本發(fā)明專利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/gb2010/001277，國(guó)際申請(qǐng)日為2010年7月1日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮椤?01080035140.2”，發(fā)明名稱為“t細(xì)胞受體”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及結(jié)合ylepgpvta肽(衍生自gp100蛋白)的t細(xì)胞受體(tcr)，所述肽以肽-hla-a2復(fù)合物呈遞，相對(duì)于天然gp100tcrα和/或β可變域，所述tcr發(fā)生突變并且對(duì)所述復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少是參比gp100tcr的兩倍。發(fā)明背景ylepgpvta(seqidno：1)肽對(duì)應(yīng)于人糖蛋白100(gp100)的氨基酸殘基號(hào)280-288。gp100在黑色素瘤癌細(xì)胞上廣泛而顯著地過量表達(dá)。例如，一項(xiàng)研究(trefzer等.，(2006)melanomares.16(2)：137-45)發(fā)現(xiàn)28位黑色素瘤患者的192例黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中有82％表達(dá)gp100。幾項(xiàng)研究報(bào)道了黑色素瘤組織中g(shù)p100表達(dá)水平較高(hofbauer等.，(2004)jimmunother.27(1)：73-8，barrow等.，(2006)clincancerres.12：764-71)。ylepgpvta(seqidno：1)肽由gp100+/hla-a2癌細(xì)胞上的i類hla分子呈遞。(salgaller等.，(1996)cancerres56：4749-4757)。因此，ylepgpvtahla-a2復(fù)合物提供本發(fā)明tcr能靶向的癌癥標(biāo)記物。例如，本發(fā)明tcr可用于將細(xì)胞毒性劑遞送至癌細(xì)胞的目的，或可轉(zhuǎn)化入t-細(xì)胞，從而使得它們能破壞呈遞hla復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞，以便在稱為過繼性治療的治療過程中給予患者。然而，為前一目的，如果tcr具有較高的親和力和/或較慢的解離速率，從而該tcr能長(zhǎng)期駐留在所靶向的腫瘤細(xì)胞上，則是理想的。為后一目的，如果tcr對(duì)肽-hla復(fù)合物相比于具有該復(fù)合物特異性的天然tcr具有較高的親和力和/或較低的解離速率，但不如前一目的的親和力那樣高，則是理想的。親和力的急劇增加與tcr基因-修飾的cd8t細(xì)胞中抗原特異性喪失相關(guān)，從而能導(dǎo)致這些tcr-轉(zhuǎn)染cd8t細(xì)胞的非特異性激活，因此中等親和力tcr是過繼性治療所優(yōu)選的(參見zhao等.，(2007)jimmunol.179：5845-54；robbins等.，(2008)jimmunol.180：6116-31；還參見公布的wo2008/038002)。本發(fā)明提供此類tcr。采用國(guó)際免疫遺傳學(xué)(imgt)tcr命名法描述tcr，將其與tcr序列的imgt公開數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)。天然α-β異源二聚tcr具有α鏈和β鏈。廣義上，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。各可變區(qū)包含嵌合在框架序列中的3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定區(qū))，其中一個(gè)是稱為cdr3的超變區(qū)。根據(jù)框架、cdr1和cdr2序列以及部分確定的cdr3序列，α鏈可變(vα)區(qū)可分成幾類，β鏈可變(vβ)區(qū)可分成幾類。在imgt命名法中，通過唯一的trav編號(hào)指代vα類型。因此，“trav17”限定了具有獨(dú)特框架及cdr1和cdr2序列和cdr3序列的tcrvα區(qū)，所述cdr3序列部分由tcr之間保守性的氨基酸序列確定，但其還包含tcr之間不同的氨基酸序列?！皌rbv19”以相同方式限定了具有獨(dú)特框架及cdr1和cdr2序列的tcrvβ區(qū)，但僅包含部分確定的cdr3序列。通過獨(dú)特的imgttraj和trbj命名法類似地確定tcr的連接區(qū)，通過imgttrac和trbc命名法確定恒定區(qū)。imgt命名法通過縮寫trbd指代β鏈多變區(qū)，如上所述，連鎖的trbd/trbj區(qū)常一起視作連接區(qū)。αβtcr的α和β鏈常視作各自具有兩個(gè)“結(jié)構(gòu)域”，即，可變域和恒定域。可變域由連鎖的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。因此，在本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“tcrα可變域”指連鎖的trav和traj區(qū)，術(shù)語tcrα恒定域指胞外trac區(qū)或c-末端截短的trac序列。類似地，術(shù)語“tcrβ可變域”指連鎖的trbv和trbd/trbj區(qū)，術(shù)語tcrβ恒定域指胞外trbc區(qū)或c-末端截短的trbc序列。tcr領(lǐng)域的工作人員廣為知曉并可得到imgt命名法確定的獨(dú)特序列。例如，可在imgt公開數(shù)據(jù)庫中找到?！啊秚細(xì)胞受體手冊(cè)(tcellreceptorfactsbook)》”，(2001)，lefranc和lefranc，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，isbn0-12-441352-8還公開了imgt命名法確定的序列，但由于其公布日期和隨后的時(shí)間滯后，有時(shí)需要參考imgt數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證其中的信息。我們證實(shí)了天然gp100tcr克隆具有以下α鏈和β鏈v、j和c基因應(yīng)用：α鏈-trav17/traj29/trac(天然gp100tcrα鏈的胞外序列見seqidno：2)。β鏈：-trbv19*01/trbd1/trbj2-7*01/trbc2(天然gp100tcrβ鏈的胞外序列見seqidno：3)。(注意：trbv19序列具有3個(gè)等位基因變體，在imgt命名法中分別稱為trbv19*01、*02和*03，上述天然gp100tcr克隆具有*01變異。同樣，trbj2-7序列具有兩個(gè)已知的變異，上述tcr克隆中存在的是*01序列。還應(yīng)注意，缺乏”*”限定符表示相關(guān)序列僅已知一種等位基因。)術(shù)語“野生型tcr”、“天然tcr”、“野生型gp100tcr”和“天然gp100tcr”在文本同義使用，指代具有胞外α和β鏈seqidno：2和3的該天然產(chǎn)生的tcr。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供具有結(jié)合ylepgpvta(seqidno：1)hla-a2復(fù)合物特性的包含tcrα可變域和/或tcrβ可變域的t細(xì)胞受體(tcr)，其特征在于所述tcr(i)相對(duì)于具有胞外α和β鏈序列seqidno：2和3的天然gp100tcr，在其α鏈可變域(seqidno：2的氨基酸1-109)和/或其β鏈可變域(seqidno：3的氨基酸1-112)中發(fā)生突變；和(ii)對(duì)ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gp100tcr的至少兩倍，所述參比gp100tcr具有胞外α鏈序列seqidno：45和胞外β鏈序列seqidno：46。注意，seqidno：45是天然α鏈胞外序列idno：2，除了c157取代了t157(即，trac的t48)和k113取代了n113。類似地，seqidno：46是天然β鏈胞外序列idno：3，除了c169取代了s169(即，trbc2的s57)，a187取代了c187，d201取代了n201。相比于天然α和β鏈胞外序列，這些半胱氨酸取代能形成穩(wěn)定重折疊的可溶性tcr的鏈間二硫鍵，即，通過重折疊胞外α和β鏈形成的tcr。利用穩(wěn)定的二硫鍵連接的可溶性tcr作為參比tcr能更方便地評(píng)估結(jié)合親和力和結(jié)合半衰期。與天然α和β鏈seqidno：2和3相比，α鏈seqidno：45和β鏈seqidno：46中的其它突變是“沉默突變”，意味著相對(duì)于天然序列，它們不影響結(jié)合親和力或結(jié)合半衰期。因此，如果本發(fā)明tcr對(duì)ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gp100tcr的至少兩倍，其還隱含符合上述天然gp100tcr克隆的那些標(biāo)準(zhǔn)。下文中“具有胞外α鏈序列seqidno：45和胞外β鏈序列seqidno：46的參比gp100tcr”與“參比tcr”或“參比gp100tcr”同義?？赏ㄟ^任何合適的方法測(cè)定結(jié)合親和力(與平衡參數(shù)kd成反比)和結(jié)合半衰期(表示為t1/2)。應(yīng)該了解，tcr的親和力翻倍導(dǎo)致kd減半。t1/2計(jì)算為ln2除以解離-速率(koff)。因此，t1/2翻倍導(dǎo)致koff減半。tcr的kd和koff值通常檢測(cè)為tcr的可溶性形式，即，截短以除去疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域殘基的那些形式。因此，應(yīng)該了解，給定的tcr符合以下要求，即，其對(duì)ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物具有結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期，如果可溶形式的該tcr符合該要求的話。優(yōu)選采用相同的試驗(yàn)方案檢測(cè)給定tcr的結(jié)合親和力或結(jié)合半衰期數(shù)次，例如3次或更多次，取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本文實(shí)施例3的表面等離振子共振(biacore)方法進(jìn)行這些檢測(cè)。該方法檢測(cè)到參比gp100tcr的kd約為19μm，koff約為1s-1(即，t1/2約為0.7s)。如本文所述，ylepgpvta是在hlaa2復(fù)合物中呈遞的天然gp100280-288肽。然而，眾所周知，略作修飾形式的該肽(ylepgpvtv(seqidno：6))顯示對(duì)hla-a2的結(jié)合增強(qiáng)，從而增加了肽-hla復(fù)合物的穩(wěn)定性(salgaller等.(1996)cancerres56：4749-57)。因此，變體ylepgpvtv肽-hla-a2復(fù)合物更適于評(píng)估能結(jié)合ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物的潛在tcr的試驗(yàn)工作。此類tcr結(jié)合兩類肽hla復(fù)合物的kd和t1/2和基本上相似。本發(fā)明tcr對(duì)ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gp100tcr的至少兩倍，同時(shí)保留了可接受的ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物特異性，例如，與參比gp100tcr相似。通常，相比于參比gp100tcr，需要作為靶向劑以便將治療劑，例如細(xì)胞毒性或免疫效應(yīng)劑遞送至呈遞hla復(fù)合物的細(xì)胞的tcr對(duì)所述ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物應(yīng)具有高很多的親和力和/或長(zhǎng)很多的結(jié)合半衰期。如果tcr需要為過繼性治療轉(zhuǎn)染t-細(xì)胞，通常要求，例如較低的親和力和/或較短的結(jié)合半衰期(雖然仍分別是參比tcr那些值的至少兩倍）。例如，本發(fā)明的tcr對(duì)復(fù)合物的kd可以是≤8μm、≤5μm、≤1μm、≤0.1μm、≤0.01μm、≤0.001μm或≤0.0001μm和/或?qū)?fù)合物的結(jié)合半衰期(t1/2)可以為≥1.5s、≥3s、≥10s、≥20s、≥40s、≥60s、≥600s或≥6000s。出于本發(fā)明的目的，tcr是具有至少一個(gè)tcrα和/或tcrβ可變域的部分。它們通常同時(shí)包含tcrα可變域和tcrβ可變域。它們可以是αβ異源二聚體或是單鏈形式。為用作靶向劑以便將治療劑遞送至抗原呈遞細(xì)胞，αβ異源二聚tcr可以是可溶形式(即，不具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的跨膜區(qū))。對(duì)于穩(wěn)定性而言，此類可溶性tcr優(yōu)選在各恒定域的殘基之間引入二硫鍵，例如wo03/020763中所述?？稍谝粋€(gè)或多個(gè)c末端截短本發(fā)明αβ異源二聚體中存在的一個(gè)或兩個(gè)恒定域的，例如最多15、或最多10或最多8個(gè)或更少的氨基酸。為用于過繼性治療，可將αβ異源二聚tcr，例如，作為具有胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)鏈轉(zhuǎn)染。如果需要，各恒定域的殘基之間可存在引入的二硫鍵(參見，例如wo2006/000830)。為用作靶向劑將治療劑遞送至抗原呈遞細(xì)胞，可溶性tcr可以是單鏈形式。這些可包括vα-l-vβ、vβ-l-vα、vα-cα-l-vβ或vα-l-vβ-cβ類型的αβtcr多肽，其中vα和vβ分別是tcrα和β可變區(qū)，cα和cβ分別是tcrα和β恒定區(qū)，l是接頭序列。過繼性治療可利用全長(zhǎng)tcr序列，其摻入跨膜域同時(shí)作為天然二硫鍵和引入的二硫鍵形式，或作為單鏈tcr構(gòu)建物；或/和與其相似的變化形式。無論何種形式，與具有胞外α和β鏈序列seqidno：2和3的天然gp100tcr相比，本發(fā)明tcr在其α可變域(從seqidno：2的s1延伸到a109)和/或β可變域(從seqidno：3的d1延伸到t112)發(fā)生突變。天然gp100tcr或參比gp100tcr可用作模板，其中引入各種突變導(dǎo)致本發(fā)明tcr與ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物之間相互作用的親和力高和/或解離速率慢。本發(fā)明的實(shí)施方式包括與從seqidno：2的s1延伸到a109的α鏈可變域和/或從seqidno：3的d1延伸到t112的β鏈可變域相比，在至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和/或可變域框架區(qū)中突變的tcr?？刹捎萌魏魏线m的方法進(jìn)行突變，包括但不限于依據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的那些、依據(jù)限制性酶的克隆或不依賴連接的克隆(lic)方法。許多標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教材詳述了這些方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)誘變和依據(jù)限制性酶的克隆的更多細(xì)節(jié)可參見sambrook和russell，(2001)《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(molecularcloning-alaboratorymanual)》(第3版)cshl出版社。lic方法的更多信息可見(rashtchian，(1995)curropinbiotechnol6(1)：30-6)。產(chǎn)生本發(fā)明的高親和力gp100tcr的一種方法是從展示此類tcr的噬菌體顆粒的多樣性文庫中選擇，例如wo2004/044004所公開的。應(yīng)該注意，包含與參比gp100tcr相似的vα和vβ基因使用和由此的可變域氨基酸序列的任何αβtcr均可制備方便的模板tcr。然后可以在編碼模板αβtcr的一個(gè)或兩個(gè)可變域的dna中引入產(chǎn)生本發(fā)明的突變型高親和力tcr所需的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難了解，可通過許多方法，例如定點(diǎn)誘變來引入必需的突變。本發(fā)明的優(yōu)選tcr包括其α可變域與seqidno：2的氨基酸序列1-109具有至少90％(例如，至少93％和優(yōu)選至少94％)序列相同性(即，不到10％(或不到7％或優(yōu)選不到6％)的天然vα結(jié)構(gòu)域的殘基發(fā)生改變)，和/或其β可變域與seqidno：3的氨基酸序列1-112具有至少90％(例如，至少93％和優(yōu)選至少94％)序列相同性(即，不到10％(或不到7％或優(yōu)選不到6％)的天然vβ結(jié)構(gòu)域的殘基發(fā)生改變)的那些。單個(gè)改變包括單個(gè)插入、缺失或突變?？赏ㄟ^，例如手工或利用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列比對(duì)來測(cè)定序列相同性。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明tcr具有從seqidno：2的s1延伸至a109的α鏈可變域，除了94d、97l、98v或102g位中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基發(fā)生突變，和/或具有從seqidno：3的d1延伸至t112的β鏈可變域，除了27l、28n、29h、30d、31a、50q、51i、52v、53n、54d、61a、94s、95i、96g、97g、98p或100e位中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基發(fā)生突變。例如，本發(fā)明的tcr可具有α鏈可變域氨基酸殘基94s、94t、94r、97m、98m、98q、98g、98s、98a或102d中的一個(gè)或多個(gè)(利用seqidno：2所示編號(hào))和/或β鏈可變域氨基酸殘基27i、28f、29q、30k、31k、50w、51a、51g、52q、52y、52t、53g、53f、54n、54h、61t、94l、95y、95h、95w、95f、95s、95v、96c、97e、97a、98g、100q或100p中的一個(gè)或多個(gè)(利用seqidno：3所示編號(hào))。本發(fā)明的特異性tcr包括含有α鏈可變域氨基酸序列seqidno：7、8和9之一和/或β鏈可變域氨基酸序列seqidno：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一的那些。因此，含有野生型α鏈的可變域序列(seqidno2的s1-a109)的tcr可與具有seqidno：10-35之一的β鏈結(jié)合?；蛘?，具有seqidno：7-9之一的α鏈可與野生型β鏈的可變域序列(seqidno3的d1-t112)結(jié)合?；蛘呔哂衧eqidno：7-9之一的α鏈可與具有seqidno：10-35之一的β鏈結(jié)合。就靶向應(yīng)用，主要是它們的高親和力和緩慢解離速率(即，長(zhǎng)半衰期)而言，目前優(yōu)選的可溶性tcr是包含α鏈可變域氨基酸序列seqidno：8(x＝s或a或g)和β鏈可變域氨基酸序列seqidno：27的那些。此類優(yōu)選的tcr宜是αβ異源二聚體形式，即，包含trac和trbc結(jié)構(gòu)域。如本文所述，可在一個(gè)c-末端或兩個(gè)c-末端截短此類trac和trbc結(jié)構(gòu)域。例如，可通過刪除最多15，或最多10或最多8或更少的氨基酸來截短參比tcrα鏈的恒定域的c-末端。上述tcr的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。術(shù)語“表型沉默變體”所指tcr的序列與本發(fā)明tcr相同，除了在恒定和/或可變域中摻入改變，但所述改變不會(huì)改變與肽-hla復(fù)合物相互作用的親和力和/或解離速率。此類變體的一個(gè)例子是本發(fā)明tcr，其中采用seqidno：2的編號(hào)，該tcrα恒定域含有取代130絲氨酸(s)氨基酸殘基的苯丙氨酸(f)氨基酸殘基。如上所述，本發(fā)明的αβ異源二聚tcr可在它們的恒定域之間引入二硫鍵。該類型的優(yōu)選tcr包括具有trac恒定域序列和trbc1或trbc2恒定域序列的那些，除了trac的thr48和trbc1或trbc2的ser57被半胱氨酸殘基替代，所述半胱氨酸在tcr的trac恒定域序列和trbc1或trbc2恒定域序列之間形成二硫鍵。含或不含上文所述的引入的鏈間鍵，本發(fā)明的αβ異源二聚tcr均可具有trac恒定域序列和trbc1或trbc2恒定域序列，tcr的trac恒定域序列和trbc1或trbc2恒定域序列可通過trac的外顯子2的cys4和trbc1或trbc2的外顯子2的cys2之間的天然二硫鍵相連。如本文所述，本發(fā)明的可溶性tcr可與可檢測(cè)標(biāo)記物(為診斷目的，其中所述tcr用于檢測(cè)呈遞ylepgpvtahla-a2復(fù)合物的細(xì)胞的存在)；治療劑；pk修飾部分(例如，通過peg化)；或以上的組合結(jié)合(共價(jià)或其它方式)。用于診斷目的的可檢測(cè)標(biāo)記物包括但不限于：熒光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、mri或ct造影劑、或產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物的酶。可與本發(fā)明tcr結(jié)合的治療劑包括但不限于：放射性化合物、前藥激活酶(例如，dt-心肌黃酶(dtd)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(bphl))、化療劑(例如，順鉑)、毒素(例如，假單胞菌外毒素，如pe38、卡西霉素(calcimycin)或白喉毒素)、免疫調(diào)節(jié)抗體片段(例如抗-cd3或抗-cd16)、或免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(例如，il-2)。為確保在所需位置施加毒性效應(yīng)，毒素可以在連接于tcr的脂質(zhì)體內(nèi)，從而使該化合物緩慢釋放，或者通過不穩(wěn)定的接頭將毒素偶聯(lián)于tcr。如此可防止在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)期間的破壞作用，確保tcr與相關(guān)抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合后毒素具有最大作用。其它合適的治療劑包括：●小分子細(xì)胞毒性劑，即，能殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞、分子量低于700道爾頓的化合物。此類化合物還能含有能具有細(xì)胞毒性效應(yīng)的毒性金屬。此外，應(yīng)該了解，這些小分子細(xì)胞毒性劑還包含前藥，即，在生理?xiàng)l件下分解或轉(zhuǎn)化以釋放細(xì)胞毒性劑的化合物。此類試劑的例子包括順鉑、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他賽、依托泊甙、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、美法侖、米托蒽醌、卟吩姆鈉(sorfimersodium)光敏素ii、替莫唑胺、拓?fù)涮婵?、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他?auristatin)e、長(zhǎng)春新堿和阿霉素；●肽細(xì)胞毒素，即，能殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)或其片段。例如，蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌細(xì)菌內(nèi)毒素a、dna酶和rna酶；●放射性核素，即，元素的不穩(wěn)定同位素，其在衰減的同時(shí)發(fā)出一種或多種的α或β粒子，或γ射線。例如，碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210和213、錒225和砹213；可利用螯合劑促進(jìn)這些放射性核素與高親和力tcr或它們的多聚體的結(jié)合；●免疫刺激劑，即，刺激免疫應(yīng)答的免疫效應(yīng)分子。例如，細(xì)胞因子，如il-2和ifn-γ；●超抗原及其突變體；●tcr-hla融合體，其中所述hla決定免疫原性抗原；●趨化因子，例如il-8、血小板因子4、黑色素瘤生長(zhǎng)刺激蛋白，等；●抗體或其片段，包括抗-t細(xì)胞或nk-細(xì)胞決定抗體(例如，抗-cd3或抗-cd28或抗-cd16)；●補(bǔ)體激活物；●異種蛋白結(jié)構(gòu)域、同種異體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、病毒/細(xì)菌蛋白結(jié)構(gòu)域、病毒/細(xì)菌肽。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是與抗-cd3抗體或所述抗-cd3抗體的功能片段或變體結(jié)合的本發(fā)明tcr。適用于本文所述組合物和方法的抗體片段和變體/類似物包括但不限于：小抗體(minibody)、fab片段、f(ab’)2片段、dsfv和scfv片段、或其它抗體支架蛋白，例如nanobodiestm(由比利時(shí)阿比林公司(ablynx)投入市場(chǎng)的這些構(gòu)建物包含源自駝科動(dòng)物(例如駱駝或美洲駝)抗體的合成單一免疫球蛋白可變重鏈結(jié)構(gòu)域)、結(jié)構(gòu)域抗體(由比利時(shí)多曼提斯公司(domantis)投入市場(chǎng)，包含親和力成熟的單一免疫球蛋白可變重鏈結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白可變輕鏈結(jié)構(gòu)域)、unibodies(由金邁公司(genmab)投入市場(chǎng)，unibodies是修飾的全人igg4抗體，其中刪除了該抗體的絞鏈區(qū))、三功能抗體(具有兩種不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體)、affibodies(由昂飛公司(affibody)投入市場(chǎng)，affibodies依據(jù)58-氨基酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其為一個(gè)三螺旋束結(jié)構(gòu)域，源自葡萄球菌a蛋白的igg-結(jié)合域之一)、抗脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(從人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白合成的抗體模擬物，其還能構(gòu)建成雙靶向蛋白質(zhì)，即，所謂的雙脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(duocalins))或darpins(設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白)(其是依據(jù)重復(fù)蛋白，例如錨蛋白或富含亮氨酸重復(fù)蛋白的抗體模擬物的另一例子，它們是普遍存在的結(jié)合分子)。更具體的本發(fā)明tcr-抗cd3融合體包括選自下組的tcrα鏈氨基酸序列：(i)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是s；(ii)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是a；(iii)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是g；(iv)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是s，依據(jù)seqidno：45的編號(hào)，該α鏈的c-末端從f196到s203截短8個(gè)氨基酸(包括端點(diǎn))；(v)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是a，依據(jù)seqidno：45的編號(hào)，該α鏈的c-末端從f196到s203截短8個(gè)氨基酸(包括端點(diǎn))；(vi)tcrα鏈序列seqidno：45，其中氨基酸1-109被序列seqidno：8替代，其中1位的氨基酸是g，依據(jù)seqidno：45的編號(hào)，該α鏈的c-末端從f196到s203截短8個(gè)氨基酸(包括端點(diǎn))；和選自下組的tcrβ鏈-抗-cd3氨基酸序列：(vii)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是d和i；(viii)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是a和i；(ix)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是a和q；(x)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是d和i，108-131位的氨基酸被rtsgpgdggkggpgkgpggegtkgtgpgg(seqidno：44)替代，254-258位的氨基酸被ggegggsegggs(seqidno：47)替代；(xi)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是d和i，257位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xii)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是d和i，256位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xiii)tcrβ鏈-抗-cd3序列seqidno：36，其中1和2位的氨基酸分別是d和i，255位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xiv)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和q，257位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xv)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和q，256位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xvi)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和q，255位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xvii)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和i，257位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xviii)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和i，256位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；(xix)具有序列seqidno：36的tcrβ鏈-抗-cd3，其中1和2位的氨基酸分別是a和i，255位的氨基酸是s，258位的氨基酸是g；此類tcr-抗cd3融合體的例子是如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(vii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(x)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(ix)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(v)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(viii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(vii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xi)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xiii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xiv)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xv)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xvi)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(v)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xvii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(v)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xviii)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(v)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xix)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xi)；如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xii)；和如權(quán)利要求18所述的tcr，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-cd3氨基酸序列是(xiii)。由于本發(fā)明的αβ異源二聚tcr可用于過繼性治療，本發(fā)明還包括呈遞本發(fā)明tcr的分離細(xì)胞，特別是t-細(xì)胞。有許多方法適合于用編碼本發(fā)明的高親和力tcr的dna或rna轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。(參見，例如robbins等.，(2008)j.immunol.180：6116-6131))。表達(dá)本發(fā)明的高親和力tcr的t細(xì)胞適用于gp100+hla-a2+癌癥的基于過繼性治療的治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知進(jìn)行過繼性治療的許多合適方法。(參見，例如rosenberg等.，(2008)natrevcancer8(4)：299-308)。為某些目的，本發(fā)明的tcr可多聚成包含數(shù)個(gè)tcr的復(fù)合物以形成多價(jià)tcr復(fù)合物。有許多人蛋白含有可用于產(chǎn)生多價(jià)tcr復(fù)合物的多聚結(jié)構(gòu)域。例如，利用p53的四聚結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生scfv抗體片段的四聚體，與單體scfc片段相比，其顯示血清持久性增加和解離速率顯著降低。(willuda等.(2001)j.biol.chem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白也具有可能用于此類應(yīng)用的四聚結(jié)構(gòu)域。與非多聚野生型或本發(fā)明的t細(xì)胞受體異源二聚體相比，本發(fā)明的多價(jià)tcr復(fù)合物對(duì)ylepgpvta-hla-a2復(fù)合物的結(jié)合能力可增強(qiáng)。因此，本發(fā)明tcr的多價(jià)復(fù)合物也屬于本發(fā)明。本發(fā)明的此類多價(jià)tcr復(fù)合物尤其可用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞，也可用作產(chǎn)生具有此類應(yīng)用的其它多價(jià)tcr復(fù)合物的中間體。由轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞表達(dá)時(shí)，打算用于過繼性治療的本發(fā)明tcr被糖基化。本領(lǐng)域熟知，可通過轉(zhuǎn)染基因的突變來修飾轉(zhuǎn)染tcr的糖基化模式。為給予患者，本發(fā)明的tcr和本發(fā)明tcr轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞可與藥學(xué)上可接受的載體一起在藥物組合物中提供。本發(fā)明的治療性或成像tcr、多價(jià)tcr復(fù)合物和細(xì)胞通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，所述組合物通常包含藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。其可采用單位劑型提供，通常在密封的容器中提供，可作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒通常(但非必需)包括使用說明書。其可包括多個(gè)所述單位劑型?？筛倪M(jìn)藥物組合物以便通過任何合適的途徑給予，優(yōu)選胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)，或優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑?？赏ㄟ^藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備此類組合物，例如在無菌條件下將活性成分與一種或多種載體或賦形劑混合。根據(jù)所治療的疾病或病癥、所治療個(gè)體的年齡和情況等，本發(fā)明物質(zhì)的劑量可在很寬范圍內(nèi)變化，最終由醫(yī)師決定所用的合適劑量。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，其中參考了以下附圖。圖1a和2a分別顯示具有trav17/traj29/trac基因使用的天然gp100tcrα鏈的胞外氨基酸序列，除了k113取代n113(即，trac的n4)，和具有trbv19*01/trbd1/trbj2-7*01/trbc2基因使用的天然gp100tcrβ鏈的胞外氨基酸序列(分別是seqidno：2和3)。圖1b和2b分別顯示編碼可溶性野生型gp100tcrα和β鏈(也稱為參比gp100tcrα和β鏈)的dna序列。這些序列包含額外的半胱氨酸殘基以形成非天然二硫鍵。陰影部分標(biāo)出了編碼額外的半胱氨酸殘基的突變密碼子。下劃線標(biāo)出ndei和hindiii限制性酶識(shí)別序列。圖1c和2c分別顯示分別從圖1b和2b所示dna序列產(chǎn)生的可溶性野生型gp100tcr或參比gptcrα和β鏈胞外氨基酸序列(分別是seqidno：45和46)，但不含為在細(xì)菌中有效表達(dá)而插入的引入前導(dǎo)甲硫氨酸。引入的半胱氨酸以黑體字和下劃線顯示。圖3a-c顯示高親和力gp100tcr變體的α鏈可變域氨基酸序列。突變的殘基以黑體字和下劃線顯示。圖4a-z顯示高親和力gp100tcr變體的β鏈可變域氨基酸序列。突變的殘基以黑體字和下劃線顯示。圖5a顯示借助高親和力gp100tcr作t2細(xì)胞體外染色的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，該細(xì)胞用ylepgpvtv(seqidno：6)變體gp100肽脈沖。圖5b顯示借助高親和力gp100tcr作t2細(xì)胞染色的顯微圖像，該細(xì)胞用ylepgpvtv(seqidno：6)變體gp100肽脈沖。圖6顯示通過接頭ggggsseqidno：48(下劃線顯示)在gp100tcrβ鏈的n-末端融合的抗-cd3scfv抗體片段(黑體字)的氨基酸序列。所述gp100tcrβ鏈含有可變區(qū)seqidno：27。圖7是顯示在非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，抗-cd3scfv-gp100高親和力tcr使得t細(xì)胞重定向以殺傷黑色素瘤細(xì)胞系mel526的應(yīng)答曲線。圖8a顯示用于轉(zhuǎn)導(dǎo)t-細(xì)胞的野生型gp100-特異性tcr基因(含豬捷申病毒(teschovirus)-12a序列的野生型(wt)α鏈-2a-wtβ鏈構(gòu)建物，黑體字和下劃線顯示)的dna序列。圖8b顯示從圖8a所示dna序列產(chǎn)生的用于t-細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的野生型gp100-特異性tcr的氨基酸序列。豬捷申病毒-12a序列以黑體字和下劃線顯示。圖9a和9b顯示在elispot試驗(yàn)中，gp100tcr-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t-細(xì)胞對(duì)一系列靶細(xì)胞起反應(yīng)而釋放ifn-γ。這些附圖顯示與用天然gp100tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞相比，用高親和力gp100tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的特異性激活增加。圖10顯示tcr-pmhc親和力增加的不同gp100tcr-抗-cd3scfv融合體激活的cd8+t細(xì)胞釋放ifn-γ。圖11顯示不同gp100tcr-抗-cd3scfv融合體激活的cd8+t細(xì)胞釋放ifn-γ。圖12顯示體內(nèi)模型中平均腫瘤體積的進(jìn)展情況，該模型利用含人黑色素瘤異種移植物的免疫缺陷小鼠，并檢驗(yàn)gp100高親和力tcr-抗-cd3scfv融合蛋白的抗腫瘤效力。實(shí)施例1將參比gp100tcrα和β鏈可變區(qū)序列克隆入基于pgmt7的表達(dá)質(zhì)粒從gp100t細(xì)胞克隆分離的總edna中pcr擴(kuò)增參比gp100tcr可變?chǔ)梁蛅cr可變?chǔ)陆Y(jié)構(gòu)域。在α鏈的情況中，利用α鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸a1(ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatccseqidno：39)和α鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸a2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacgseqidno：40)擴(kuò)增α鏈可變區(qū)，前者編碼限制性位點(diǎn)ndei，為在細(xì)菌中有效啟動(dòng)表達(dá)而引入的甲硫氨酸，后者編碼限制性位點(diǎn)sali。在β鏈的情況中，利用β鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸b1(tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaaseqidno：41)和β鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸b2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggcseqidno：42)擴(kuò)增β鏈可變區(qū)，前者編碼限制性位點(diǎn)ndei，為在細(xì)菌中有效啟動(dòng)表達(dá)而引入的甲硫氨酸，后者編碼限制性位點(diǎn)agei。通過《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(molecularcloningalaboratorymanual)(第三版，sambrook和russell)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將α和β可變區(qū)克隆入含有cα或cβ的基于pgmt7的表達(dá)質(zhì)粒。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)的3730xldna分析儀測(cè)序質(zhì)粒。將ndei和sali切割的編碼tcrα鏈的dna序列連接入用ndei和xhoi切割的pgmt7+cα載體。將ndei和agei切割的編碼tcrβ鏈的dna序列連接入也用ndei和agei切割的不同pgmt7+cβ載體。連接將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌(escherichiacoli)菌株xl1-藍(lán)色細(xì)胞，接種在含有100μg/ml氨芐西林的lb/瓊脂板上。37℃溫育過夜后，挑取單個(gè)菌落，37℃，在含有100μg/ml氨芐西林的10mllb中振蕩生長(zhǎng)過夜。利用恰根公司的迷你制備試劑盒(miniprepkit，qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，利用百靈技術(shù)公司(larktechnologies)的自動(dòng)dna測(cè)序儀測(cè)序插入物。圖1c和2c分別顯示分別從圖1b和2b所示dna序列產(chǎn)生的可溶性二硫鍵-連接的參比gp100tcrα和β鏈胞外氨基酸序列，但不含為在細(xì)菌中有效表達(dá)而插入的引入前導(dǎo)甲硫氨酸(分別為seqidno：45和46)。應(yīng)注意，半胱氨酸被取代入α和β鏈的恒定區(qū)以在重折疊時(shí)提供人工鏈間二硫鍵，從而形成異源二聚tcr。引入的半胱氨酸以陰影部分顯示。圖1b和2b所示dna序列中的限制性酶識(shí)別序列以下劃線顯示。實(shí)施例2可溶性參比gp100tcr的表達(dá)、重折疊和純化將實(shí)施例1中分別制備的含有tcrα-鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株rosetta(de3)plyss，37℃下將單氨芐西林耐受性菌落在typ(氨芐西林100μg/ml)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600約為0.6-0.8，然后用0.5mmiptg誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后3小時(shí)用beckmanj-6b以4000rpm離心30分鐘收獲細(xì)胞。在有mgcl2和dna酶i存在下，用25mlbugbuster(諾瓦金公司(novagen))裂解細(xì)胞沉淀物。用beckmanj2-21離心機(jī)以13000rpm離心30分鐘以回收包涵體沉淀物。然后進(jìn)行三次洗滌劑洗滌以除去細(xì)胞碎片和膜組分。每次先將包涵體沉淀物在曲通(triton)緩沖液(50mmtris-hciph8.0，0.5％曲通-x100，200mmnaci，10mmnaedta)中勻漿再以4,000rpm離心15分鐘使之沉淀。然后利用以下緩沖液作類似的洗滌以除去洗滌劑和鹽：50mmtris-hcl，1mmnaedta，ph8.0。最終，將包涵體分成30mg等份試樣，-70℃冷凍。用6m胍-hcl溶解包涵體蛋白產(chǎn)物對(duì)其定量，利用日立(hitachi)u-2001分光光度計(jì)檢測(cè)od。然后利用消光系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。從冷凍儲(chǔ)備物中解凍約30mgtcrβ鏈和60mgtcrα鏈溶解包涵體，用15ml胍溶液(6m胍-鹽酸，50mmtrishclph8.1，100mmnacl，10mmedta，10mmdtt)稀釋以確保完全的鏈變性。然后將含有完全還原和變性的tcr鏈的胍溶液注射入以下的1升重折疊緩沖液：100mmtrisph8.1，400mml-精氨酸，2mmedta，5m脲。加入氧化還原對(duì)(鹽酸半胱胺和二鹽酸胱胺)至終濃度分別為6.6mm和3.7mm，約5分鐘后加入變性的tcr鏈。溶液靜置約1小時(shí)。5℃±3℃下，用透析管狀纖維素膜(西格瑪-阿爾德里奇公司(sigma-aldrich)；產(chǎn)品編號(hào)d9402)和10lh2o對(duì)重折疊的tcr透析18-20小時(shí)。然后，將透析緩沖液更換為新鮮的10mmtrisph8.1(10l)兩次，在5℃±3℃下繼續(xù)透析約8小時(shí)。將透析的重折疊物加載于poros50hq陰離子交換柱，利用akta純化儀(ge保健公司(gehealthcare))用10mmtrisph8.1配制的0-500mmnacl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)6個(gè)柱體積以上，從而將可溶性tcr與錯(cuò)誤折疊的、降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。將蛋白酶抑制劑的混合物(卡爾生物化學(xué)公司(calbiochem))加入峰組分。將諸組分保存于4℃，通過考馬斯-染色的sds-page分析，然后合并、濃縮。最后，利用在pbs緩沖液(西格瑪公司(sigma))中預(yù)平衡的ge保健公司的superdex75hr凝膠過濾柱純化并表征可溶性tcr。合并、濃縮在相對(duì)分子量約為50kda洗脫的峰，然后通過biacore表面等離振子共振分析進(jìn)行表征。實(shí)施例3結(jié)合表征biacore分析可利用表面等離振子共振生物傳感器(biacore3000tm)分析可溶性tcr與其肽-mhc配體的結(jié)合。產(chǎn)生能固定于鏈霉親和素包被結(jié)合表面(傳感器芯片)的可溶性生物素化肽-hla(“phla”)復(fù)合物有助于該分析。所述傳感器芯片包含能同時(shí)檢測(cè)t細(xì)胞受體與4個(gè)不同phla復(fù)合物結(jié)合的4個(gè)獨(dú)立流動(dòng)小室。手工注射phla復(fù)合物易于操控固定的i類分子的精確水平。體外重折疊含有亞單位蛋白組分和合成肽的細(xì)菌表達(dá)包涵體中生物素化i類hla-a*02分子，然后純化并在體外進(jìn)行酶促生物素化(o’callaghan等(1999)anal.biochem.266：9-15)。表達(dá)的hla-a*02-重鏈具有c-末端生物素化標(biāo)簽，其在合適的構(gòu)建物替代了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。獲得的包涵體表達(dá)水平約75mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。還在大腸桿菌中從合適構(gòu)建物表達(dá)了作為包涵體的hla輕鏈或β2-微球蛋白(β2m)，其水平約為500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。裂解大腸桿菌細(xì)胞，處理包涵體至約80％純度。將合成肽(gp100ylepgpvta)溶解于dmso至4mg/ml的終濃度。用6m鹽酸胍、50mmtrisph8.1、100mmnacl、10mmdtt、10mmedta使b2m和重鏈的包涵體各自變性。制備含有0.4ml-精氨酸、100mmtrisph8.1、3.7mm二鹽酸胱胺、6.6mm鹽酸半胱胺的重折疊緩沖液并冷卻至＜5℃。優(yōu)選先將肽加入重折疊緩沖液，然后加入變性的b2m，再加入變性的重鏈。將gp100ylepgpvta肽以4毫克/升(終濃度)加入重折疊緩沖液。然后依次加入30毫克/升的b2m和30毫克/升的重鏈(終濃度)。使重折疊在4℃進(jìn)行至少1小時(shí)至完成。用10體積的10mmtrisph8.1作透析來更換緩沖液。必需更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強(qiáng)度。然后經(jīng)1.5μm乙酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，加載到poros50hq陰離子交換柱上(8ml床體積)。利用akta純化儀(ge保健公司的)，用10mmtrisph8.1配制的0-500mmnacl線性梯度液洗脫蛋白。hla-a*02-肽復(fù)合物約在250mmnacl處洗脫，收集諸峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學(xué)公司)，各組分置于冰上冷卻。用相同緩沖液平衡的ge保健公司的快速脫鹽柱將生物素化標(biāo)記的phla分子的緩沖液更換為10mmtrisph8.1，5mmnacl。洗脫后立即將含有蛋白質(zhì)的組分置于冰上冷卻，加入蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學(xué)公司)。然后加入生物素化試劑：1mm生物素、5mmatp(緩沖至ph8)、7.5mmmgcl2和5μg/mlbira酶(按照o’callaghan等，(1999)，anal.biochem.266：9-15純化)。然后室溫培育混合物過夜。采用凝膠過濾層析純化生物素化的phla-a*02分子。利用akta純化儀(ge保健公司)，用過濾的pbs預(yù)平衡ge保健公司superdex75hr10/30柱，加載1ml生物素化反應(yīng)混合物，用pbs以0.5毫升/分鐘過柱。生物素化phla-a*02分子在約15ml時(shí)作為單峰洗脫。合并含有蛋白質(zhì)的組分，置在冰上冷卻，加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(pb公司(perbio))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化phla-a*02分子的等份試樣冷凍保存在-20℃。此類固定的復(fù)合物能結(jié)合t-細(xì)胞受體和輔助受體cd8αα，可將二者注入可溶相。如果采用可溶相或固定相的tcr，觀察到可溶性tcr的phla結(jié)合特性在質(zhì)量和數(shù)量上相似。這是對(duì)可溶性物質(zhì)的部分活性的重要控制，也提示生物素化的phla復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物的生物活性相同。利用biacore3000tm表面等離振子共振(spr)生物傳感器檢測(cè)小型流動(dòng)小室內(nèi)傳感器表面附近以響應(yīng)單位(ru)表示的折射率變化，該原理可用于檢測(cè)受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在25℃下進(jìn)行biacore實(shí)驗(yàn)，利用pbs緩沖液(西格瑪公司，ph7.1-7.5)作為運(yùn)行緩沖液和制備蛋白質(zhì)樣品的稀釋液。通過標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)方法將鏈霉親和素固定于流動(dòng)小室。通過生物素標(biāo)簽固定phla復(fù)合物。然后使可溶性tcr以恒定流速通過不同流動(dòng)小室的表面，檢測(cè)該情況下的spr響應(yīng)以進(jìn)行試驗(yàn)。平衡結(jié)合常數(shù)采用以上biacore分析方法測(cè)定平衡結(jié)合常數(shù)。制備參比gp100tcr的二硫鍵連接可溶性異源二聚體形式的連續(xù)稀釋液，以5微升/分鐘的恒定流速注射到兩個(gè)不同的流動(dòng)小室上；一個(gè)包被有約300ru的特異性ylepgpvtahla-a2復(fù)合物(或變體肽ylepgpvtvhla-a2復(fù)合物)，第二個(gè)包被有約300ru非特異性hla-a2-wt1野生型肽(rmfpnapyl)復(fù)合物。利用對(duì)照細(xì)胞的檢測(cè)值標(biāo)準(zhǔn)化各濃度的響應(yīng)。繪制標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)響應(yīng)與tcr樣品濃度的圖，根據(jù)非線性曲線擬合模型擬合以計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)，kd。(price和dwek，《生物化學(xué)家的物理化學(xué)原理和問題(principlesandproblemsinphysicalchemistryforbiochemists)》(第二版)，1979，克拉倫登出版社(clarendonpress)，牛津)。參比gp100tcr的二硫鍵連接可溶性形式(實(shí)施例2)顯示kd為約19μm。根據(jù)同一biacore數(shù)據(jù)，t1/2約為0.8s。還利用hla-a*0201加載的gp100ylepgpvta(seqidno：1)肽的變體肽(ylepgpvtv-seqidno：6)重復(fù)該親和力測(cè)定。可溶性二硫鍵連接的參比gp100tcr對(duì)ylepgpvtv(seqidno：6)-hla*0201復(fù)合物的親和力(kd)(約19μm)與gp100ylepgpvta(seqidno：1)-hla*0201復(fù)合物所得的相似。動(dòng)力學(xué)參數(shù)還采用以上biacore分析方法測(cè)定平衡結(jié)合常數(shù)和解離速率。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)解離速率常數(shù)koff和結(jié)合速率常數(shù)kon來確定高親和力tcr的kd(參見以下實(shí)施例4)。平衡常數(shù)kd計(jì)算為koff/kon。將tcr注射流過兩個(gè)不同小室，一個(gè)用約300ru的特異性ylepgpvtahla-a*02復(fù)合物(或指定時(shí)的ylepgpvtvhla-a*02復(fù)合物)包被，第二個(gè)用約300ru的非特異性hla-a2-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)置為50微升/分鐘。通常注射入250μl濃度約等于kd的10倍的tcr。然后使緩沖液流過直到響應(yīng)回復(fù)到基線或時(shí)間過去2小時(shí)以上。用biaevaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式從而能計(jì)算半衰期。實(shí)施例4產(chǎn)生天然gp100tcr的高親和力變體噬菌體展示是產(chǎn)生gp100tcr變體的文庫以鑒定高親和力突變體的一種手段。將li等((2005)naturebiotech23(3)：349-354)描述的tcr噬菌體展示和篩選方法應(yīng)用于實(shí)施例2的參比gp100tcr。通過誘變靶向所有6個(gè)gp100tcrcdr區(qū)域(參比tcr中與天然tcr中相同)，分別淘選和篩選各cdr文庫。鑒定了親和力和/或結(jié)合半衰期至少是參比gp100tcr兩倍的tcr(因此，隱含表示是天然tcr的至少兩倍)，采用seqidno：2中所示編號(hào)，其具有一個(gè)或多個(gè)α鏈可變域氨基酸殘基94s、94t、94r、97m、98m、98q、98g、98s、98a或102d和/或采用seqidno：3中所示編號(hào)，其具有一個(gè)或多個(gè)β鏈可變域氨基酸殘基27i、28f、29q、30k、31k、50w、51a、51g、52q、52y、52t、53g、53f、54n、54h、61t、94l、95y、95h、95w、95f、95s、95v、96c、97e、97a、98g、100q或100p。高親和力tcr的α鏈(seqidno：7、8和9)和β鏈(seqidno：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35)的可變區(qū)的氨基酸序列的具體例子分別示于圖3a-c和4a-z。這些α鏈僅在cdr3中突變，β鏈在cdr1、cdr2和cdr3的一個(gè)或多個(gè)中突變。采用以上實(shí)施例2的方法重折疊tcr異源二聚體(包括在恒定區(qū)中引入的半胱氨酸以提供人工鏈間二硫鍵)。以此方式制備的tcr由以下部分構(gòu)成：(a)參比tcrβ鏈以及經(jīng)突變包含可變域seqidno：7、8和9的α鏈；(b)參比tcrα鏈以及經(jīng)突變包含β鏈可變域seqidno：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35的β鏈；和(c)包含突變型可變域的β和α鏈的各種組合物。采用上述biacore方法分析高親和力可溶性二硫鍵連接的gp100tcr和天然肽ylepgpvtahla-a*02復(fù)合物之間的相互作用，結(jié)合數(shù)據(jù)示于表1。表1a顯示當(dāng)利用變體肽ylepgpvtvhla-a*02復(fù)合物檢驗(yàn)時(shí)，這些高親和力tcr的結(jié)合數(shù)據(jù)。采用上述biacore方法分析高親和力可溶性二硫鍵連接的gp100tcr和ylepgpvtvhla-a*02復(fù)合物之間的相互作用，結(jié)合數(shù)據(jù)示于表2。表1表1a：用gp100變體肽-hla-a2復(fù)合物檢驗(yàn)的表1的gp100tcr的結(jié)合數(shù)據(jù)上表1和1a顯示用天然gp100ylepgpvta肽hla-a*02復(fù)合物或變體gp100ylepgpvtv肽hla-a*02復(fù)合物檢驗(yàn)的各高親和力tcr獲得實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)的、非常相似的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。觀察到這一情況后，僅用變體ylepgpvtv肽hla-a*02復(fù)合物檢驗(yàn)了一些高親和力tcr(參見表2)。預(yù)計(jì)這些tcr對(duì)天然肽hla-a*02復(fù)合物表現(xiàn)出非常相似的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表2注意：在上表中，含可變域seqidno：8的tcr具有可變氨基酸x，作為s。然而，含可變氨基酸x，作為a的變體具有基本上相似的t1/2和kd。實(shí)施例5利用高親和力gp100tcr的體外細(xì)胞染色進(jìn)行以下試驗(yàn)以證明具有vαseqidno：8(x＝s)和vβseqidno：27的實(shí)施例4的可溶性高親和力gp100tcr能染色用變體ylepgpvtv(seqidno：6)肽脈沖的t2細(xì)胞。為本實(shí)施例的目的，將生物素標(biāo)簽融合于具有vβseqidno：27的gp100β鏈的恒定域的c-末端，將整個(gè)基因(vβ+cβ+生物素標(biāo)簽)插入基于pgmt7的表達(dá)質(zhì)粒。采用實(shí)施例2所述方法表達(dá)tcrβ鏈-生物素標(biāo)簽。采用實(shí)施例2所述方法重折疊αβtcr-生物素標(biāo)簽。采用實(shí)施例2所述的方法，在第一陰離子交換步驟純化重折疊的tcr。然后采用實(shí)施例3所述方法生物素化該tcr。最終，如實(shí)施例2所述，利用ge保健公司superdex75hr凝膠過濾柱純化生物素化的tcr。試劑r10試驗(yàn)培養(yǎng)基：10％fcs(熱滅活的，吉布可公司(gibco)，目錄號(hào)10108-165)，88％rpmi1640(吉布可公司，目錄號(hào)42401-018)，1％谷氨酰胺(吉布可公司，目錄號(hào)25030-024)和1％青霉素/鏈霉素(吉布可公司，目錄號(hào)15070-063)。facs緩沖液：pbs/0.5％bsa(普洛邁格公司(promega)，目錄號(hào)w3841)，2mmedta。顯微術(shù)緩沖液：pbs/0.5％bsa(普洛邁格公司，目錄號(hào)w3841)，400μmcapo4，400μmmgpo4。流式細(xì)胞術(shù)方法37℃/5％co2下，在r10培養(yǎng)基中用一定濃度范圍(10-7到10-9m)的變體gp100肽(ylepgpvtv(seqidno：6))或無關(guān)肽(elagigiltv(seqidno：43))脈沖t2類淋巴母細(xì)胞至少90分鐘。脈沖后，用facs緩沖液洗滌細(xì)胞3次，室溫下將1x106個(gè)細(xì)胞與高親和力生物素化gp100tcr(5μg/ml)溫育30分鐘，用facs緩沖液洗滌兩次，室溫下與鏈霉親和素-pe(5μg/ml：bd生物科學(xué)公司(bdbiosciences)，目錄號(hào)349023)溫育20分鐘。用facs緩沖液洗滌后，利用beckmancoulterfc500流式細(xì)胞儀，通過流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定結(jié)合的高親和力gp100tcr。包括利用肽-脈沖的t2細(xì)胞的對(duì)照，其中省去了gp100tcr，或加入無關(guān)tcr。結(jié)果成功證明可溶性高親和力gp100tcr可染色10-9m到10-7mylepgpvtv(seqidno：6)變體gp100肽脈沖的t2細(xì)胞。顯示肽-脈沖t2細(xì)胞的檢驗(yàn)與對(duì)照染色的流式細(xì)胞術(shù)直方圖可參見圖5a。(填充曲線是“無tcr”對(duì)照)顯微術(shù)方法利用高親和力生物素化的gp100tcr，通過熒光顯微術(shù)目測(cè)變體肽ylepgpvtv(seqidno：6)-脈沖t2細(xì)胞的染色。如上文“流式細(xì)胞術(shù)”所述進(jìn)行t2細(xì)胞的脈沖和染色。染色和洗滌后，用r10(不含酚紅)再洗滌3x104個(gè)細(xì)胞一次，最后重懸在400μlr10中(不含酚紅)，轉(zhuǎn)移至分室載玻片(紐克萊布泰克(nunc，lab-tek)，目錄號(hào)155411)，先靜置再作3-維熒光顯微術(shù)。利用裝有63x油鏡(蔡氏公司(zeiss))的axiovert200m(蔡氏公司)顯微鏡進(jìn)行熒光顯微術(shù)。利用含300w氙弧燈(蘇氏公司(sutter))的lambdals光源照明，通過在光路中放置0.3和0.6中性濾光片將光強(qiáng)度降至最佳水平。利用tritc/dii濾光片組(克羅瑪公司(chroma))分開激發(fā)和發(fā)射光譜。通過z-棧獲取(21平面，1μm間隔)得到細(xì)胞的三維圖像。利用通用成像公司(universalimaging)的metamorph軟件，如irvine等.，(2002)nature419(6909)：845-9和purbhoo等.，natureimmunology5(5)：524-30所述進(jìn)行圖像獲取和分析。結(jié)果圖5b顯示高親和力生物素化gp100tcr成功結(jié)合ylepgpvtv(seqidno：6)肽脈沖的t2細(xì)胞。實(shí)施例6可溶性抗-cd3scfv-gp100tcr融合體的表達(dá)、重折疊和純化seqidno：36(圖6)是通過接頭，即ggggsseqidno：48(下劃線所示)在gp100tcrβ鏈的n-末端融合的抗-cd3scfv抗體片段(黑體字)的氨基酸序列，但不含為有效啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成而引入的前導(dǎo)甲硫氨酸。gp100tcrβ鏈含有可變域seqidno：27。本實(shí)施例中，tcr融合體的gp100tcrα鏈含有可變域seqidno：8(圖3b)，其中x＝s。如下所示制備以上構(gòu)建物：連接將編碼(a)tcrvα鏈和(b)融合序列seqidno：36(其中1和2位的氨基酸分別是d和i)的合成基因分別連接入含有t7啟動(dòng)子以便在大腸桿菌菌株rosetta(de3)plyss中高水平表達(dá)的pgmt7+cα(具有引入的半胱氨酸，從而能形成二硫鍵)載體和基于pgmt7的表達(dá)質(zhì)粒(pan等.，biotechniques(2000)29(6)：1234-8)。應(yīng)注意，將前導(dǎo)甲硫氨酸引入tcrα鏈可變域的n-末端和融合序列seqidno：36的n-末端以便有效啟動(dòng)細(xì)菌中的蛋白質(zhì)合成。表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株rosetta(de3)plyss中，37℃，在typ(氨芐西林100μg/ml)培養(yǎng)基中培養(yǎng)單氨芐西林耐受性菌落至od600為約0.6-0.8，然后用0.5mmiptg誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后3小時(shí)，用beckmanj-6b以4000rpm離心30分鐘收獲細(xì)胞。在有mgcl2和dna酶存在下，用25mlbugbuster(諾瓦金公司)裂解細(xì)胞沉淀物。以4000rpm離心30分鐘以回收包涵體沉淀物。然后進(jìn)行三次洗滌劑洗滌以除去細(xì)胞碎片和膜組分。每次先將包涵體沉淀物在曲通緩沖液(50mmtris-hciph8.0，0.5％曲通-x100，200mmnaci，10mmnaedta)中勻漿再用beckmanj2-21以13000rpm離心15分鐘使之沉淀。然后利用以下緩沖液作類似的洗滌以除去洗滌劑和鹽：50mmtris-hclph8.0，1mmnaedta。最終，將包涵體分成30mg等份試樣，-70℃冷凍。重折疊從冷凍儲(chǔ)備物中解凍約20mgtcrα鏈和40mgscfv-tcrβ鏈溶解包涵體，用20ml胍溶液(6m胍-鹽酸，50mmtrishclph8.1，100mmnacl，10mmedta，10mmdtt)稀釋，在37℃水浴中溫育30分鐘到1小時(shí)以確保完全的鏈變性。然后將含有完全還原和變性的tcr鏈的胍溶液注射入以下的1升重折疊緩沖液：100mmtrisph8.1，400mml-精氨酸，2mmedta，5m脲。加入氧化還原對(duì)(鹽酸半胱胺和二鹽酸胱胺)至終濃度分別為10mm和1mm，約5分鐘后加入變性的tcrα和scfv-tcrβ鏈。溶液靜置約30分鐘。用透析管狀纖維素膜(西格瑪-阿爾德里奇公司；產(chǎn)品編號(hào)d9402)和10lh2o對(duì)重折疊的scfv-tcr透析18-20小時(shí)。然后，將透析緩沖液更換為新鮮的10mmtrisph8.1(10l)兩次，在5℃±3℃下繼續(xù)透析約8小時(shí)。通過下述3-步純化方法將可溶性和正確折疊的scfv-tcr與降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。第一純化步驟將經(jīng)透析的重折疊物(10mmtrisph8.1中)加載于poros50hq陰離子交換柱，利用akta純化儀(ge保健公司)用0-500mmnacl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)6個(gè)柱體積以上。將諸峰組分(以約20ms/cm的電導(dǎo)率洗脫)保存于4℃。通過快藍(lán)染色劑(instantbluestain)(諾瓦新公司(novexin))染色的sds-page分析諸峰組分，然后合并。第二純化步驟陽離子交族純化根據(jù)scfv-tcr融合體的pi，用20mmmesph6-6.5稀釋對(duì)陰離子交換合并組分作緩沖液更換。通過將稀釋的合并組分(20mmmesph6-6.5中)加載到poros50hs陽離子交換柱上并利用akta純化儀(ge保健公司)，用0-500mmnacl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)6個(gè)柱體積以上來將可溶性和正確折疊的scfv-tcr與錯(cuò)誤折疊的降解產(chǎn)物及雜質(zhì)分離。將諸峰組分(以約10ms/cm的電導(dǎo)率洗脫)保存于4℃。最終純化步驟先通過快藍(lán)染色劑(諾瓦新公司)染色的sds-page分析第二純化步驟的諸峰組分，然后合并。然后濃縮合并的組分以供最終純化步驟，此時(shí)利用在pbs緩沖液(西格瑪公司)中預(yù)平衡的superdexs200凝膠過濾柱(ge保健公司)純化和表征可溶性scfv-tcr。通過快藍(lán)染色劑(諾瓦新公司)染色的sds-page分析在相對(duì)分子量約為78kda洗脫的峰組分，然后合并?？赏ㄟ^以下方法改變以上實(shí)施例6制備的構(gòu)建物：用例如選自gggsgseqidno：49、ggsggseqidno：50、gsgggseqidno：51或ggegggsegggsseqidno：47的備選接頭序列取代ggggsseqidno：48接頭序列，和/或用a取代seqidno：36的氨基酸d1，和/或用q取代seqidno：36的氨基酸i2，和/或用a或g取代seqidno：8的氨基酸s1。在另一種變化形式中，可將構(gòu)成seqidno：36部分的β可變域序列從seqidno：27變?yōu)閟eqidno：13、17、23或26。實(shí)施例7非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)該試驗(yàn)是51cr釋放細(xì)胞毒性試驗(yàn)的比色替代試驗(yàn)，定量測(cè)定細(xì)胞裂解后釋放的乳酸脫氫酶(ldh)。采用30-分鐘偶聯(lián)的酶試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中釋放的ldh，其將四唑鹽(int)轉(zhuǎn)化成紅色甲暨產(chǎn)物。形成的顏色量與裂解細(xì)胞的數(shù)量成比例。利用標(biāo)準(zhǔn)96-孔平板讀數(shù)計(jì)收集490nm的吸光度數(shù)據(jù)。材料-非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)(普羅邁格公司)(g1780)含有底物混合物、試驗(yàn)緩沖液、裂解溶液和終止溶液。-試驗(yàn)培養(yǎng)基：10％fcs(熱-滅活的，吉布可公司，目錄號(hào)10108-165)、不含酚紅的88％rpmi1640(英杰公司(invitrogen)，目錄號(hào)32404014)，1％谷氨酰胺，200mm(英杰公司，目錄號(hào)25030024)，1％青霉素/鏈霉素(英杰公司，目錄號(hào)15070063)。-nunc微孔圓底96孔組織培養(yǎng)板(紐克公司(nunc)，目錄號(hào)163320)-nunc-免疫平板maxisorb(紐克公司，目錄號(hào)442404)方法靶細(xì)胞制備該試驗(yàn)所用的靶細(xì)胞來自腫瘤細(xì)胞系mel526(黑色素瘤細(xì)胞系hla-a2+gp100+)和a375(黑色素瘤細(xì)胞系hla-a2+gp100-)。在試驗(yàn)培養(yǎng)基中制備靶細(xì)胞；靶細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2x105個(gè)細(xì)胞/毫升，從而得到1x104個(gè)細(xì)胞/孔，50μl。效應(yīng)細(xì)胞制備該試驗(yàn)所用的效應(yīng)細(xì)胞是pbmc(外周血單核細(xì)胞)。效應(yīng)物與靶標(biāo)之比采用50：1(1x107個(gè)細(xì)胞/毫升，從而得到5x105個(gè)細(xì)胞/孔，50μl)。劑劑/檢驗(yàn)化合物制備通過試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋來制備不同濃度的抗-cd3scfv-gp100tcr融合體(30nm到0.03pm)。按照實(shí)施例6制備抗-cd3scfv-gp100tcr融合體。試驗(yàn)制備采用以下順序?qū)⒃囼?yàn)的諸組分加入平板：-50μl靶細(xì)胞(如上所述制備)加入各孔-50μl效應(yīng)細(xì)胞(如上所述制備)加入各孔-50μl試劑(如上所述制備)加入各孔。如下所述制備幾個(gè)對(duì)照：-效應(yīng)物自發(fā)釋放：僅有50μl效應(yīng)細(xì)胞。-靶細(xì)胞自發(fā)釋放：僅有50μl靶細(xì)胞。-靶最大釋放：僅有50μl靶細(xì)胞。-試驗(yàn)培養(yǎng)基對(duì)照：僅有150μl培養(yǎng)基。-裂解溶液的試驗(yàn)培養(yǎng)基體積對(duì)照：僅有150μl培養(yǎng)基。所有孔一式三份制備，終體積為150μl。以250xg離心平板4分鐘，然后在37℃溫育24小時(shí)。45分鐘后收集上清液，將15μl裂解溶液加入靶細(xì)胞最大釋放和試驗(yàn)培養(yǎng)基體積對(duì)照孔。以250xg離心平板4分鐘。將試驗(yàn)平板各孔的50μl上清液轉(zhuǎn)移至平底96孔nuncmaxisorb板的相應(yīng)孔。利用試驗(yàn)緩沖液(12ml)重建底物混合物。然后將50μl重建的底物混合物加入平板的各孔。平板蓋上鋁箔，室溫下溫育30分鐘。將50μl終止溶液加入平板的各孔以終止反應(yīng)。加入終止溶液后1小時(shí)內(nèi)用elisa平板讀數(shù)計(jì)記錄490nm的吸光度。計(jì)算結(jié)果從實(shí)驗(yàn)、靶細(xì)胞自發(fā)釋放和效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放的所有吸光度值中扣除培養(yǎng)基背景的平均吸光度值。從靶細(xì)胞最大釋放對(duì)照獲得的吸光度值中扣除體積校正對(duì)照的平均吸光度值。前兩步驟中獲得的校正值用于下式以計(jì)算細(xì)胞毒性百分比：％細(xì)胞毒性＝100x(實(shí)驗(yàn)-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)-靶細(xì)胞自發(fā))/(靶細(xì)胞最大-靶細(xì)胞自發(fā))結(jié)果圖7顯示特異性結(jié)合gp100呈遞細(xì)胞(mel526細(xì)胞)的抗-cd3scfv-gp100高親和力tcr(如實(shí)施例6所述制備)重定向的t細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。實(shí)施例8用天然gp100tcr的高親和力變體轉(zhuǎn)染t-細(xì)胞(a)通過293t細(xì)胞的快速介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(express-in-mediatedtransienttransfection)制備慢病毒載體利用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝含有編碼所需tcr的基因的慢病毒載體。利用快速介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(express-in-mediatedtransfection)(開放生物系統(tǒng)公司(openbiosystems))用4種質(zhì)粒(含有實(shí)施例8c所述tcrα鏈-p2a-tcrβ鏈單orf基因的一種慢病毒載體，和含有構(gòu)建傳染性但非復(fù)制型慢病毒顆粒所必需的其它組分的3種質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。為進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取一t150燒瓶的指數(shù)生長(zhǎng)期的293t細(xì)胞，細(xì)胞均勻分布在平板上，匯合度略高于50％。將快速(express-in)等份試樣置于室溫下。將3ml無血清培養(yǎng)基(rpmi1640+10mmhepes)置于無菌的15ml圓錐管中。將174μl快速試劑直接加入無血清培養(yǎng)基(提供的試劑與dna重量比是3.6：1)。顛倒試管3-4次以徹底混合，室溫下溫育5-20分鐘。在另一1.5ml微型試管中，將15μg質(zhì)粒dna加入預(yù)混合的包裝混合等份試樣(含有18μgprsv.rev(rev表達(dá)質(zhì)粒)、18μgpmdlg/p.rre(gag/pol表達(dá)質(zhì)粒)、7μgpvsv-g(vsv糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒))，通常約22μl，上下抽吸以確保dna混合物均勻。將約1ml快速/無血清培養(yǎng)基滴加入dna混合物，然后輕柔上下抽吸，再轉(zhuǎn)移回剩余的快速/無血清培養(yǎng)基。顛倒試管3-4次，室溫下溫育15-30分鐘。從細(xì)胞燒瓶中除去老的培養(yǎng)基。向293t細(xì)胞的直立燒瓶的底部直接加入快速/培養(yǎng)基/dna(3ml)復(fù)合物。緩慢放入燒瓶板以覆蓋細(xì)胞，極其輕柔地?fù)u晃燒瓶以確保均勻分布。1分鐘后，加入22ml新鮮培養(yǎng)基(r10+hepes：rpmi1640，10％熱-滅活的fbs，1％青霉素/鏈霉素/l-谷氨酰胺，10mmhepes)，小心移回孵育箱。37℃/5％co2下溫育過夜。24小時(shí)后，收獲含有包裝的慢病毒載體的培養(yǎng)基。為收獲包裝的慢病毒載體，經(jīng)0.45微米尼龍注射濾器過濾細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，以10,000g離心培養(yǎng)基18小時(shí)(或112,000g，2小時(shí))，除去大多數(shù)上清液(小心不要打碎沉淀物)并將沉淀物重懸在剩余的幾毫升上清液中(通常是每個(gè)試管約2ml到31ml起始體積)。在干冰上快速冷凍1ml等份試樣，-80℃保存。(b)用含有感興趣基因的包裝慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞先從健康志愿者的血液中分離人t細(xì)胞(根據(jù)要求為cd8或cd4或二者)，再用包裝的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。計(jì)數(shù)這些細(xì)胞，在48孔板中，在含有50u/mlil-2的r10中以1x106個(gè)細(xì)胞/毫升(0.5毫升/孔)與預(yù)洗滌的抗-cd3/cd28抗體-包被小珠(dynalt細(xì)胞擴(kuò)增物，英杰公司)溫育過夜，比例為3個(gè)珠/孔。刺激過夜后，將0.5ml純凈的包裝慢病毒載體加入所需細(xì)胞。37℃/5％co2下溫育3天。轉(zhuǎn)導(dǎo)3天后計(jì)數(shù)細(xì)胞，稀釋至0.5x106個(gè)細(xì)胞/毫升。視需要加入含有il-2的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5-7天除去珠。以兩天為間隔計(jì)數(shù)細(xì)胞，替換或加入含有il-2的新鮮培養(yǎng)基。維持細(xì)胞在0.5x106-1x106個(gè)細(xì)胞/毫升。從第3天開始通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞，從第5天開始用于功能試驗(yàn)(例如，ifnγ釋放的elispot)。從第10天開始或在細(xì)胞減緩分裂和尺寸變小之時(shí)，冷凍儲(chǔ)存等份細(xì)胞，至少4x106個(gè)細(xì)胞/小瓶(1x107個(gè)細(xì)胞/毫升，90％fbs/10％dmso)。(c)通過以上方法(a)和(b)進(jìn)行野生型(wt)tcr基因的t細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖8a是編碼天然gp100tcr的dna序列(seqidno：37)(為最大人細(xì)胞表達(dá)作密碼子優(yōu)化)。其是全長(zhǎng)α鏈(trav17)-豬捷申病毒-12a-全長(zhǎng)β鏈(trbv19)單開放讀框構(gòu)建物。2a序列以下劃線顯示，其前方是編碼furin切割位點(diǎn)以促使蛋白水解除去2a序列的核苷酸(下文聯(lián)系圖8b進(jìn)一步討論(seqidno38))。mrna的蛋白質(zhì)翻譯期間，在2a序列的3’端的肽鍵跳行(peptidebondskipping)產(chǎn)生兩種蛋白：1)αtcr鏈-2a融合體；2)βtcr鏈。seqidno：37(圖8a)包含nhei和sali限制性位點(diǎn)(下劃線所示)。圖8b是對(duì)應(yīng)于圖8a的氨基酸序列(seqidno：38)。在圖8b中：m1-n20是野生型α鏈tcr成熟后除去的前導(dǎo)序列；s21-s223對(duì)應(yīng)于野生型α鏈序列seqidno：2；s21-r250對(duì)應(yīng)于野生型α鏈胞外結(jié)構(gòu)域；i251-l267是成熟tcr的α鏈跨膜區(qū)；w268-s270是成熟tcr的α鏈胞內(nèi)區(qū)；r273-r276是促進(jìn)高爾基體中蛋白水解除去p2a序列a281-p299的furin切割位點(diǎn)；g271、s272、s277到g280、r300是使得furin切割和p2a序列具有全功能的柔性接頭；m301-v319是野生型β鏈tcr成熟后除去的前導(dǎo)序列；d320-d561對(duì)應(yīng)于野生型β鏈序列seqidno：3；d320-e581對(duì)應(yīng)于野生型β鏈胞外域；i582-v603是成熟tcr的β鏈跨膜區(qū)；k604-g610是成熟tcr的β鏈胞內(nèi)區(qū)。(d)用野生型和高親和力gp100tcr轉(zhuǎn)染的t-細(xì)胞按照以上(a)和(b)所述的方法，利用對(duì)于兩種dna構(gòu)建物獨(dú)特的nhei和sali限制性位點(diǎn)將gp100αwt-2a-βwttcr基因(seqidno37(圖8a))插入pelnsxv慢病毒載體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的t-細(xì)胞。類似地，可用與seqidno37(圖8a)相同的基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生t-細(xì)胞，除了所述基因編碼(a)含野生型α鏈seqidno：2的可變域序列(s1到a109)的tcr，與具有seqidno：10-35之一的β鏈可變域結(jié)合；或(b)具有seqidno：7-9之一的α鏈可變域，與野生型β鏈seqidno：3的可變域序列(d1到t112)結(jié)合；或(c)具有seqidno：7-9之一的α鏈可變域，與具有seqidno：10-35之一的β鏈可變域結(jié)合。實(shí)施例9與野生型-親和力tcr-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系起反應(yīng)相比，gp100親和力提高的tcr-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的激活增強(qiáng)elispot方案進(jìn)行以下試驗(yàn)以證明tcr-轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)對(duì)腫瘤細(xì)胞系起反應(yīng)的激活。利用elispot試驗(yàn)檢測(cè)的ifn-γ產(chǎn)量作為細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)激活的讀出值。試劑試驗(yàn)培養(yǎng)基：10％fcs(吉布可公司，目錄號(hào)2011-09)，88％rpmi1640(吉布可公司，目錄號(hào)42401)，1％谷氨酰胺(吉布可公司，目錄號(hào)25030)和1％青霉素/鏈霉素(吉布可公司，目錄號(hào)15070-063)。洗滌緩沖液：0.01mpbs/0.05％吐溫20pbs(吉布可公司目錄號(hào)10010)人ifnγelispotpvdf-酶試劑盒(迪亞克隆公司(diaclone)，法國(guó)；目錄號(hào)856.051.020)裝有所需的所有其它試劑。(捕捉和檢測(cè)抗體，脫脂奶粉，bsa，鏈霉親和素-堿性磷酸酶和bcip/nbt溶液以及人ifn-γpvdfelispot96孔板)方法靶細(xì)胞制備該方法所用的靶細(xì)胞是天然表位呈遞細(xì)胞：mel526黑色素瘤、mel624黑色素瘤、mewo和skmel5，它們均是hla-a2+gp100+。a375黑色素瘤(hla-a2+gp100-)用作陰性對(duì)照細(xì)胞系。hla-a2+人原代肝細(xì)胞(批次hep2，得自sc公司(sciencell))確定為gp100-(未通過rt-pcr檢測(cè)gp100mrna表達(dá))，將其用作陰性對(duì)照。利用megafuge1.0(赫雷斯公司(heraeus))以1200rpm、10分鐘離心3次來洗滌充足的靶細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)。然后將細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞/毫升重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。效應(yīng)細(xì)胞制備該方法中所用的效應(yīng)細(xì)胞(t細(xì)胞)是cd4+和cd8+t細(xì)胞的1∶1混合物(通過負(fù)選擇(利用cd4和cd8負(fù)分離試劑盒，dynal)從pbl獲得)。用抗cd3/cd28包被珠(t細(xì)胞擴(kuò)增物，英杰公司)刺激細(xì)胞，用攜帶編碼感興趣的完整αβtcr的基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(依據(jù)實(shí)施例8所述和圖8b所示的構(gòu)建物)，在含有50u/mlil-2的試驗(yàn)培養(yǎng)基中擴(kuò)增直至轉(zhuǎn)導(dǎo)后10-13天。然后將這些細(xì)胞置于試驗(yàn)培養(yǎng)基中，利用megafuge1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分鐘離心進(jìn)行洗滌。然后將細(xì)胞以4x所需終濃度重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。elispot如下所示準(zhǔn)備平板：以每塊平板10毫升無菌pbs稀釋100微升抗-ifn-γ捕捉抗體。然后將100微升的稀釋捕捉抗體等份加入各孔。4℃下溫育平板過夜。溫育后，洗滌平板(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀；dynex)以除去捕捉抗體。然后將無菌pbs配制的100μl2％脫脂奶加入各孔并在室溫下溫育平板2小時(shí)以封閉平板。然后從平板中洗去脫脂奶(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，通過在紙巾上輕彈和輕拍elispot平板以除去任何剩余的洗滌緩沖液。然后采用以下順序?qū)⒃囼?yàn)的諸組分加入elispot平板：50μl靶細(xì)胞106個(gè)細(xì)胞/毫升(得到總共50,000個(gè)靶細(xì)胞/孔)?？杉尤?0μl可溶性高親和力gp100tcr(1.2μm，得到300nm終濃度)以封閉tcr轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞的gp100-特異性激活。培養(yǎng)基足以得到每孔200ul的最終體積(試驗(yàn)培養(yǎng)基)。50μl效應(yīng)細(xì)胞(5,000混合cd4/8+細(xì)胞/孔)。然后溫育平板過夜(37℃/5％co2)。第二天，用洗滌緩沖液洗滌平板3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，在紙巾上輕拍以除去過量的洗滌緩沖液。然后將100微升檢測(cè)一抗加入各孔。將550微升蒸餾水加入diaclone試劑盒提供的檢測(cè)抗體小瓶來制備檢測(cè)一抗。然后用10毫升pbs/1％bsa(一塊平板所需的體積)稀釋100微升該溶液。然后在室溫下溫育平板至少2小時(shí)，再用洗滌緩沖液洗滌3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，在紙巾上輕拍平板以除去過量的洗滌緩沖液。將100微升稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶加入各孔并在室溫下溫育平板1小時(shí)來進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)。向10毫升pbs/1％bsa(一塊平板所需的體積)加入10微升鏈霉親和素-堿性磷酸酶來制備鏈霉親和素-堿性磷酸酶。然后用洗滌緩沖液洗滌平板3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，在紙巾上輕拍以除去過量的洗滌緩沖液。然后將隨diaclone試劑盒提供的100微升bcip/nbt溶液加入各孔。顯影期間用箔覆蓋平板，靜置5-15分鐘。在此期間常規(guī)檢測(cè)顯影平板的斑點(diǎn)，確定終止反應(yīng)的最佳時(shí)間。在充滿自來水的槽中洗滌平板以終止顯影反應(yīng)，甩干，然后將它們拆分為其3個(gè)組成部分。然后在50℃干燥平板1小時(shí)，再利用免疫斑點(diǎn)平板讀數(shù)計(jì)(ctl；細(xì)胞技術(shù)有限公司(cellulartechnologylimited))計(jì)數(shù)膜上形成的斑點(diǎn)。結(jié)果通過elispot試驗(yàn)(如上所述)檢驗(yàn)激活的tcr-轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞對(duì)各種gp100-陽性和對(duì)照腫瘤細(xì)胞系或?qū)φ崭渭?xì)胞起反應(yīng)的ifnγ釋放。利用prism(gp公司(graphpad))繪制各孔中觀察到的elispot斑點(diǎn)數(shù)量?；旌系腸d4+/cd8+t細(xì)胞與gp100+hla-a2+腫瘤細(xì)胞系mel526、mel624、skmel5或mewo或與gp100-hla-a2+a375或hep2溫育，所述t細(xì)胞依據(jù)實(shí)施例8所述和圖8b所示的構(gòu)建物表達(dá)a)tcrno：1(氨基酸序列seqidno：38)、b)tcrno：2或c)tcrno：3，但具有下表所述的tcrα鏈和β鏈可變域。通過加入300nm實(shí)施例4的gp100tcr(如實(shí)施例2所述制備)進(jìn)行g(shù)p100-特異性封閉，所述tcr具有vαseqidno：8和vβseqidno：27。圖9a顯示tcrno：1-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞僅對(duì)mel526、mel624和skmel5黑色素瘤細(xì)胞系起反應(yīng)而釋放ifnγ，被300nm實(shí)施例4的gp100tcr有效阻斷，所述tcr具有vαseqidno：8和vβseqidno：27。親和力提高的gp100tcrno：2-轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞顯示對(duì)這些腫瘤細(xì)胞系的反應(yīng)更強(qiáng)，被300nm實(shí)施例4的gp100tcr有效阻斷，所述tcr具有vαseqidno：8和vβseqidno：27。圖9b顯示tcrno：1-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞對(duì)mel526細(xì)胞起反應(yīng)而釋放ifnγ，被300nmgp100tcr有效阻斷。對(duì)mewo細(xì)胞的ifnγ釋放極差。tcrno：2-轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞和tcrno：3-轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞顯示對(duì)mel526和mewo細(xì)胞的反應(yīng)更強(qiáng)，被300nmgp100tcr有效阻斷。實(shí)施例10評(píng)估具有多種tcr親和力的幾種gp100tcr-抗-cd3融合體的效力elispot方案進(jìn)行以下試驗(yàn)以比較各種gp100tcr-抗-cd3融合蛋白對(duì)呈遞gp100肽-hla-a2復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞系起反應(yīng)而激活細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)的能力。利用elispot試驗(yàn)檢測(cè)的ifn-γ產(chǎn)量作為t細(xì)胞激活的讀出值。elispot試驗(yàn)描述于之前的實(shí)施例9。試劑試驗(yàn)培養(yǎng)基、洗滌緩沖液、pbs和人ifnγelispotpvdf-酶促試劑盒如實(shí)施例9所述使用。方法靶細(xì)胞制備該方法所用的靶細(xì)胞是天然表位呈遞細(xì)胞mel526黑色素瘤細(xì)胞，它是hla-a2+gp100+。利用megafuge1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分鐘離心1次來洗滌充足的靶細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)。然后將細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞/毫升重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。效應(yīng)細(xì)胞制備該方法中所用的效應(yīng)細(xì)胞(t細(xì)胞)是cd8+t細(xì)胞(通過負(fù)選擇(利用cd8負(fù)分離試劑盒，dynal，目錄號(hào)113.19)從pbl獲得)。解凍效應(yīng)細(xì)胞，置于試驗(yàn)培養(yǎng)基中，然后利用megafuge1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分鐘離心進(jìn)行洗滌。然后將細(xì)胞以4x所需終濃度重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。試劑/檢驗(yàn)化合物制備用試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋來制備不同濃度的各gp100tcr-scfv(從10nm到0.1pm)，從而得到4x終濃度。在結(jié)果部分鑒定了所檢驗(yàn)的gp100tcr-scfv融合體，如實(shí)施例6所述制備。elispot如實(shí)施例9所述準(zhǔn)備平板。然后采用以下順序?qū)⒃囼?yàn)的諸組分加入elispot平板：50μl靶細(xì)胞106個(gè)細(xì)胞/毫升(得到總共50,000個(gè)靶細(xì)胞/孔)。50μl試劑(tcr-抗-cd3融合體；不同濃度)50μl培養(yǎng)基(試驗(yàn)培養(yǎng)基)50μl效應(yīng)細(xì)胞(5,000個(gè)cd8+細(xì)胞/孔)。然后溫育平板過夜(37℃/5％co2)。如實(shí)施例9所述洗滌平板、制備一抗并用一抗進(jìn)行檢測(cè)。如實(shí)施例9所述進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)和顯影。然后在50℃下干燥平板1小時(shí)，再利用免疫斑點(diǎn)平板讀數(shù)計(jì)(ctl；細(xì)胞技術(shù)有限公司)計(jì)數(shù)膜上形成的斑點(diǎn)。結(jié)果該實(shí)施例中檢驗(yàn)的gp100tcr-抗-cd3scfv融合體包含具有seqidno：2(氨基酸1到109)所示可變域(氨基酸1到109)的gp100tcrα鏈序列seqidno：45或具有seqidno：8所示可變域(氨基酸1到109)的gp100tcrα鏈序列seqidno：45(其中x＝s)，以及seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗-cd3scfv，但其中1和2位的氨基酸分別是d和i，其中氨基酸殘基108-131被變體接頭，即rtsgpgdggkggpgkgpggegtkgtgpgg(seqidno：44)替代，氨基酸殘基254-258被變體接頭，即ggegggsegggs(seqidno：47)替代，具有seqidno：27所示β鏈可變域，其可變?yōu)閟eqidno：3的可變域(seqidno：3的d1到t112)，或變?yōu)閟eqidno：13的可變域，或變?yōu)閟eqidno：17的可變域，或變?yōu)閟eqidno：23的可變域或變?yōu)閟eqidno：26的可變域，如下表所示。如實(shí)施例6所述制備tcr-抗-cd3融合體。利用prism(gp公司)繪制各孔中觀察到的elispot斑點(diǎn)數(shù)與融合構(gòu)建物濃度的圖(參見圖10)。從這些劑量應(yīng)答曲線測(cè)定ec50值(在誘導(dǎo)50％最高應(yīng)答的tcr-抗-cd3融合體濃度下測(cè)定ec50)。圖10顯示特異性結(jié)合gp100呈遞細(xì)胞的gp100tcr-抗-cd3融合體特異性激活cd8+t細(xì)胞。下表顯示各gp100tcr-抗-cd3融合體的ec50以及與野生型tcr(tcr編號(hào)1)相比，tcr/肽-hla親和力的提高。*注意：在所檢驗(yàn)的最高融合體濃度下，wttcr(tcrno：1)-抗-cd3的最大信號(hào)不到tcrno：7-抗-cd3觀察到的信號(hào)的20％，因此，tcrno：1-抗-cd3的ec50值無法可靠測(cè)定。在所檢驗(yàn)的tcrno：2-抗-cd3融合體的最高濃度下，t細(xì)胞激活未達(dá)到最高，因此，ec50值無法可靠測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)在整體上表明具有較高親和力tcr部分的tcr-抗-cd3融合體更好地激活cd8+t細(xì)胞。這些結(jié)果證明tcr對(duì)gp100肽-hla-a2復(fù)合物的親和力與tcr-抗-cd3融合體激活cd8+t細(xì)胞的效力之間的相關(guān)性。與檢驗(yàn)的其它tcr融合體相比，tcrno：7-抗-cd3融合體顯示優(yōu)秀的效力。實(shí)施例11檢驗(yàn)高親和力gp100-抗-cd3融合體的效力的t細(xì)胞重定向試驗(yàn)elispot方案進(jìn)行以下試驗(yàn)以比較各種gp100tcr-抗-cd3融合蛋白對(duì)呈遞gp100肽-hla-a2復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞系起反應(yīng)而激活細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)的能力。利用elispot試驗(yàn)檢測(cè)的ifn-γ產(chǎn)量作為t細(xì)胞激活的讀出值。試劑試驗(yàn)培養(yǎng)基：10％fbs(熱滅活)(國(guó)際血清實(shí)驗(yàn)室(seralaboratoriesinternational)，目錄號(hào)eu-000-f1)，88％rpmi1640(英杰公司，目錄號(hào)42401018)，1％l-谷氨酰胺(英杰公司，目錄號(hào)25030024)和1％青霉素/鏈霉素(英杰公司，目錄號(hào)15070063)。洗滌緩沖液：0.01mpbs，用1l去離子水(西格瑪公司，目錄號(hào)p3813)/0.05％吐溫20(西格瑪公司，目錄號(hào)p7949)稀釋一袋pbs(英杰公司，目錄號(hào)10010015)稀釋緩沖液：含有10％fbs(熱滅活)(國(guó)際血清實(shí)驗(yàn)室，目錄號(hào)eu-000-f1)的pbs(英杰公司，目錄號(hào)10010015)人ifnγelispotpvdf-酶促試劑盒(10塊平板)(bd；目錄號(hào)551849)，其裝有pvdfelispot96孔板、捕捉抗體、檢測(cè)抗體和鏈霉親和素-hrp(辣根過氧化物酶)aec底物試劑組(bd，目錄號(hào)551951)方法靶細(xì)胞制備該方法所用的靶細(xì)胞是天然表位呈遞細(xì)胞mel526黑色素瘤細(xì)胞，它是hla-a2+gp100+。a375黑色素瘤(hla-a2+gp100-)用作陰性對(duì)照細(xì)胞系。利用megafuge1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分鐘離心1次來洗滌充足的靶細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)。然后將細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞/毫升重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。效應(yīng)細(xì)胞制備該方法中所用的效應(yīng)細(xì)胞(t細(xì)胞)是cd8+t細(xì)胞(通過負(fù)選擇(利用cd8負(fù)分離試劑盒，dynal，目錄號(hào)113.19)從pbl獲得)。解凍效應(yīng)細(xì)胞，置于試驗(yàn)培養(yǎng)基中，然后利用megafuge1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、5分鐘離心進(jìn)行洗滌。然后將細(xì)胞以每毫升1.6x105個(gè)細(xì)胞重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中得到每孔8,000個(gè)細(xì)胞，50μl。試劑/檢驗(yàn)化合物制備用試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋來制備不同濃度的各gp100tcr-scfv(從10nm到0.1pm)，從而得到4x終濃度。在結(jié)果部分鑒定了所檢驗(yàn)的gp100tcr-scfv融合體，如實(shí)施例6所述制備。elispot如下所示準(zhǔn)備平板：每塊平板用10毫升無菌pbs稀釋50微升抗-ifn-γ捕捉抗體。然后將100微升稀釋捕捉抗體等份加入各孔。4℃溫育平板過夜。溫育后，通過將捕捉抗體彈入水槽中，在藍(lán)輥(blueroll)上輕拍以除去殘留的抗體，然后向各孔加入200微升試驗(yàn)培養(yǎng)基并在室溫下溫育平板兩小時(shí)以封閉平板。通過將培養(yǎng)基彈入水槽中除去封閉試驗(yàn)培養(yǎng)基，在紙巾上輕拍elispot板除去任何剩余的培養(yǎng)基。然后采用以下順序?qū)⒃囼?yàn)的諸組分加入elispot平板：50μl靶細(xì)胞106個(gè)細(xì)胞/毫升(得到總共50,000個(gè)靶細(xì)胞/孔)。50μl試劑(tcr-抗-cd3融合體；不同濃度)50μl培養(yǎng)基(試驗(yàn)培養(yǎng)基)50μl效應(yīng)細(xì)胞(8,000個(gè)cd8+細(xì)胞/孔)。然后溫育平板過夜(37℃/5％co2)。第二天，用洗滌緩沖液洗滌平板3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，在紙巾上輕拍以除去過量的洗滌緩沖液。然后將100微升檢測(cè)一抗加入各孔。將40微升加入10毫升稀釋緩沖液(一塊平板所需的體積)中來制備檢測(cè)一抗。然后在室溫下溫育平板至少2小時(shí)，再用洗滌緩沖液洗滌3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，在紙巾上輕拍平板以除去過量洗滌緩沖液。將100微升稀釋的鏈霉親和素-hrp加入各孔并在室溫下溫育平板1小時(shí)來進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)。將100微升鏈霉親和素-hrp加入10毫升稀釋緩沖液(一塊平板所需的體積)來制備鏈霉親和素-hrp。然后用洗滌緩沖液洗滌平板3次(程序1，平板類型2，ultrawashplus96-孔板洗滌儀，dynex)，再用pbs洗滌兩次，所述洗滌通過手動(dòng)移液，每孔加入200微升并彈入水槽。在紙巾上輕拍平板以除去過量的pbs。然后將100微升aec底物試劑加入各孔。將10滴aec色原加入10毫升aec緩沖液(一塊平板所需的體積)來制備底物。顯影期間用箔覆蓋平板，靜置5-15分鐘。在此期間常規(guī)檢測(cè)顯影平板的斑點(diǎn)，確定終止反應(yīng)的最佳時(shí)間。用去離子水洗滌平板以終止顯影反應(yīng)，拍干，然后將它們拆分為其3個(gè)組成部分。然后在室溫下風(fēng)干平板至少1小時(shí)，再利用免疫斑點(diǎn)平板讀數(shù)計(jì)(ctl；細(xì)胞技術(shù)有限公司)計(jì)數(shù)膜上形成的斑點(diǎn)。結(jié)果該實(shí)施例中檢驗(yàn)的gp100tcr-抗-cd3scfv融合體在下文描述為蛋白質(zhì)1、2、3和4。蛋白質(zhì)1包含具有序列seqidno：45的gp100tcrα鏈，但含有seqidno：8所示可變域，其中x＝s，和序列seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗cd3scfv，但1和2位的氨基酸分別是d和i。蛋白質(zhì)2包含具有序列seqidno：45的gp100tcrα鏈，但含有seqidno：8所示可變域，其中x＝g，但在其c-末端截短了8個(gè)氨基酸殘基(f196到s203，包括端點(diǎn))，和序列seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗cd3scfv，但1和2位的氨基酸分別是a和q。蛋白質(zhì)3包含具有序列seqidno：45的gp100tcrα鏈，但含有seqidno：8所示可變域，其中x＝a，但在其c-末端截短了8個(gè)氨基酸殘基(f196到s203，包括端點(diǎn))，和序列seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗cd3scfv，但1和2位的氨基酸分別是a和i。蛋白質(zhì)4包含具有序列seqidno：45的gp100tcrα鏈，但含有seqidno：8所示可變域，其中x＝g，但在其c-末端截短了8個(gè)氨基酸殘基(f196到s203，包括端點(diǎn))，和序列seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗cd3scfv，但1和2位的氨基酸分別是d和i。tcr-抗-cd3融合體如實(shí)施例6所述制備。通過elispot試驗(yàn)(如上所述)檢驗(yàn)高親和力gp100tcr-抗-cd3融合蛋白重定向的激活cd8t細(xì)胞的ifnγ釋放。利用prism(gp公司)繪制各孔中觀察到的elispot斑點(diǎn)數(shù)量(參見圖11)。從劑量應(yīng)答曲線測(cè)定ec50值(在誘導(dǎo)50％最高應(yīng)答的tcr-抗-cd3融合體濃度下測(cè)定ec50)。圖11顯示特異性結(jié)合gp100呈遞細(xì)胞的gp100tcr-抗-cd3融合體特異性激活cd8+t細(xì)胞。該試驗(yàn)?zāi)軝z驗(yàn)4種gp100tcr-抗-cd3融合蛋白，它們均顯示對(duì)t細(xì)胞的有效重定向和非常相似的潛力，如下表所示。蛋白質(zhì)編號(hào)ec5011.252e-1022.69e-1135.54e-1143.149e-11實(shí)施例12高親和力gp100-抗-cd3融合體的體內(nèi)效力高親和力gp100-抗-cd3融合體對(duì)人ylepgpvtagp100肽-hla-a2復(fù)合物和人cd3具有特異性，而不結(jié)合小鼠gp100肽-hla復(fù)合物或cd3。因此，利用人黑色素瘤異種移植模型，在免疫缺陷小鼠中研究抗腫瘤效力。beige/scidmel526異種移植模型：由于mel526細(xì)胞呈遞gp100肽-hla-a2復(fù)合物和高親和力gp100-抗-cd3融合體顯示體外重定向裂解mel526細(xì)胞，選擇mel526人黑色素瘤細(xì)胞系來建立人異種移植模型。該模型中利用免疫缺陷beige/scid小鼠(t，b，nk細(xì)胞功能缺陷)。細(xì)胞植入第0天，在pbs中(200μl/小鼠)將mel526腫瘤細(xì)胞(2x106/小鼠)與人pbmc細(xì)胞(5x106/小鼠)混合，皮下注射入各小鼠。源自4位健康人供者的pbmc均勻分布在6組中(每組8只小鼠)。研究設(shè)計(jì)：向每組8只小鼠靜脈內(nèi)注射載體對(duì)照(pbs+小鼠血清)或高親和力gp100tcr-抗-cd3融合體，連續(xù)5天，從皮下注射mel526腫瘤細(xì)胞和pbmc或單獨(dú)注射mel526細(xì)胞后1小時(shí)開始。研究設(shè)計(jì)的細(xì)節(jié)見下表。該實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的gp100tcr-抗-cd3融合體包含含有α可變域seqidno：8(x＝s)的gp100tcrα鏈和seqidno：36所示gp100tcrβ鏈-抗-cd3scfv，其中1和2位的氨基酸分別是d和i。該tcr-抗-cd3融合體如實(shí)施例6所述制備。研究讀數(shù)從腫瘤/pbmc植入之日開始，在整個(gè)研究期間檢測(cè)腫瘤大小和體重(一周三次)。利用外部卡尺，通過檢測(cè)長(zhǎng)度和寬度測(cè)定腫瘤尺寸。長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)于腫瘤的最大水平維度，寬度對(duì)應(yīng)于腫瘤的最短維度。預(yù)計(jì)了平均腫瘤體積(平均值+sd；平均值+sem)，示于圖中。記錄各單獨(dú)鑒定小鼠的腫瘤生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。利用下式計(jì)算腫瘤體積：v＝長(zhǎng)度x寬度2/2。結(jié)果圖12顯示了各研究組的平均腫瘤體積。不含效應(yīng)細(xì)胞注射靶細(xì)胞，然后進(jìn)行載體處理(組1)，連同效應(yīng)細(xì)胞注射靶細(xì)胞，然后進(jìn)行載體處理(組2)，在第11天后開始顯示可檢測(cè)的腫瘤生長(zhǎng)。組2中的腫瘤生長(zhǎng)率與組1中的腫瘤生長(zhǎng)率相似。高親和力gp100tcr-抗-cd3處理在可檢測(cè)的腫瘤生長(zhǎng)中表現(xiàn)出顯著的療效，在pbmc效應(yīng)細(xì)胞存在下誘導(dǎo)mel526腫瘤生長(zhǎng)的劑量依賴性抑制作用。序列表<110>英美偌科有限公司(immunocoreltd)<120>t細(xì)胞受體<130>107<150>gb0911566.8<151>2009-07-03<160>51<170>patentin版本3.5<210>1<211>9<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>1tyrleugluproglyprovalthrala15<210>2<211>203<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>2serglnglnglyglugluaspproglnalaleuserileglnglugly151015gluasnalathrmetasncyssertyrlysthrserileasnasnleu202530glntrptyrargglnasnserglyargglyleuvalhisleuileleu354045ileargserasngluargglulyshisserglyargleuargvalthr505560leuaspthrserlyslysserserserleuleuilethralaserarg65707580alaalaaspthralasertyrphecysalathraspglyaspthrpro859095leuvalpheglylysglythrargleuservalilealaasnilegln100105110lysproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysserserasp115120125lysservalcysleuphethrasppheaspserglnthrasnvalser130135140glnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthrvalleuasp145150155160metargsermetaspphelysserasnseralavalalatrpserasn165170175lysseraspphealacysalaasnalapheasnasnserileilepro180185190gluaspthrphepheproserprogluserser195200<210>3<211>242<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>3aspglyglyilethrglnserprolystyrleuphearglysglugly151015glnasnvalthrleusercysgluglnasnleuasnhisaspalamet202530tyrtrptyrargglnaspproglyglnglyleuargleuiletyrtyr354045serglnilevalasnasppheglnlysglyaspilealagluglytyr505560servalserargglulyslysgluserpheproleuthrvalthrser65707580alaglnlysasnprothralaphetyrleucysalaserserilegly859095glyprotyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthrvalthr100105110gluaspleulysasnvalpheproprogluvalalavalpheglupro115120125serglualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleu130135140alathrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpvalasn145150155160glylysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulys165170175gluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleu180185190argvalseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcys195200205glnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasp210215220argalalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyarg225230235240alaasp<210>4<211>622<212>dna<213>人工序列<220><223>t細(xì)胞受體α鏈<400>4catatgagtcaacaaggagaagaagatcctcaggccttgagcatccaggagggtgaaaat60gccaccatgaactgcagttacaaaactagtataaacaatttacagtggtatagacaaaat120tcaggtagaggccttgtccacctaattttaatacgttcaaatgaaagagagaaacacagt180ggaagattaagagtcacgcttgacacttccaagaaaagcagttccttgttgatcacggct240tcccgggcagcagacactgcttcttacttctgtgctacggacggagacacacctcttgtc300tttggaaagggcacaagactttctgtgattgcaaatatccagaagcctgaccctgccgtg360taccagctgagagactctaagtcgagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgat420tctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaatgtgtg480ctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatct540gactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttcccc600agcccagaaagttcctaagctt622<210>5<211>739<212>dna<213>人工序列<220><223>t細(xì)胞受體β鏈<400>5catatggatggtggaattactcaatccccaaagtacctgttcagaaaggaaggacagaat60gtgaccctgagttgtgaacagaatttgaaccacgatgccatgtactggtaccgacaggac120ccagggcaagggctgagattgatctactactcacagatagtaaatgactttcagaaagga180gatatagctgaagggtacagcgtctctcgggagaagaaggaatcctttcctctcactgtg240acatcggcccaaaagaacccgacagctttctatctctgtgccagtagtatagggggcccc300tacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtg360ttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaag420gccacactggtgtgcctggccaccggtttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgg480gtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtctgcacagacccgcagcccctcaaggagcag540cccgccctcaatgactccagatacgctctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttc600tggcaggacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaat660gacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctgg720ggtagagcagactaagctt739<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>人工肽<400>6tyrleugluproglyprovalthrval15<210>7<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>t細(xì)胞受體α鏈可變域<400>7serglnglnglyglugluaspproglnalaleuserileglnglugly151015gluasnalathrmetasncyssertyrlysthrserileasnasnleu202530glntrptyrargglnasnserglyargglyleuvalhisleuileleu354045ileargserasngluargglulyshisserglyargleuargvalthr505560leuaspthrserlyslysserserserleuleuilethralaserarg65707580alaalaaspthralasertyrphecysalathraspglyserthrpro859095leumetpheglylysglythrargleuservalileala100105<210>8<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>t細(xì)胞受體α鏈可變域<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>xaa可以是ser或ala或gly<400>8xaaglngl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