本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有長(zhǎng)效作用的胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類(lèi)似物二聚體。本發(fā)明還涉及該glp-1類(lèi)似物二聚體在制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病、肥胖和阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是一種腸源性激素，主要在末端空腸、回腸和結(jié)腸的l細(xì)胞中合成，進(jìn)餐反應(yīng)中釋放到循環(huán)。glp-1(7-36,7-37)是體循環(huán)中g(shù)lp-1的主要活性形式，通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制控制血糖，包括胰島素和胰高血糖素的分泌，胃的排空以及外周胰島素的調(diào)節(jié)。glp-1(7-36,7-37)降血糖作用是葡萄糖依賴(lài)性的，可避免低血糖發(fā)生，而且具有抑制胰島β-細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胰島β-細(xì)胞的增生的作用，可逆轉(zhuǎn)病情發(fā)展。但天然glp-1的血漿半衰期僅為1-2分鐘，代謝不穩(wěn)定性限制了其作為藥物的應(yīng)用。研究表明，體內(nèi)的二肽激肽酶(dppiv)特異性識(shí)別并降解glp-1結(jié)構(gòu)中受體結(jié)合活性部位n端his-ala片段而使其快速失活，同時(shí)其他蛋白水解酶如內(nèi)肽酶等也參與腎臟濾過(guò)清除過(guò)程。

提高代謝穩(wěn)定性，延長(zhǎng)血漿半衰期，從而提高臨床用藥依從性是基于glp-1的藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)目標(biāo)。已經(jīng)公開(kāi)的專(zhuān)利技術(shù)可以歸納為：1)針對(duì)酶降解關(guān)鍵位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)改造(cn00806548.9、cn99814187.9、cn200410017667.9等)；2)母體肽鏈結(jié)構(gòu)中引入脂肪?；鶊F(tuán)，提高與血漿蛋白結(jié)合力以避免多肽在體內(nèi)快速清除(cn201210513145.2、cn200810124641.2、cn20118000352.1等)；3)glp-1類(lèi)似物蛋白融合技術(shù)；4)peg修飾等。盡管多年來(lái)進(jìn)行了多方面的嘗試，但是到目前為止基于glp-1(7-36,7-37)的母體肽鏈開(kāi)發(fā)上市的藥物只有利拉魯肽，其通過(guò)在天然glp-1分子結(jié)構(gòu)中將34位賴(lài)氨酸用精氨酸取代，并于第26位賴(lài)氨酸上增加了一個(gè)由谷氨酸介導(dǎo)的16碳棕櫚脂肪酸側(cè)鏈。而利拉魯肽雖然大幅延長(zhǎng)了glp-1體內(nèi)半衰期，但仍需要每天注射一次，用藥依從性仍有待改善。

本發(fā)明人等之前獲授權(quán)的專(zhuān)利cn201110076380.3涉及到glp-1(7-37)序列中的單個(gè)位點(diǎn)10、15、22、23、30、33分別被半胱氨酸替換形成的二聚體。在后續(xù)的優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)序列中酶降解敏感位點(diǎn)的替換、修飾以及有助于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的改造可以進(jìn)一步提高二聚體的活性和延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類(lèi)似物二聚體，

其中，所述glp-1類(lèi)似物二聚體由兩條glp-1類(lèi)似物單體形成，所述glp-1類(lèi)似物單體由下述通式ⅰ表示，

通式?。篽ax1gtftsdvssylegqaakefix2wlvkx3rz，

其中，z為nh2,g,gnh2,-gcg,-gca；

x1為leu、pro、phe、tyr；

x2為ala,cys；

x3為gly,aib；

當(dāng)x2為ala時(shí)，z為-gcg,-gca；

當(dāng)x2為cys時(shí)，z為nh2,g,gnh2。

優(yōu)選地，所述胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物二聚體通過(guò)兩條胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物單體的分子間二硫鍵形成。

優(yōu)選地，glp-1類(lèi)似物單體選自下述seqidno：1-24：

seqidno1：halgtftsdvssylegqaakeficwlvkgrnh2

seqidno2：halgtftsdvssylegqaakeficwlvkgrgnh2

seqidno3:hapgtftsdvssylegqaakefiawlvkaibrgcg

seqidno4：hapgtftsdvssylegqaakefiawlvkgrgcg

seqidno5：hapgtftsdvssylegqaakeficwlvkgrnh2

seqidno6：hapgtftsdvssylegqaakeficwlvkgrg

seqidno7:hapgtftsdvssylegqaakeficwlvkgrgnh2

seqidno8:hapgtftsdvssylegqaakefiawlvkaibrgca

seqidno9:hapgtftsdvssylegqaakeficwlvkaibrnh2

seqidno10:hapgtftsdvssylegqaakeficwlvkaibrgnh2

seqidno11：hafgtftsdvssylegqaakefiawlvkgrgcg

seqidno12：hafgtftsdvssylegqaakefiawlvkgrgca

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在本發(fā)明的另一方面中，提供了所述glp-1類(lèi)似物二聚體的制備方法，其包括下述步驟：

1).通過(guò)fmoc法合成glp-1類(lèi)似物單體粗品；

2).將步驟1)中得到的glp-1類(lèi)似物單體粗品純化、濃縮和凍干，得到凍干粉；

3)將步驟2)中得到的干粉溶解于去離子水中，碳酸氫銨法或dmso法形成glp-1類(lèi)似物二聚體，純化，獲得glp-1類(lèi)似物二聚體純品。

在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種組合物，其包含至少一種由通式ⅰ表示的glp-1類(lèi)似物單體形成的glp-1類(lèi)似物二聚體或其鹽。

優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑等。

優(yōu)選地，本發(fā)明的所述的組合物包含所述glp-1類(lèi)似物二聚體和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。所述藥用輔料包括水溶性填充劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。

所述水溶性填充劑包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等；所述ph調(diào)節(jié)劑包括但不限于枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨鹽等生理上可接受的無(wú)機(jī)堿或鹽；所述穩(wěn)定劑包括但不限于edta-2na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物，如hpc、hpc-sl、hpc-l或hpmc、環(huán)糊精、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。所述滲透壓調(diào)節(jié)劑包括但不限于氯化鈉或氯化鉀。

在本發(fā)明的又一方面中，提供了所述glp-1類(lèi)似物二聚體，或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療糖尿病、肥胖、阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述藥物組合物可以以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式或口服、直腸、鼻腔給藥。劑量范圍可以為5μg-10mg/次，這取決于治療對(duì)象、給藥方式、適應(yīng)癥以及其他因素。

在本發(fā)明又一方面中，提供了制備所述glp-1類(lèi)似物二聚體單體的方法：

1)通過(guò)常規(guī)固相或液相方法逐步或通過(guò)片段組裝合成；

2)在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的核酸構(gòu)建體，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收表達(dá)產(chǎn)物；

3)影響編碼多肽的核酸構(gòu)建體的無(wú)細(xì)胞體外表達(dá)，并回收表達(dá)產(chǎn)物；

或通過(guò)方法1)、2)或3)的任意組合來(lái)獲得肽片段，隨后連接這些片段以獲得目標(biāo)肽。

優(yōu)選地，本發(fā)明使用fmoc固相合成方法制備所述glp-1類(lèi)似物單體。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的glp-1類(lèi)似物二聚體由通式ⅰ表示的glp-1類(lèi)似物單體通過(guò)結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基的側(cè)鏈巰基氧化形成分子間二硫鍵的方式連接而成。二硫鍵形成方法可采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)，包括空氣氧化、谷胱甘肽、k3fe(cn)6、i2、dmso氧化法等。

本發(fā)明的實(shí)施方案中采用小鼠糖耐量試驗(yàn)，以利拉魯肽為陽(yáng)性對(duì)照藥，評(píng)價(jià)了glp-1類(lèi)似物二聚體的降血糖活性和長(zhǎng)效性。結(jié)果表明本發(fā)明提供的glp-1類(lèi)似物二聚體具有顯著的降血糖作用，體內(nèi)半衰期可以達(dá)到12-72小時(shí)以上，克服了天然glp-1半衰期短的問(wèn)題，可大幅提高臨床應(yīng)用依從性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步，本發(fā)明提供的glp-1類(lèi)似物二聚體與內(nèi)源性glp-1高度同源，可避免安全性風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，其中

圖1為實(shí)施例5中g(shù)lp-1類(lèi)似物二聚體的降血糖實(shí)驗(yàn)；

圖2為實(shí)施例6中g(shù)lp-1類(lèi)似物二聚體的降血糖實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。本實(shí)施例僅為解釋本發(fā)明，不意味以任何方式限制本發(fā)明內(nèi)容。

實(shí)施例1

a.glp-1類(lèi)似物單體的制備：

1)合成：采用fmoc法，按照如下步驟逐步合成方法實(shí)施：

a)在活化劑系統(tǒng)存在下由氨基樹(shù)脂固相載體和fmoc保護(hù)的精氨酸偶聯(lián)得到fmoc-精氨酸-樹(shù)脂；

b)通過(guò)固相合成法按照肽序列氨基酸順序連接氨基酸，得到n-端fmoc-保護(hù)和側(cè)鏈保護(hù)的肽－樹(shù)脂偶聯(lián)物；帶側(cè)鏈氨基酸采取如下保護(hù)措施：色氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酸用otbu(氧叔丁基)，賴(lài)氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酰胺用trt(三苯甲基)，酪氨酸用tbu(叔丁基)，絲氨酸用trt(三苯甲基)或tbu(叔丁基)，天冬氨酸用otbu(氧叔丁基)，蘇氨酸用tbu(叔丁基)，組氨酸用trt(三苯甲基)或boc(叔丁氧羰基)保護(hù)。

c)裂解，同時(shí)脫除保護(hù)基和樹(shù)脂，得到glp-1類(lèi)似物單體的粗品；

2)純化：將步驟c)中的粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，采用制備型hplc法，c18色譜柱，乙腈－水－三氟乙酸系統(tǒng)分離純化，濃縮，凍干，得glp-1類(lèi)似物單體。

b.glp-1類(lèi)似物二聚體的制備：

將glp-1類(lèi)似物單體以適當(dāng)濃度(1.5-2mmol/l)溶解于去離子水中，根據(jù)碳酸氫銨法或dmso法形成二聚體，純化，得到glp-1類(lèi)似物二聚體純品。

通過(guò)上述方法得到由以下序列單體形成的二聚體：

seqidno1與seqidno1形成的glp-1類(lèi)似物二聚體1-1，

seqidno5與seqidno5形成的glp-1類(lèi)似物二聚體5-5，

seqidno9與seqidno9形成的glp-1類(lèi)似物二聚體9-9，

seqidno15與seqidno15形成的glp-1類(lèi)似物二聚體15-15，

seqidno18與seqidno18形成的glp-1類(lèi)似物二聚體18-18，

seqidno22與seqidno22形成的glp-1類(lèi)似物二聚體22-22。

實(shí)施例2

a.glp-1類(lèi)似物單體的制備：

1)合成：采用fmoc法，按照如下步驟逐步合成方法實(shí)施：

a)在活化劑系統(tǒng)存在下由氨基樹(shù)脂固相載體和fmoc保護(hù)的甘氨酸偶聯(lián)得到fmoc-gly-樹(shù)脂；

b)通過(guò)固相合成法按照肽序列氨基酸順序連接氨基酸，得到n-端fmoc-保護(hù)和側(cè)鏈保護(hù)的肽－樹(shù)脂偶聯(lián)物；帶側(cè)鏈氨基酸采取如下保護(hù)措施：色氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酸用otbu(氧叔丁基)，賴(lài)氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酰胺用trt(三苯甲基)，酪氨酸用tbu(叔丁基)，絲氨酸用trt(三苯甲基)或tbu(叔丁基)，天冬氨酸用otbu(氧叔丁基)，蘇氨酸用tbu(叔丁基)，組氨酸用trt(三苯甲基)或boc(叔丁氧羰基)保護(hù)。

c)裂解，同時(shí)脫除保護(hù)基和樹(shù)脂，得到glp-1類(lèi)似物單體的粗品；

2)純化：將步驟c)中的粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，采用制備型hplc法，c18色譜柱，乙腈－水－三氟乙酸系統(tǒng)分離純化，濃縮，凍干，得glp-1類(lèi)似物單體。

b.glp-1類(lèi)似物二聚體的制備：

將glp-1類(lèi)似物單體以適當(dāng)濃度(1.5-2mmol/l)溶解于去離子水中，根據(jù)碳酸氫銨法或dmso法形成二聚體，純化，得到glp-1類(lèi)似物二聚體純品。

通過(guò)上述方法得到由以下序列單體形成的二聚體：

seqidno2與seqidno2形成的glp-1類(lèi)似物二聚體2-2，

seqidno7與seqidno7形成的glp-1類(lèi)似物二聚體7-7，

seqidno10與seqidno10形成的glp-1類(lèi)似物二聚體10-10，

seqidno13與seqidno13形成的glp-1類(lèi)似物二聚體13-13,

seqidno20與seqidno20形成的glp-1類(lèi)似物二聚體20-20，

seqidno24與seqidno24形成的glp-1類(lèi)似物二聚體24-24。

實(shí)施例3

a.glp-1類(lèi)似物單體的制備：

1)合成：采用fmoc法，按照如下步驟逐步合成方法實(shí)施：

a)在活化劑系統(tǒng)存在下由樹(shù)脂固相載體和fmoc保護(hù)的丙氨酸偶聯(lián)得到fmoc-ala-樹(shù)脂；

b)通過(guò)固相合成法按照肽序列氨基酸順序連接氨基酸，得到n-端fmoc-保護(hù)和側(cè)鏈保護(hù)的肽－樹(shù)脂偶聯(lián)物；帶側(cè)鏈氨基酸采取如下保護(hù)措施：色氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酸用otbu(氧叔丁基)，賴(lài)氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酰胺用trt(三苯甲基)，酪氨酸用tbu(叔丁基)，絲氨酸用trt(三苯甲基)或tbu(叔丁基)，天冬氨酸用otbu(氧叔丁基)，蘇氨酸用tbu(叔丁基)，組氨酸用trt(三苯甲基)或boc(叔丁氧羰基)保護(hù)。

c)裂解，同時(shí)脫除保護(hù)基和樹(shù)脂，得到glp-1類(lèi)似物單體的粗品；

2)純化：將步驟c)中的粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，采用制備型hplc法，c18色譜柱，乙腈－水－三氟乙酸系統(tǒng)分離純化，濃縮，凍干，得glp-1類(lèi)似物單體。

b.glp-1類(lèi)似物二聚體的制備：

將glp-1類(lèi)似物單體以適當(dāng)濃度(1.5-2mmol/l)溶解于去離子水中，根據(jù)碳酸氫銨法或dmso法形成二聚體，純化，得到glp-1類(lèi)似物二聚體純品。

通過(guò)上述方法得到由以下序列單體形成的二聚體：

seqidno8與seqidno8形成的glp-1類(lèi)似物二聚體8-8，

seqidno12與seqidno12形成的glp-1類(lèi)似物二聚體12-12，

seqidno14與seqidno14形成的glp-1類(lèi)似物二聚體14-14，

seqidno17與seqidno17形成的glp-1類(lèi)似物二聚體17-17，

seqidno21與seqidno21形成的glp-1類(lèi)似物二聚體21-21。

實(shí)施例4

a.glp-1類(lèi)似物單體的制備：

1)合成：采用fmoc法，按照如下步驟逐步合成方法實(shí)施：

a)在活化劑系統(tǒng)存在下由樹(shù)脂固相載體和fmoc保護(hù)的甘氨酸偶聯(lián)得到fmoc-gly-樹(shù)脂；

b)通過(guò)固相合成法按照肽序列氨基酸順序連接氨基酸，得到n-端fmoc-保護(hù)和側(cè)鏈保護(hù)的肽－樹(shù)脂偶聯(lián)物；帶側(cè)鏈氨基酸采取如下保護(hù)措施：色氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酸用otbu(氧叔丁基)，賴(lài)氨酸用boc(叔丁氧羰基)，谷氨酰胺用trt(三苯甲基)，酪氨酸用tbu(叔丁基)，絲氨酸用trt(三苯甲基)或tbu(叔丁基)，天冬氨酸用otbu(氧叔丁基)，蘇氨酸用tbu(叔丁基)，組氨酸用trt(三苯甲基)或boc(叔丁氧羰基)保護(hù)。

c)裂解，同時(shí)脫除保護(hù)基和樹(shù)脂，得到glp-1類(lèi)似物單體的粗品；

2)純化：將步驟c)中的粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，采用制備型hplc法，c18色譜柱，乙腈－水－三氟乙酸系統(tǒng)分離純化，濃縮，凍干，得glp-1類(lèi)似物單體。

b.glp-1類(lèi)似物二聚體的制備：

將glp-1類(lèi)似物單體以適當(dāng)濃度(1.5-2mmol/l)溶解于去離子水中，根據(jù)碳酸氫銨法或dmso法形成二聚體，純化，得到glp-1類(lèi)似物二聚體純品。

通過(guò)上述方法得到由以下序列單體形成的二聚體：

seqidno3與seqidno3形成的glp-1類(lèi)似物二聚體3-3，

seqidno4與seqidno4形成的glp-1類(lèi)似物二聚體4-4，

seqidno6與seqidno6形成的glp-1類(lèi)似物二聚體6-6，

seqidno11與seqidno11形成的glp-1類(lèi)似物二聚體11-11，

seqidno16與seqidno16形成的glp-1類(lèi)似物二聚體16-16，

seqidno19與seqidno19形成的glp-1類(lèi)似物二聚體19-19，

seqidno23與seqidno23形成的glp-1類(lèi)似物二聚體23-23。

實(shí)施例5

glp-1類(lèi)似物二聚體5-5、9-9、13-13、20-20的降血糖作用的評(píng)價(jià)。

采用正常小鼠糖耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)本發(fā)明glp-1類(lèi)似物二聚體的降血糖作用。方法：正常小鼠30只(購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分成6組(空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照、試驗(yàn)組)，每組5只；稱(chēng)取適量glp-1類(lèi)似物二聚體純品(≥98％)溶于生理鹽水，配制成0.1mg/ml的樣品溶液。試驗(yàn)組小鼠，每只皮下注射200μl樣品溶液；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠，每只皮下注射20μg利拉魯肽；空白對(duì)照組小鼠，每只皮下注射200μl生理鹽水。分別測(cè)定注射后4、24、48、72、120小時(shí)的糖耐量。糖耐量試驗(yàn)：經(jīng)口給予葡萄糖2g/kg，測(cè)定15、30、60min的血糖值，計(jì)算血糖值auc(mg/dl.min)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，受試樣品在給藥4hr顯示與陽(yáng)性對(duì)照藥同等強(qiáng)度的降糖作用，陽(yáng)性對(duì)照藥24hr后無(wú)效，但受試藥在給藥后96hr仍有效，說(shuō)明其體內(nèi)半衰期顯著延長(zhǎng)。

實(shí)施例6

根據(jù)如實(shí)施例5相同的方法評(píng)估glp-1類(lèi)似物二聚體8-8、11-11、17-17、21-21的降血糖作用，陽(yáng)性藥選用本課題組專(zhuān)利多肽(haegtftsdvssylegcaakefiaw)二聚體，結(jié)果見(jiàn)圖2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，受試樣品在給藥4hr顯示與陽(yáng)性對(duì)照藥同等強(qiáng)度的降糖作用，陽(yáng)性對(duì)照藥24hr后無(wú)效，受試藥在給藥后96hr仍有效，其中二聚體11-11和17-17作用尤為顯著。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。