本發(fā)明涉及抗菌肽及其應(yīng)用，具體地說，涉及海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌肽是由生物有機(jī)體產(chǎn)生的前體經(jīng)蛋白酶降解形成的具有生物學(xué)活性的小分子多肽，主要構(gòu)成了機(jī)體防御的第一道防線(zasloff，antimicrobialpeptidesofmulticellularorganisms.nature，2002，415：389-395)?？咕膶?xì)菌的作用機(jī)制主要是以膜作為靶位點(diǎn)，通過靜電力和受體介導(dǎo)的細(xì)胞膜作用力，引起膜通透性改變，降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，或插入細(xì)胞膜中形成跨膜的孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用機(jī)制，使其不易產(chǎn)生耐藥性，并且對許多臨床耐藥菌同樣具有殺菌作用。因此，抗菌肽被認(rèn)為可以替代傳統(tǒng)抗生素，應(yīng)用于飼料添加劑、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品防腐等領(lǐng)域。

雖然天然抗菌肽具有普遍的優(yōu)點(diǎn)，但也存在著某些明顯的不足，例如，部分抗菌肽活性相對較低，臨床應(yīng)用中對真核細(xì)胞具有強(qiáng)毒性、選擇性差，對真核生物體內(nèi)的正常菌群起到一定的殺傷作用，造成代謝的紊亂，這些都是限制抗菌肽發(fā)展的瓶頸。因此，以抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)方法，對現(xiàn)有抗菌肽進(jìn)行全新設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)改造，以期獲得高抗菌活性、低毒性的抗菌肽衍生物。

arenicin是海洋無脊椎動物海蚯蚓體內(nèi)的一種具有β-折疊構(gòu)象的抗菌肽，它結(jié)構(gòu)簡單，具有廣譜抗菌活性，可以抑制多種革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌，并且能夠有效抑制耐藥性大腸桿菌引起的尿路感染。但是在其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用中由于溶血性和細(xì)胞毒性而受到制約。因此，通過對抗菌肽的設(shè)計(jì)改造，保持高的抑菌活性，同時(shí)能夠顯著地降低溶血活性和細(xì)胞毒性，是本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高抗菌活性、極低細(xì)胞毒性和低溶血性的海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，發(fā)明人通過對抗菌肽nz17074分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，用丙氨酸(a)替代海蚯蚓抗菌肽nz17074氨基酸序列中第1和12位的甘氨酸(g)，得到一個(gè)突變體抗菌肽n2。突變體n2由21個(gè)氨基酸組成，分子量為2570da，等電點(diǎn)為9.38。該突變體保持了與母體肽相似的殺菌活性的同時(shí)，顯著降低了溶血性以及細(xì)胞毒性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2，氨基酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明還提供編碼所述衍生肽的基因，核苷酸序列如seqidno:2所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因、表達(dá)盒的載體。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因、表達(dá)盒、載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或工程菌。

本發(fā)明還提供所述衍生肽在制備治療革蘭氏陰性菌感染的抗菌藥物或組合物中的應(yīng)用。所述革蘭氏陰性菌包括但不限于大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌。

本發(fā)明還提供所述衍生肽在制備抗內(nèi)毒素血癥藥物或組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由所述衍生肽制備的治療革蘭氏陰性菌感染的抗菌藥物或組合物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供由所述衍生肽制備的抗內(nèi)毒素血癥藥物或組合物。

本發(fā)明的抗菌肽n2對革蘭氏陰性菌具有很好的殺菌效果，并且顯著降低了對小鼠紅細(xì)胞的溶血活性以及對鼠源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。小鼠毒血癥模型試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽n2還具有抗內(nèi)毒素血癥作用，能夠顯著提高小鼠的存活率，并且優(yōu)于抗生素多黏菌素?？咕膎2分子量小，易于人工合成，是極具應(yīng)用價(jià)值的小分子多肽，可用于制備新型抗菌抗感染藥物等，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2的溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2對毒血癥小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽對毒血癥小鼠肺組織的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，①：lps注射組，30mg/kg；②：空白對照；③：5mg/kgn2治療組；④：7.5mg/kgn2治療組；⑤：15mg/kg粘桿菌素治療組。圖中，t:氣道；v:血管；a：肺泡；1：氣道上皮增生；2：氣道基底膜增厚及出現(xiàn)明顯的纖維化；3：大部分肺泡細(xì)胞出現(xiàn)塌陷與融合現(xiàn)象；4：氣道與血管周圍的肺泡細(xì)胞內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2的設(shè)計(jì)與合成

1、以nz17074母體肽序列為基礎(chǔ)，通過替換和增減氨基酸殘基，通過適當(dāng)增加抗菌肽疏水性和改變二硫鍵對數(shù)進(jìn)行多肽的改造，最終確定了一個(gè)突變體抗菌肽n2，試圖提高抗菌肽對革蘭氏陰性菌的抑菌活性，抗菌肽n2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示，氨基酸序列如seqidno:1所示。

2、抗菌肽合成采用固相合成法，通過十二通道半自動多肽合成儀進(jìn)行合成。反向高效液相色譜c18柱測定合成肽純度(>90％)，esi-ms質(zhì)譜確認(rèn)衍生肽n2和n6的分子量。

實(shí)施例2海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2的抑菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例中的病原菌來自于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(cvcc)，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)以及中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)，具體菌株如表1所示。

衍生肽的最小抑菌濃度(mic，minimuminhibitoryconcentration)的測定參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(clsi，clinicalandlaboratorystandardsinstitute)制定的方法(wiegand等，agarandbrothdilutionmethodstodeterminetheminimalinhibitoryconcentration(mic)ofantimicrobialsubstances.natureprotocols,2008,3(2):163-175)，根據(jù)具體情況略有改動，操作細(xì)節(jié)如下：

將受試菌株的單菌落挑至mh液體培養(yǎng)基中，37℃250rpm振蕩過夜培養(yǎng)活化后，轉(zhuǎn)接至mh液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(od600nm＝0.4～0.6)，然后制備成10⁵cfu/ml的菌液，加入96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔90μl。

用pbs通過2倍倍比稀釋法對nz17074及其衍生肽進(jìn)行稀釋，每孔10μl抗菌肽，使其終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/ml，陰性對照組為pbs代替抗菌肽的受試菌液，空白對照組為無菌mh培養(yǎng)基。每個(gè)處理做三個(gè)平行樣。

將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育16～18h，直至陰性對照孔出現(xiàn)肉眼可見的明顯渾濁菌液，能夠完全抑制細(xì)菌生長的最低濃度即為抗菌肽對受試菌株的mic值。如果出現(xiàn)跳孔或平行樣間結(jié)果不一致的情況，則重新測試。

結(jié)果如表1所示，抗菌肽對各革蘭氏陰性菌種均體現(xiàn)出不同程度的較好抑菌效果。

表1海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽的mic值測定

實(shí)施例3海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2的細(xì)胞毒性研究

1、溶血性測定

溶血性是衡量抗菌肽是否適用于靜脈注射治療的重要指標(biāo)，具體操作如下：

取6周齡spf級的icr雌鼠，眼球取血，使用肝素鈉抗凝管收集。采集的血液于4℃，1500rpm離心10min，用10mmpbs(ph7.3)重復(fù)洗滌紅細(xì)胞三次，至上清無色透明，制成8％的紅細(xì)胞懸浮液。

將樣品肽溶解于無菌0.9％生理鹽水中，配制成濃度為512μg/ml的母液，2倍倍比稀釋至終濃度為1μg/ml。各取100μl紅細(xì)胞懸浮液和抗菌肽溶液加入到96孔板中，紅細(xì)胞終濃度為4％。

將混合液至于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置孵育，1h后，4℃，1500rpm離心5min，將上清吸取至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在540nm下檢測紫外吸光值。在相同條件下測定生理鹽水和0.1％tritonx-100，分別為0％和100％溶血對照實(shí)驗(yàn)。溶血程度計(jì)算公式如下：

溶血度(％)＝[(abs540nm抗菌肽－abs540nm生理鹽水)/(abs540nm0.1％tritonx-100－abs540nm生理鹽水)]×100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示?？咕膎2在256μg/ml濃度下溶血率為3.8％，具有極低的溶血性，不易引起哺乳動物紅細(xì)胞破裂溶解而產(chǎn)生傷害，因此十分有利于在醫(yī)藥領(lǐng)域中進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。

2、mtt細(xì)胞毒性試驗(yàn)

通過對鼠源腹腔巨噬細(xì)胞raw264.7存活率的影響來評價(jià)衍生肽對哺乳動物免疫細(xì)胞的毒害程度。

將raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，在37℃，5％co2及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長到對數(shù)期，用0.25％胰酶消化單層細(xì)胞；用含10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5×l0⁴個(gè)/ml密度接種于96孔板中，每孔100μl；設(shè)置3～5個(gè)副孔，放入co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后移除培養(yǎng)基。

用pbs清洗兩遍后，每孔按濃度梯度加入100μl濃度為2、4、8、16、32、64、256μg/ml樣品肽，同時(shí)以加細(xì)胞而不加抗菌肽的孔為陽性對照，不加抗菌肽和細(xì)胞的孔為陰性對照。將細(xì)胞繼續(xù)孵育24h后，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，用pbs洗兩遍，每孔中加入20μl濃度為5mg/ml的mtt(mtt操作需避光進(jìn)行)，然后放到培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。輕輕吸棄mtt液，加入150μldmso，微量振蕩器振蕩10min后，待孔底結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀570nm波長處測各孔吸光度(od值)。根據(jù)下面公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)(ir)：

存活率(％)＝od加藥/od陰性×100％

測定結(jié)果如圖2所示?？咕膶aw264.7細(xì)胞的存活無影響，在抗菌肽濃度為2～128μg/ml的范圍內(nèi)，細(xì)胞的存活率都維持在90％以上，說明抗菌肽對動物真核細(xì)胞無細(xì)胞毒副作用，能夠很好地區(qū)分哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。

實(shí)施例4海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽對lps引起的小鼠毒血癥的治療效果

1、毒血癥模型的建立

8周齡spf級c57bl/6雄鼠10只，體重20g左右，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司。用pbs配制30mg/kg來源于e.coli0111:b4的lps(脂多糖)，進(jìn)行腹腔注射。模型組動物12h內(nèi)均呈現(xiàn)相應(yīng)病態(tài)，蜷縮少動，精神萎靡，48h全部死亡，確定建模成功。

2、給藥及治療情況

將小鼠隨機(jī)分組給藥治療，每組6只小鼠，共分六組：①未攻毒組ck；②生理鹽水治療組；③10mg/kg粘桿菌素陽性對照組；④15mg/kg粘桿菌素陽性對照組；⑤2.5mg/kg衍生肽n2；⑥5mg/kg衍生肽n2。小鼠用lps攻毒30min后，進(jìn)行腹腔注射治療，每只小鼠200μl。8h后再次進(jìn)行治療，連續(xù)觀察7天，記錄小鼠存活率。

小鼠存活率如圖3所示。陽性對照組和抗菌肽組均能有效提高小鼠存活率，僅5mg/kg的抗菌肽n2對毒血癥小鼠保護(hù)率即達(dá)100％，治療效果明顯高于同濃度的陽性對照組。

3、肺組織切片的觀察

取上述未治療以及治療存活組小鼠的肺組織置于4％多聚甲醛中過夜固定。水沖洗后進(jìn)行脫水包埋，將凝固的蠟塊進(jìn)行切片粘附于載玻片上，再次脫水后進(jìn)行蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度脫水后，中性樹膠封片，置于35～38℃烘干，即可對肺組織切片進(jìn)行觀察。

觀察結(jié)果如圖4所示，空白對照組小鼠肺組織的肺泡、血管和氣道組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完整，注射了lps的感染組小鼠在肺泡、血管和氣道等處均發(fā)生了顯著的病變。衍生肽n2治療組對lps引起的病癥現(xiàn)象均有所緩解，當(dāng)治療劑量為7.5mg/kg時(shí)，肺組織病變幾乎完全消失，恢復(fù)到正常肺組織形態(tài)，說明抗菌肽n2能有效改善小鼠的病變組織，治療效果優(yōu)于相同劑量的粘桿菌素。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京生泰云科技有限公司

<120>海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2及其應(yīng)用

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