相關(guān)受體基因進(jìn)行分子克隆和鑒定，灰飛虱雌激素相關(guān)受體基因注釋的轉(zhuǎn)錄本從灰飛虱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到，該轉(zhuǎn)錄本與ncbi的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)具有相似性，將其命名為lserr。

經(jīng)驗(yàn)證，灰飛虱的lserr氨基酸序列與煙粉虱bemisiatabaci、內(nèi)華達(dá)古白蟻zootermopsisnevadensis、赤擬谷盜triboliumcastaneum、意大利蜜蜂apismelliferaligustica和歐洲熊蜂bombusterrestris的err氨基酸序列一致性分別為70％，69％，60％，65％和65％，由此可知，灰飛虱的lserr基因?qū)儆诤耸荏werr基因家族。

本發(fā)明以氟啶蟲胺腈抗藥性灰飛虱、敏感性灰飛虱為研究材料，分別提取兩者的總rna，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(rt-pcr)克隆得到的雌激素相關(guān)受體基因的序列，通過半定量rt-pcr技術(shù)，確定氟啶蟲胺腈抗性品系中err基因表達(dá)量上調(diào)的基因，結(jié)果顯示在氟啶蟲胺腈的抗性品系中l(wèi)serr表達(dá)水平上調(diào)。

本發(fā)明根據(jù)氟啶蟲胺腈抗藥性灰飛虱、敏感性灰飛虱為研究材料，分別提取兩者的總rna，反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量pcr技術(shù)證實(shí)半定量rt-pcr的分析結(jié)果。設(shè)β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr分析，重復(fù)3次試驗(yàn)，反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線檢驗(yàn)，并按照法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，在熒光定量pcr擴(kuò)增中，所用引物的核苷酸序列為：

引物lserr-f:5′-caatgtgcgagccagaagtg-3′

引物lserr-r:5′-agcctattatgccgaccagttc-3′

熒光定量pcr的方法結(jié)果顯示，lserr的表達(dá)水平在氟啶蟲胺腈的抗性品系中是敏感品系的7.80+倍。

綜上可知，通過雌激素相關(guān)受體基因的鑒定克隆和基因表達(dá)分析，表明過表達(dá)的lserr基因調(diào)控灰飛虱對(duì)氟啶蟲胺腈的抗性形成，使得調(diào)控抗藥性基因lserr及其編碼的多肽在灰飛虱的抗藥性分子檢測(cè)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、研究相關(guān)的rnai技術(shù)手段

本發(fā)明根據(jù)灰飛虱的調(diào)控抗藥性基因lserr和綠色熒光蛋白基因gfp分別設(shè)計(jì)dsrna引物和dsgfp引物(注：本試驗(yàn)所用灰飛虱的體內(nèi)存在綠色熒光蛋白基因gfp)，之后，提取灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性品系的總rna，反轉(zhuǎn)錄，以灰飛虱cdna為模板，用加過t7序列的引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，合成dsrna模板和dsgfp模板。在pcr擴(kuò)增中，用于合成dsrna模板的引物為引物dslserr-f和引物dslserr-r，用于合成dsgfp模板的引物為引物dsgfp-f和引物dsgfp-r；

其中，引物dslserr-f的核苷酸序列為：

dslserr-f：5′-tcactacggtgtcgcatcc-3′，即seqidno.5，并在其5′端加t7啟動(dòng)子序列；

引物dslserr-r的核苷酸序列為：

dslserr-r：5′-ctcgcacattgtcaacatttct-3′，即seqidno.6，并在其5′端加t7啟動(dòng)子序列；

引物dsgfp-f的核苷酸序列為：

dsgfp-f：5′-aagttcagcgtgtccg-3′，即seqidno.8，并在其5′端加t7啟動(dòng)子序列；

引物dsgfp-r的核苷酸序列為：

dsgfp-r：5′-gaacggcatcaaggtg-3′，即seqidno.9，并在其5′端加t7啟動(dòng)子序列；

t7啟動(dòng)子序列：5′-taatacgactcactataggg-3′，即seqidno.7。

利用wizardsvgelandpcrclean-upsystem(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收試劑盒對(duì)dsrna模板和dsgfp模板進(jìn)行純化。使用t7ribomax^tmexpressrnaisystem(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)試劑盒利用純化產(chǎn)物合成dsrna和dsgfp。

人工液體飼料混合dsrna和dsgfp連續(xù)喂食灰飛虱5齡若蟲至成蟲，其中，處理組喂食含dsrna的飼料，其各基因dsrna的濃度均為0.20μg/μl；對(duì)照組喂食不含dsrna的飼料。每組喂食3管，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

采用點(diǎn)滴法對(duì)干擾后抗性灰飛虱成蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，同時(shí)取處理組的灰飛虱成蟲，提取總rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna第一條鏈，用實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)lserr表達(dá)量的變化。

本發(fā)明研究中，用抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr的dsrna和dsgfp喂食灰飛虱的五齡若蟲直至成蟲，以喂食無dsrna的營(yíng)養(yǎng)液為ck，對(duì)喂食干擾后的灰飛虱成蟲進(jìn)行毒理分析。在研究過程中，由于綠色熒光蛋白基因gfp在灰飛虱體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，可以作為rna干擾脫靶效應(yīng)的報(bào)告基因。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)沉默氟啶蟲胺腈抗性相關(guān)的lserr基因后，可以顯著地提高灰飛虱對(duì)氟啶蟲胺腈的敏感性，因此lserr是調(diào)控氟啶蟲胺腈抗性形成的關(guān)鍵基因。通過合成lserr基因的dsrna進(jìn)行喂食rnai可以降低靶基因的表達(dá)量，增加灰飛虱對(duì)殺蟲劑的敏感性，因此lserr基因雙鏈rna的合成在灰飛虱抗性治理方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3、研究成果的總結(jié)

本發(fā)明通過對(duì)灰飛虱轉(zhuǎn)錄組的分析，獲得了灰飛虱雌激素相關(guān)受體基因，通過rt-pcr技術(shù)克隆鑒定，獲得灰飛虱lserr基因序列。通過半定量rt-pcr和熒光定量pcr技術(shù)對(duì)灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性品系和敏感品系進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)lserr基因表達(dá)上調(diào)，利用race技術(shù)獲得lserr全長(zhǎng)基因，然后以lserr基因片段為模板合成相應(yīng)dsrna，并利用喂食目的片段dsrna的方法分析lserr基因在rnai沉默后灰飛虱中l(wèi)serrmrna的表達(dá)水平，并對(duì)抗性灰飛虱成蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。以上研究結(jié)果表明，lserr基因的分離克隆，對(duì)于灰飛虱高靈敏度的抗性分子檢測(cè)和灰飛虱的抗性治理具有重要作用。

本發(fā)明利用rnai技術(shù)，通過喂食dsrna降低灰飛虱抗藥性，使灰飛虱更容易被殺蟲劑殺滅，可有效避免社會(huì)公眾誤認(rèn)為該dsrna本身帶有致死毒性或發(fā)育/繁殖毒性，這無疑會(huì)使后續(xù)的推廣工作更加順利。

二、本發(fā)明的具體實(shí)施例：

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不限于這些例子。

本發(fā)明所用的氟啶蟲胺腈抗性品系2010年采自江蘇南京市江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，用氟啶蟲胺腈連續(xù)篩選35代獲得；敏感品系2010年采自江蘇南京市江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，在未接觸任何殺蟲劑情況下室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)獲得。

本發(fā)明所涉及的試劑均為市購(gòu)。

下述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1.lserr基因的克隆和序列分析

本發(fā)明通過構(gòu)建灰飛虱轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序的方法獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上獲得lserr基因片段。

(1)灰飛虱總rna提取。

以敏感品系灰飛虱為研究材料，選取灰飛虱卵、1-5齡若蟲和雌雄成蟲使用trizol總rna提取試劑盒(上海英駿生物技術(shù)有限公司)對(duì)其進(jìn)行混合提取，操作方法參照試劑盒說明書。提取的灰飛虱總rna使用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，用nanodrop1000核酸蛋白定量?jī)x對(duì)rna的濃度以及吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)rna的質(zhì)量和完整性，然后放入超低溫冰箱中在-80℃條件下凍存。

(2)cdna模板的制備。

以灰飛虱總rna為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒primescript^tmrtreagentkit(寶生物工程大連有限公司)合成cdna第一鏈，反應(yīng)條件為：500ng總rna，2μl5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)，補(bǔ)足到10μlrnasefreeddh2o。pcr儀中完成cdna合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cdna置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)引物的設(shè)計(jì)。

本發(fā)明以轉(zhuǎn)錄組中l(wèi)serr基因片段序列，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物為

lserr-f′：5′-ttcactacggtgtcgcatcc-3′；

lserr-r′：5′-ctcgcacattgtcaacatttct-3′。

引物lserr-f′和lserr-r′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(4)pcr擴(kuò)增、回收純化及測(cè)序。

以灰飛虱的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl10×pcrbuffer，2.5μlmgcl2，2μldntps，1μlcdna，1μllserr-f′(10μmol/l)，1μllserr-r′(10μmol/l)，0.25μltaqdnapolymerase，14.75μlddh2o。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳回收，利用axyprepdnagelextractionkit(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)純化目的dna片段，然后將純化好的dna片段利用peasy-t3clothingkit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接轉(zhuǎn)化，挑斑后搖菌，將菌液送南京金斯瑞公司進(jìn)行序列測(cè)定。

(5)測(cè)序結(jié)果分析。

用基因探索者軟件分析所測(cè)得的序列，并通過ncbi的blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析，用genedoc進(jìn)行比較分析。

(6)lserr全長(zhǎng)基因克隆。

以灰飛虱總rna為模板，使用clontech^tmsmarter反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，按照操作步驟進(jìn)行5′(3′)-racecdna第一鏈的合成，在pcr儀完成rna變性反應(yīng)，條件為72℃3min，42℃2min。pcr儀中完成cdna合成：42℃90min，70℃10min，用tricine-edtabuffer稀釋后總體積約100μl。

(7)全長(zhǎng)引物設(shè)計(jì)。

lserr基因的5′和3′端引物使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的5′端引物和5′端巢式引物分別為

5lserrgsp：5′-tgttgaaggcggcggcatagttgt-3′；

5lserrngsp：5′-cgtgatagggctggtcggggttgc-3′。

設(shè)計(jì)的3′端引物和3′端巢式引物分別為

3lserrgsp：5′-gctgtgcttggtctgcggggatgt-3′；

3lserrngsp：5′-cgcaaccccgaccagccctatcac-3′。

lserr基因cds擴(kuò)增引物分別為：

lserr-cds-f：5′-ggctttacactttatgcttccg-3′；

lserr-cds-r：5′-cagtcttttgcttgtctctcg-3′。

(8)pcr擴(kuò)增。

lserr基因全長(zhǎng)克隆以灰飛虱的5′(3′)cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl10×labuffer，2.5μlmgcl2，4μldntps，1μlcdna，2.5μlupm，1μlgsp(10μmol/l)，0.25μllataqdnapolymerase，12.25μlddh2o。擴(kuò)增程序：94℃3min，94℃30s，72℃3min5個(gè)循環(huán)，94℃30s，70℃30s，72℃3min5個(gè)循環(huán)，94℃30s，68℃30s，72℃3min25個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持。所得pcr產(chǎn)物，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。

lserr基因cds克隆以灰飛虱的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl10×pcrbuffer，2.5μlmgcl2，4μldntps，1μlcdna，1μllserr-cds-f(10μmol/l)，1μllserr-cds-r(10μmol/l)，0.25μllataqdnapolymerase，12.75μlddh2o。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，55℃40s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，12℃保持。

回收純化、測(cè)序及測(cè)序結(jié)果分析同本實(shí)施例中(4)和(5)的相關(guān)步驟。

灰飛虱lserr基因cds全長(zhǎng)電泳圖如圖1所示。1泳道為灰飛虱pcr電泳結(jié)果；m為dl2000marker。

實(shí)施例2.灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性品系和敏感品系中l(wèi)serr基因的半定量分析

選取成蟲期的氟啶蟲胺腈抗藥性和敏感性灰飛虱材料，利用半定量rt-pcr分析這些材料中l(wèi)serr基因的表達(dá)水平，從而可以快速獲得lserr基因表達(dá)水平與氟啶蟲胺腈抗藥性的關(guān)系。

(1)灰飛虱總rna提取。

以成蟲期的氟啶蟲胺腈抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，使用svtotalrna提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)依照操作步驟提取總rna，提取的灰飛虱總rna使用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，用nanodrop100核酸蛋白定量?jī)x對(duì)rna的濃度以及吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)rna的質(zhì)量和完整性，然后放入超低溫冰箱中在-80℃條件下凍存。

(2)cdna模板的制備。

以灰飛虱總rna為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒primescript^tmrtreagentkit(寶生物工程大連有限公司)合成cdna第一鏈，反應(yīng)條件為：500ng總rna，2μl5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)，補(bǔ)足到10μlrnasefreeddh2o。pcr儀中完成cdna合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cdna置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)半定量rt-pcr。

利用實(shí)施例1中l(wèi)serr基因片段鑒定引物lserr-f′和lserr-r′，以氟啶蟲胺腈抗藥性和敏感性灰飛虱cdna為模板進(jìn)行半定量rt-pcr擴(kuò)增。內(nèi)參基因選用β-actin(353bp)，上游引物序列是5′-agtgcccatctacgaaggtt-3′，下游引物序列是5′-cagtatccatgagaccacctaca-3′。pcr反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl10×pcrbuffer，2.5μlmgcl2，2μldntps，1μlcdna，1μllserr-f′(10μmol/l)，1μllserr-r′(10μmol/l)，0.25μltaqdnapolymerase，14.75μlddh2o。pcr反應(yīng)條件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，進(jìn)行25-30個(gè)循環(huán)；72℃10min；12℃保持。所得pcr產(chǎn)物，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。半定量rt-pcr分析執(zhí)行三次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行三次操作重復(fù)。

灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性和敏感品系中l(wèi)serr基因半定量電泳圖如圖2所示，r為抗性品系，s為敏感品系。結(jié)果顯示在氟啶蟲胺腈的抗性品系中l(wèi)serr表達(dá)水平上調(diào)。

實(shí)施例3.灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性和敏感品系中l(wèi)serr基因熒光定量分析

選取成蟲期的氟啶蟲胺腈抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，利用熒光定量pcr分析這些材料中l(wèi)serr基因的表達(dá)水平，從而可以證實(shí)lserr基因表達(dá)水平與氟啶蟲胺腈抗藥性的關(guān)系。

(1)熒光定量pcr。

利用實(shí)施例2中的氟啶蟲胺腈抗藥性和敏感性灰飛虱cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。lserr基因和內(nèi)參β-actin的引物使用beacondesigner7軟件設(shè)計(jì)，lserr基因引物為前文所述的引物lserr-f′和引物lserr-r′，內(nèi)參β-actin的引物序列是：

5′-tccgagacatcaaggtgaaactg-3′

和5′-tgcttccatacccaagaaagacg-3′。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr試驗(yàn)操作在abi7300實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行，其反應(yīng)體系及程序參照premixextaqtm說明書進(jìn)行。

(2)本實(shí)驗(yàn)將采用方法比較lserr基因在氟啶蟲胺腈品系和敏感品系中的表達(dá)量差異，計(jì)算公式為：

δδct＝(ct目標(biāo)基因-ct持家基因)實(shí)驗(yàn)組-(ct目標(biāo)基因-ct持家基因)對(duì)照組。

每個(gè)品系設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)使用spss13.0軟件完成(spssinc.,chicago,il,usa)。數(shù)據(jù)以mean±se表示，mrna相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析(one-wayanova)和鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)比較目標(biāo)基因在各品系中的表達(dá)量的差異。

灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性和敏感品系中l(wèi)serr基因熒光定量分析結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，lserr的表達(dá)水平在氟啶蟲胺腈的抗性品系中是敏感品系的7.80+倍。

實(shí)施例4.體外合成灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr的dsrna和綠色熒光蛋白基因gfp的dsgfp

(1)以灰飛虱氟啶蟲胺腈抗性品系為研究材料，灰飛虱總rna提取和cdna模板的制備依據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行操作。

(2)引物設(shè)計(jì)。

引物使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)，調(diào)控抗藥性基因lserr的dsrna和綠色熒光蛋白gfp的dsgfp的引物的核苷酸序列為：

dslserr-f：5′-tcactacggtgtcgcatcc-3′；

dslserr-r：5′-ctcgcacattgtcaacatttct-3′；

dsgfp-f：5′-aagttcagcgtgtccg-3′；

dsgfp-r：5′-gaacggcatcaaggtg-3′。

以上上下游引物序列均在5′端加t7啟動(dòng)子序列，t7啟動(dòng)子序列：5′-taatacgactcactataggg-3′。

(3)合成dsrna模板和dsgfp模板。

以灰飛虱cdna為模板，用加過t7序列的引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr反應(yīng)體系總體積為50μl：5μl10×pcrbuffer，4μlmgcl2，4μldntps，2μlcdna，1μlprimerf(10μmol/l)，1μlprimerr(10μmol/l)，0.25μltaqdnapolymerase，32.75μlddh2o。

為達(dá)到dsrna合成需要，上述pcr體系需增加10～20倍。

pcr反應(yīng)條件:94℃3min，94℃30s，68℃30s，72℃1min10個(gè)循環(huán)，94℃30s，72℃1min28個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持。

(4)dsrna模板和dsgfp模板的回收純化。

選擇wizardsvgelandpcrclean-upsystem(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收試劑盒對(duì)pcr電泳產(chǎn)物進(jìn)行純化，操作步驟依據(jù)說明書進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)dsrna和dsgfp的體外合成。

使用t7ribomax^tmexpressrnaisystem試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)合成dsrna和dsgfp，操作方法依據(jù)說明書進(jìn)行。最后加入2～5倍反應(yīng)體系的無核酸酶水溶解產(chǎn)物，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

灰飛虱的含有t7啟動(dòng)子的抗藥性基因lserr序列如圖4所示；含有t7啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因gfp序列如圖5所示?？顾幮曰騦serr體外合成的dsrna、以及綠色熒光蛋白基因gfp體外合成的dsgfp的電泳圖如圖6所示。

實(shí)施例5.灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr的rnai效應(yīng)檢測(cè)

參照褐飛虱液體飼料配方及飼養(yǎng)方法(fu等，2001)，稍加改進(jìn)后進(jìn)行飼喂。具體步驟如下：

s1.取兩端開口的玻璃管(12×3cm)，一端用細(xì)紗布封好，用吸蟲器吸取2齡初若蟲小心轉(zhuǎn)入玻璃管，每管20頭左右，用細(xì)紗布封口；

s2.在超凈臺(tái)中，輕輕拍打玻璃管使蟲子集中到玻璃管一端，然后取下另一端的紗布，將準(zhǔn)備好的封口膜拉成正方形，貼紙面朝外蓋住玻璃管口；

s3.用移液槍吸取50μl飼料及相應(yīng)濃度的dsrna，滴在膜中央輕微吸打混合，再取一片新的封口膜，貼紙面朝下蓋在滴有液體飼料的封口膜上，將飼料封于兩層膜間；

s4.添加飼料后將玻璃管平放到養(yǎng)蟲架上，玻璃管上蓋一層黑布，只露出喂食飼料端，利用趨光性吸引灰飛虱到飼料端取食；

s5.每24h換一次新鮮飼料，并統(tǒng)計(jì)灰飛虱的死亡率。實(shí)驗(yàn)室溫度為27℃±1℃、相對(duì)濕度70-80％、24小時(shí)連續(xù)光照。處理組喂食含dsrna的飼料，其各基因dsrna的濃度均為0.20μg/μl；對(duì)照組喂食不含dsrna的飼料。每組喂食3管，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

灰飛虱飼料配方與申請(qǐng)?zhí)朿n201610432190.3，名稱《灰飛虱抗藥性基因cyp6ay3v2、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)中實(shí)施例6相同。

(1)氟啶蟲胺腈生物測(cè)定。

選取5齡的灰飛虱連續(xù)喂食含有dsrna的液體人工飼料至成蟲，采用點(diǎn)滴法對(duì)干擾過后抗性灰飛虱成蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。每個(gè)濃度使用30頭成蟲測(cè)試，重復(fù)三次。氟啶蟲胺腈品系與對(duì)照組采用50ng/頭和25ng/頭的濃度進(jìn)行毒理分析。處理后24h檢查死亡率。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法為duncantest(p<0.05)，字母不同代表有顯著差異。統(tǒng)計(jì)軟件為spss13.0。

(2)實(shí)時(shí)定量pcr引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)已知灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr和綠色熒光蛋白基因gfp的序列，運(yùn)用beacondesigner7軟件設(shè)計(jì)pcr引物，以β-actin為內(nèi)參基因。

實(shí)時(shí)定量pcr上下游引物設(shè)計(jì)如下：

lserr-f：5′-caatgtgcgagccagaagtg-3′；

lserr-r:5′-agcctattatgccgaccagttc-3′；

gfp-f：5′-ttatccgctcacaattccacac-3′；

gfp-r：5′-atacgcaaaccgcctctcc-3′；

β-actinq-f：5′-tccgagacatcaaggtgaaactg-3′；

β-actinq-r：5′-tgcttccatacccaagaaagacg-3′；

(4)實(shí)時(shí)定量pcr。

灰飛虱總rna提取和cdna模板的制備，依據(jù)實(shí)施例2的相關(guān)步驟進(jìn)行。熒光定量pcr試驗(yàn)操作、反應(yīng)體系、程序及數(shù)據(jù)分析依據(jù)實(shí)施例3的相關(guān)步驟進(jìn)行。

喂食灰飛虱dsrna后其基因表達(dá)量變化結(jié)果如圖7所示。

灰飛虱抗藥性雌激素相關(guān)受體基因lserr沉默后氟啶蟲胺腈抗性的毒理分析結(jié)果如圖8所示，分別以50ng/頭濃度和25ng/頭濃度處理氟啶蟲胺腈抗性品系。

結(jié)果表明，

對(duì)于灰飛虱的氟啶蟲胺腈抗性品系：

50ng/頭氟啶蟲胺腈濃度處理干擾后灰飛虱的氟啶蟲胺腈抗性品系結(jié)果顯示，喂食dsgfp和無dsrna的營(yíng)養(yǎng)液的灰飛虱，毒理死亡率分別為68.35％和67.44％，喂食lserr基因的dsrna的灰飛虱死亡率為91.02％。

25ng/頭氟啶蟲胺腈濃度處理干擾后灰飛虱的氟啶蟲胺腈抗性品系結(jié)果顯示，喂食dsgfp和無dsrna的營(yíng)養(yǎng)液的灰飛虱，毒理死亡率分別為42.34％和43.14％，而喂食lserr基因的dsrna的灰飛虱死亡率為79.12％。

以上結(jié)果表明，沉默氟啶蟲胺腈抗性相關(guān)的lserr基因后，可以顯著地提高灰飛虱對(duì)氟啶蟲胺腈的敏感性。

除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>灰飛虱抗藥性雄激素相關(guān)受體基因lserr、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用

<160>9

<210>seqidno.1

<211>1854

<212>dna

<213>灰飛虱

<220>

<223>灰飛虱抗藥性雄激素相關(guān)受體基因lserr

<400>1

ttggaccgattcattaatgcagctggcacgacaggttttcccgaatggaaagcgggcagt60

gagcgccacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacacttt120

atgcttccgggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaa180

cagctatgaccatgattacgccaagctatgtaggtgacactatagaatactcaagctatg240

catccaacgcgttgggagctctcccatatggtcgacctgcaggcggccgcgaattcacta300

gtgattgggatcgcccttcgtgatagggctggtcggggttgctgttgccttactgtttga360

tgtaccccggaaaccagtatggaacaaatatggatcgatcagatggtctctatgatgtct420

tctgacagttcgaccgggatggttcacataaaaaaagaagacgagtattgcgatacaaag480

gcctttattgagatgggccctcactcgccggggagtcctgatcaacaacaatactgttca540

tcgacaactcagtcactgggagaaacactactaagcatagaagaaggtataaaagaagaa600

gatcttcctcgaaggctgtgcttggtctgcggggatgtggcatctggctttcactacggt660

gtcgcatcctgtgaggcctgcaaagcgttcttcaaaagaactattcagggtaacatagag720

tacacgtgcccggcggccaatgactgcgagatcaacaagcggcggcgcaaggcgtgccag780

gcgtgccgcttccagaagtgcctgcgcatgggcatgctgaaggagggcgtgcgcctcgac840

cgggtaaggggcggccgccagaagtaccggcgcaaccccgaccagccctatcacgccacc900

cagcacaactatgccgccgccttcaacaagttcccggtgccactagaagataataagatg960

ctagaaatgttgacaatgtgcgagccagaagtgctgagctgcctgcagccgacgagccac1020

tcgtcgagcgactcgccgatgctgaacataatcgccatgctgagcgacctgtacgaccgc1080

gaactggtcggcataataggctgggccaaacagattcccggcttcaccgatctgtcgctc1140

aacgaccaaatgcgcctgctgcaaagcacctgggccgaaattctcacgctcagcctcgcc1200

tatcggtcgctgccgcacaccggcaagctcaggttcgccgccaacttcagcctcgacgag1260

agacaagcaaaagactgcgacgcccaagaggtctaccaagtgtgtgtacaaataatagaa1320

aggttggaaaggctatcaatagcaaaggaagagtactttctgttgaaagcgcttgttctg1380

gcaaattccgacgttcgactcgacgacttttcatcgttgaaaaagttcagggactcgatt1440

ctctcagctctgaccgactgtgtcacaattattaggccaaacactagcacaagtcacatg1500

caaaacctgttgctatgtttgcctgcactgcgccaagccaatcagacagtgcgaagattc1560

tgggtgggcattcatcgcgagggaaagattctgatgaacaaattattcgttgaaatgttg1620

gaagcctgcattcggtaagacaaagccgggttttcatttcacacaaacatgtagaagctt1680

tatgtaaagtacatcttcaagagaccaaatcgctgtcatgtagaattatcattatcctcg1740

tcagaaactgttgttagccttttttatcttacaaagtgtgtaatgtcagcaggtaggccg1800

ccatatttaagaatttctaatttgccggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1854

<210>seqidno.2

<211>419

<212>prt

<213>灰飛虱

<220>

<223>灰飛虱抗藥性雄激素相關(guān)受體基因lserr編碼的氨基酸序列

<400>2

metgluglniletrpileaspglnmetvalsermetmetserserasp

151015

serserthrglymetvalhisilelyslysgluaspglutyrcysasp

202530

thrlysalapheileglumetglyprohisserproglyserproasp

354045

glnglnglntyrcysserserthrthrglnserleuglygluthrleu

505560

leuserileglugluglyilelysglugluaspleuproargargleu

65707580

cysleuvalcysglyaspvalalaserglyphehistyrglyvalala

859095

sercysglualacyslysalaphephelysargthrileglnglyasn

100105110

ileglutyrthrcysproalaalaasnaspcysgluileasnlysarg

115120125

argarglysalacysglnalacysargpheglnlyscysleuargmet

130135140

glymetleulysgluglyvalargleuaspargvalargglyglyarg

145150155160

glnlystyrargargasnproaspglnprotyrhisalathrglnhis

165170175

asntyralaalaalapheasnlyspheprovalproleugluaspasn

180185190

lysmetleuglumetleuthrmetcysgluprogluvalleusercys

195200205

leuglnprothrserhisserserseraspserprometleuasnile

210215220

ilealametleuseraspleutyrasparggluleuvalglyileile

225230235240

glytrpalalysglnileproglyphethraspleuserleuasnasp

245250255

glnmetargleuleuglnserthrtrpalagluileleuthrleuser

260265270

leualatyrargserleuprohisthrglylysleuargphealaala

275280285

asnpheserleuaspgluargglnalalysaspcysaspalaglnglu

290295300

valtyrglnvalcysvalglnileilegluargleugluargleuser

305310315320

ilealalysgluglutyrpheleuleulysalaleuvalleualaasn

325330335

seraspvalargleuaspasppheserserleulyslyspheargasp

340345350

serileleuseralaleuthraspcysvalthrileileargproasn

355360365

thrserthrserhismetglnasnleuleuleucysleuproalaleu

370375380

argglnalaasnglnthrvalargargphetrpvalglyilehisarg

385390395400

gluglylysileleumetasnlysleuphevalglumetleugluala

405410415

cysilearg

<210>seqidno.3

<211>334

<212>dna

<213>灰飛虱

<220>

<223>灰飛虱抗藥性雄激素相關(guān)受體基因lserr片段

<400>3

tcactacggtgtcgcatcctgtgaggcctgcaaagcgttcttcaaaagaactattcaggg60

taacatagagtacacgtgcccggcggccaatgactgcgagatcaacaagcggcggcgcaa120

ggcgtgccaggcgtgccgcttccagaagtgcctgcgcatgggcatgctgaaggagggcgt180

gcgcctcgaccgggtaaggggcggccgccagaagtaccggcgcaaccccgaccagcccta240

tcacgccacccagcacaactatgccgccgccttcaacaagttcccggtgccactagaaga300

taataagatgctagaaatgttgacaatgtgcgag334

<210>seqidno.4

<211>414

<212>dna

<213>灰飛虱

<220>

<223>灰飛虱綠色熒光蛋白基因gfp片段

<400>4

aagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaag60

ttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacccacgtgaccaccctgacc120

tacggcgtgcagcgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaag180

tccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaac240

tacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctg300

aagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactac360

aacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtg414

<210>seqidno.5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物dslserr-f的主要序列

<400>5

tcactacggtgtcgcatcc19

<210>seqidno.6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物dslserr-r的主要序列

<400>6

ctcgcacattgtcaacatttct22

<210>seqidno.7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7啟動(dòng)子序列

<400>7

taatacgactcactataggg20

<210>seqidno.8

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物dsgfp-f的主要序列

<400>8

aagttcagcgtgtccg16

<210>seqidno.9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物dsgfp-r的主要序列

<400>9

gaacggcatcaaggtg16